A eficácia e segurança da pinocembrina em um modelo ovino de fibrose pulmonar induzida por bleomicina

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Abstrato

O primárioflavonóide, pinocembrin, é pensado para ter uma variedade de usos médicos que se relacionam com seu antioxidante relatado,anti-inflamatório, propriedades antimicrobianas e anticancerígenas. Alguns estudos relataram que este flavonóide possui atividades antifibróticas. Neste estudo, investigamos se a pinocembrina impediria a fibrose, diminuiria a inflamação e melhorariapulmãofunção em um grande modelo animal de fibrose pulmonar. A fibrose foi induzida em dois segmentos pulmonares localizados em cada uma das 10 ovelhas participantes do estudo. Isto foi conseguido através de duas infusões de bleomicina administradas broncoscopicamente em um intervalo de duas semanas. Outro segmento pulmonar na mesma ovelha não foi tratado e foi usado como controle saudável. Os animais foram mantidos por pouco mais de 5 semanas após a infusão final de bleomicina. Pino-cembrin, isolado de folhas de eucalipto, foi administrado a um dos dois segmentos pulmonares danificados por bleomicina na dose de 7 mg. Esta dose foi administrada uma vez por semana durante 4-semanas, começando uma semana após a infusão final de bleomicina. A complacência pulmonar (como medida de rigidez) melhorou significativamente após quatro administrações semanais de pinocembrina em segmentos pulmonares danificados por bleomicina. Houve um número significativamente menor de neutrófilos e células inflamatórias no lavado broncoalveolar de segmentos pulmonares infundidos com bleomicina que foram tratados com pinocembrina. Em comparação com segmentos pulmonares danificados por bleomicina sem tratamento medicamentoso, a administração de pinocembrina foi associada a um número significativamente menor de células T CD8t e CD4+ imuno-positivas no parênquima pulmonar. Os dados de pontuação de histopatologia mostraram que o tratamento com pinocembrina foi associado a uma melhora significativa na inflamação e nos escores gerais de patologia. A análise de hidroxiprolina mostrou que a administração de pinocembrina não reduziu o aumento do conteúdo de colágeno que foi induzido pela bleomicina neste modelo. Análises de cortes corados com Tricromo de Masson mostraram que o tratamento com pinocembrina reduziu significativamente o conteúdo de tecido conjuntivo nos segmentos pulmonares expostos à bleomicina quando comparados aos pulmões infundidos com bleomicina que não receberam pinocembrina. Os impressionantes efeitos anti-inflamatórios e modestos de remodelação anti-fibrótica da administração de pinocembrina provavelmente estavam ligados à capacidade do composto de melhorar a patologia pulmonar e a complacência funcional neste modelo animal de fibrose pulmonar.

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Introdução

O primárioflavonóide, pinocembrina, foi identificada e isolada de várias espécies de plantas. Acredita-se que esta molécula bioativa tenha uma variedade de usos médicos relacionados ao seu antioxidante relatado,anti-inflamatório, propriedades antimicrobianas e anticancerígenas [1-7]. É importante ressaltar que a pinocembrina demonstrou ter propriedades antifibróticas em vários modelos animais diferentes da doença. Por exemplo, a pinocembrina reduz a fibrose ventricular [8] em um modelo de depressão em ratos e diminui a fibrose atrial em um modelo de infarto do miocárdio em ratos [9]. Da mesma forma, em um modelo experimental de fibrose hepática induzida por clorofórmio em ratos, a administração oral de pinocembrina reduziu a expressão de colágeno e alfa-SMA (usado como marcador de diferenciação de miofibroblastos), como medidas de fibrose [10]. Um estudo recente demonstrou

A pinocembrina alivia a fibrose cutânea induzida pela bleomicina em camundongos e suprimiu a proliferação, migração e invasão de fibroblastos quelóides e fibroblastos dérmicos primários de camundongos in vitro [11]. A pinocembrina induziu esses efeitos antifibróticos através da regulação negativa das vias de sinalização NF-x e TGF- 1/Smad [10,11].

Dados os conhecidos efeitos antifibróticos da pinocembrina, nosso objetivo foi verificar se a pinocembrina impediria a fibrose e melhorariafunção pulmonarem um grande modelo animal de fibrose pulmonar. O modelo fisiologicamente e farmacologicamente relevante para a fibrose pulmonar foi desenvolvido como um veículo para investigar o(s) mecanismo(s) da doença subjacente(s) para a fibrose pulmonar idiopática (FPI) da condição humana [12,13]. Também tem sido útil para testar novos tratamentos contra fibrose pulmonar [14-16].

A fibrose pulmonar idiopática (FPI) é uma doença pulmonar crônica devastadora caracterizada por cicatrização pulmonar progressiva devido ao acúmulo exuberante de matriz extracelular (MEC) no parênquima pulmonar [17]. O prognóstico da FPI é muito ruim, com apenas 3-5 anos de sobrevida média dos pacientes após o diagnóstico [18]. Atualmente, os tratamentos farmacológicos disponíveis estão limitados à Pirfenidona e Nintedanib, medicamentos que demonstraram apenas retardar a progressão da doença, sem interrompê-la. Além disso, existem efeitos colaterais adversos significativos associados a essas duas drogas. Portanto, há uma necessidade não atendida de novos tratamentos eficazes para essa condição.

O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia terapêutica e segurança da pinocembrina em um modelo ovino de fibrose pulmonar induzida por bleomicina desenvolvido em nosso laboratório(12). Especificamente, um estudo foi realizado para verificar se a administração pulmonar local de pinocembrina atenuou significativamente a fibrose, inflamação e histopatologia em segmentos pulmonares específicos após a indução de fibrose com bleomicina. Importante, determinamos se a administração local de pinocembrina melhorou significativamente a função fisiológica de segmentos pulmonares específicos com fibrose induzida por bleomicina.

Materiais e métodos

Indução de fibrose em segmentos pulmonares de ovelhas

Neste estudo, usamos um total de 10 ovelhas. Induzimos fibrose em dois segmentos pulmonares de cada ovelha de maneira semelhante aos nossos estudos anteriores [12,13]. Usando este procedimento estabelecido (veja detalhes abaixo), a fibrose foi confinada a pequenas regiões isoladas nos pulmões, deixando os restantes 90-95 por cento dos pulmões saudáveis ​​não afetados para realizar a função respiratória normal.

Todas as ovelhas do estudo foram desafiadas com 2 doses únicas de bleomicina (3 unidades) por segmento pulmonar, com 2 semanas de intervalo e os animais foram mantidos por pouco mais de 5 semanas após a dose final de bleomicina O procedimento de administração envolveu a inserção de um broncoscópio nos segmentos pulmonares no pulmão direito e esquerdo e, em seguida, infundir lentamente através da porta de biópsia do broncoscópio, a bleomicina em dois segmentos, conforme mostrado na Fig 1.

O momento das infusões de bleomicina, amostragem de sangue, amostragem de lavado broncoalveolar e teste de função pulmonar e aplicação de pinocembrina são detalhados em Eig2. Todos os procedimentos experimentais em animais foram aprovados pelo comitê de ética animal da Universidade de Melbourne (número de identificação de aprovação de ética animal: 2015209.1). Esses procedimentos experimentais e cronogramas associados ao trabalho animal foram projetados para aliviar e minimizar o sofrimento das ovelhas usadas no estudo. Em particular, o número de procedimentos broncoscópicos foi reduzido ao mínimo que permitiria a interpretação bem-sucedida dos dados.

Isolamento e confirmação estrutural da pinocembrina

A pinocembrina foi purificada a partir de extratos metanólicos de folhas coletadas de Eucalyptus pressiana subsp. pressiana foram cultivadas em uma parcela experimental no campus da Universidade de Melbourne Dookie (36 graus 23'3"S,145 graus 42'52"E). As sementes compradas da Nindethana Seed Company (King River, Austrália) foram coletadas em Woodenellup, Austrália Ocidental, e as mudas foram criadas e transplantadas para a parcela conforme descrito em [19]. As folhas amostradas foram secas em um forno a 5{{40}} graus por 48 h antes de serem moídas em um pó fino usando um moinho IKA MF10 equipado com uma malha de 1 mm. O tecido moído (100 g) foi colocado em dedais de celulose Kinesis XK (Antylia Scientific, Chicago, EUA) e submetido à extração Soxhlet com 100 por cento de MeOH (200 mL) por 8 h. Os extratos de MeOH foram então concentrados para aproximadamente 50 mL usando evaporação rotativa. Alíquotas de extratos concentrados (2 mL) foram submetidas a cromatografia flash em um sistema Revelers X2 (Buchi AG, Flawil, Suíça) equipado com um cartucho FlashPure C18 RP-WP 12g (Buchi). O sistema de solvente utilizado foi um gradiente de acetonitrila (MeCN) e água de 30-100 por cento de MeCN ao longo de 5 min com um tempo de equilíbrio de 1 min (S1 Fig). A fracção contendo pinocembrina foi detectada a 283 nm e recolhida. As frações de várias corridas Flash foram reunidas, o MeCN removido por evaporação rotativa e a pinocembrina seca usando liofilização. A estrutura da pinocembrina foi confirmada via ESI-LCMS e espectroscopia de RMN conforme descrito em [19] com comparação com um padrão comercial (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA). Pinocembrina: Cristais amarelo pálido de MeCN/H, O.UVλmax MeCN（nm）∶ banda-I325 nm, banda-II289 nm. 'H NMR（600 MHz,CDCl）∶δ5,36（1H,dd,J13,0,3,0 Hz,H-2）,δ2,76（1H,dd,J17,1,3,1Hz,H{ {51}}a）,δ3,02（1H,dd,J17,1,13,1 Hz,H-3b）,δ5,92（1H,d,2,2Hz,H-6）, δ5,94（1H,d,2,2Hz,H-8）.ESI-MS（fragmentador 150V, Skimmer 65V)m/z(rel.int. percent ):255,0673([MH],100),213,0565 ([M-42-H],19), 151,0037([M-104-H],16),257,0811([M mais H],100),153,0167([M-104 mais H],2). A pureza baseada em massa da pinocembrina isolada foi quantificada em um mínimo de 96 por cento usando HPLC-PDA em comparação com um padrão comercial (S2A e S2B Fig).

Administração de pinocembrina em segmentos pulmonares de ovelhas

Para cada semana do regime de dosagem, 7 mg de pinocembrina foram infundidos em um único segmento pulmonar caudal em cada ovelha submetida ao teste (Fig 1). Este peso da dose de pinocembrina foi baseado em um estudo publicado anteriormente que mostrou que 50 mg de pinocembrina por kg de peso corporal era a dose mais eficaz para melhorar os sintomas da doença naquele modelo animal [20]. A dose de 7 mg de pinocembrina permitiu o fato de que apenas aproximadamente 150 g de segmento pulmonar por ovelha foram tratados em ~ 50 mg/kg. O bioativo foi dissolvido em DMSO a 10% e administrado uma vez por semana durante um período de quatro semanas, conforme mostrado na Fig 2. Para fins de controle, o segmento pulmonar no pulmão oposto foi usado como um controle positivo para bleomicina, sem droga , conforme indicado na Fig. 1. As moléculas bioativas no veículo foram distribuídas como infusões de 5 mL através da porta de biópsia do broncoscópio. Observe que para anular quaisquer pequenas diferenças (por exemplo, fisiológicas ou anatômicas, etc.) entre os pulmões esquerdo e direito, as infusões de pinocembrina foram randomizadas entre os segmentos pulmonares caudais esquerdo e direito. Metade dos animais (n=5 ovelhas) recebeu pinocembrina nos segmentos pulmonares caudais direito, enquanto os outros (n=5 ovelhas) receberam pinocembrina nos segmentos pulmonares caudais esquerdos. O segmento pulmonar medial direito foi deixado sem tratamento e usado para tecido de controle pulmonar saudável que foi amostrado na autópsia (Fig. 1).

Procedimentos de amostragem de lavado broncoalveolar

Para cada uma das amostras broncoalveolares (BAL) nos pontos de tempo listados na Fig2, o endoscópio foi manipulado em um segmento pulmonar específico para amostragem, geralmente passando por cerca de 3 a 4 ramos das vias aéreas. Para amostragem de LBA, 10 mL de solução salina estéril foram infundidos através da porta de biópsia do endoscópio no segmento pulmonar específico e, em seguida, recuperados em uma seringa através da mesma porta. Este procedimento recuperou entre 3 e 5 mL de líquido de LBA. O método de amostragem coletou células para análises das pequenas vias aéreas e lúmens alveolares do segmento pulmonar específico para onde o broncoscópio foi navegado. As células do LBA de cada segmento foram centrifugadas em lâminas de vidro e coradas para contagem diferencial de células inflamatórias com Hem-Quik, conforme descrito anteriormente [13].

Testes e análises da função pulmonar

A função pulmonar foi medida nos segmentos pulmonares descritos nos pontos de tempo indicados na Fig. 2. A função pulmonar foi avaliada em todos os segmentos pulmonares de teste (lobos caudais esquerdo e direito e lobo medial em cada ovelha). A capacidade funcional dos segmentos pulmonares foi medida através do endoscópio usando um procedimento publicado [12,13]. O parâmetro de função pulmonar avaliado neste estudo foi referido como complacência no segmento pulmonar (abreviado para Cseg). Em geral, a complacência é uma medida de quão fácil é inflar o pulmão. Um pulmão pouco complacente é referido como um pulmão rígido, que normalmente é mais difícil de inflar.

Amostra de sangue

O sangue total foi coletado na linha de base antes da indução da fibrose e no final do experimento antes da eutanásia dos animais experimentais, conforme indicado na Fig. 2, extraindo sangue da veia jugular para um tubo contendo heparina. O sangue foi processado para análise de contagem de células sanguíneas.

Isolamento e análise do tecido pulmonar

As ovelhas foram sacrificadas pouco mais de 5 semanas após a última dose de bleomicina (início da semana 12), conforme indicado na Fig2. A eutanásia foi induzida através de uma overdose de barbitúricos administrados por via intravenosa em ml por 2 kg de peso corporal, conforme recomendado pelo fabricante (Lethabarb, Virbac Animal Health Pty Ltd. Após a eutanásia, os pulmões foram removidos e os segmentos pulmonares alvo foram identificados e cuidadosamente dissecados livres de circunvizinhos Os segmentos individuais foram então inflados com uma mistura 1:1 de OCT (temperatura de corte ideal, Tissue-Tek) e solução de PBS estéril, sob a pressão de aproximadamente 20 cm/H, O[13]. Várias seções transversais em série do Os segmentos inflados foram fixados em formalina tamponada neutra a 10% e processados ​​em parafina para avaliação histopatológica.As fatias de pulmão restantes foram embebidas em OCT e congeladas em moldes criogênicos em barcos de alumínio flutuando em nitrogênio líquido.

Cortes de tecido embebidos em parafina (5 μm) foram corados com hematoxilina e eosina Y (H&E) para histologia geral e com coloração tricrômica de Masson para identificar alterações no conteúdo de colágeno dentro do parênquima pulmonar.

Imuno-histoquímica

A localização imuno-histoquímica dos linfócitos T CD4* e CD8 foi realizada em cortes congelados. Secções de tecido pulmonar (5 μm) foram fixadas com etanol gelado; peróxidos endógenos foram bloqueados usando solução de H, O e as seções foram então incubadas com anticorpos primários (anti CD4 de camundongo monoclonal (puro) e anti CD8 de camundongo monoclonal (puro)) em uma câmara úmida por 2 horas à temperatura ambiente. Após a incubação com anticorpos primários,

as seções foram então lavadas com PBS três vezes e incubadas com anticorpo secundário (IgG anti-rato de coelho (HRP) (ab6728)) (1:100; Abcam, Melbourne, Austrália) por 1 hora à temperatura ambiente. Para verificar a especificidade, os controles de isotipo foram incluídos durante IHCrun usando um anticorpo SBU-3 biologicamente irrelevante do mesmo isotipo. Os cortes foram contracorados com solução de hematoxilina de Mayer por 20 segundos. O complexo antígeno-anticorpo foi visualizado com 3,3'-diaminobenzidina. Por fim, os cortes foram desidratados em etanol, clarificados em xileno e montados em DPX.

Pontuação de histopatologia

A histopatologia do parênquima pulmonar foi avaliada usando um sistema de pontuação semiquantitativo conforme descrito anteriormente[12,13]. Resumidamente, as lâminas de histologia foram todas cegas para que o avaliador não conhecesse os grupos de tratamento. Para cada seção corada com H&E, 10 campos consecutivos não sobrepostos em ampliação x 200 foram classificados com base nos critérios de pontuação para fibrose, inflamação e pontuações gerais de patologia, conforme relatado anteriormente [12,13]. As áreas foram selecionadas longe de grandes vias aéreas e grandes vasos sanguíneos. As pontuações de todos os dez campos foram então calculadas em média para fornecer pontuações representativas para os parâmetros avaliados no segmento pulmonar seccionado.

A análise da concentração de proteína de colágeno pelo ensaio de hidroxiprolina foi utilizada para extrapolar o conteúdo e a concentração de colágeno de cada segmento, conforme descrito anteriormente (4,5). Resumidamente, os tecidos pulmonares congelados de cada segmento foram liofilizados até peso seco, hidrolisados ​​em HCl 6M e avaliados quanto ao teor de hidroxiprolina medindo a absorbância de amostras reconstituídas (em 0.1M HCl) a 558 nm usando um Beckman Espectrofotômetro DU-64 (Beckman Coulter Inc, Brea, CA). O teor de hidroxiprolina foi determinado a partir de uma curva padrão de trans-L-hidroxi-L-prolina (Sigma-Aldrich). O conteúdo de colágeno foi extrapolado multiplicando as medições de hidroxiprolina por 6,94 (com base na hidroxiprolina representando ~ 14,4 por cento da composição de aminoácidos do colágeno na maioria dos tecidos [21]) e, em seguida, expresso como uma proporção do peso seco do tecido para produzir a concentração de colágeno (que foi expresso em porcentagem).

A análise do conteúdo do tecido conjuntivo para avaliar o grau de fibrose foi quantificada pela avaliação das mudanças no conteúdo geral do tecido conjuntivo dentro do tecido parenquimatoso usando um método previamente descrito [13]. Para realizar esta análise, secções de parafina de tecidos de pulmão de ovelha foram coradas usando uma coloração de tricrômio de Masson que cora o tecido conjuntivo em azul. Posteriormente, imagens da seção de pulmão corada com tricrômio de Masson foram capturadas usando uma câmera digital ligada a um microscópio e computador. Dez campos foram capturados aleatoriamente sob ampliação x 400 excluindo grandes vasos sanguíneos e brônquios. As imagens foram então analisadas usando o Image-Pro Plus (Versão 6.3 para Windows, Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, EUA) usando a ferramenta seletora de cores para medir a área de tecidos manchados de azul (colágeno e outros tecidos conjuntivos) dentro de cada campo de vista. Os valores para cada uma das dez imagens foram então calculados para cada slide. A fração de área de tecido corada de azul foi expressa como uma porcentagem por área total de campo (porcentagem de área de tecido corada de azul por área total de campo). A captura e análise das imagens foram realizadas de forma cega em lâminas codificadas.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada usando GraphPad Prism for Windows Versão 5.01 (Graph-Pad Software Inc., La Jolla, CA, Estados Unidos). Os parâmetros foram avaliados para Gaussian

distribuição usando o teste de normalidade de D'Agostino e Pearson omnibus. Para dados paramétricos, testes t bicaudais pareados foram realizados para comparar entre segmentos pulmonares que receberam bleomicina apenas com segmentos de controle infundidos com solução salina e segmentos pulmonares que receberam infusão de bleomicina mais pinocembrina. Para os dados que não atendiam aos pressupostos da distribuição gaussiana, foi utilizado o teste de postos sinalizados de pares pareados de Wilcoxon. Em todos os casos, um valor de p menor que 0.05 foi definido como uma diferença significativa. Todos os valores são relatados como médias (± SEM).

Resultados

Saúde animal e segurança da administração de pinocembrina

Verificações de saúde foram realizadas rotineiramente ao longo dos períodos de tratamento e julgamento até a eutanásia. Isso foi para verificar se o tratamento com pinocembrina não causou problemas de saúde ou efeitos colaterais adversos às ovelhas submetidas ao teste. Todos os animais permaneceram saudáveis ​​durante todo o período de tratamento com pinocembrina (semana 8 a semana 12, Fig 2). Durante esse período, os animais continuaram a ganhar peso na faixa normal esperada para essas ovelhas, tiveram contagens normais de glóbulos brancos e não houve eventos adversos à saúde.

A administração de pinocembrina melhora o declínio da função pulmonar associado ao desenvolvimento de fibrose pulmonar induzida por bleomicina

A Fig3 mostra a função pulmonar dos diferentes segmentos pulmonares após tratamentos semanais com pinocembrina por quatro semanas. O parâmetro de função pulmonar medido foi complacência em segmentos pulmonares locais e é referido como complacência segmentar (Cseg). Geralmente, níveis mais baixos de complacência significam pior função no segmento pulmonar (ou seja, mais difícil de inflar e o pulmão é mais rígido). Como esperado, os segmentos pulmonares que receberam o agente prejudicial bleomicina sozinho, sem pinocembrina, apresentaram complacência segmentar média significativamente menor do que os segmentos pulmonares de controle saudáveis ​​não tratados (Fig. 3A). Os segmentos pulmonares, que receberam o agente prejudicial bleomicina com administração de pinocembrina, apresentaram maior complacência segmentar média, que não foi significativamente diferente dos segmentos pulmonares de controle saudáveis ​​não tratados (Fig. 3A). Outra avaliação da função pulmonar utilizada foi a mudança percentual na complacência desde a linha de base (Eig 3C). Isso mediu a mudança na adesão desde o início do estudo (antes dos tratamentos com bleomicina e pinocembrina) até após a conclusão do tratamento final com pinocembrina. A avaliação mostrou que a conformidade nos segmentos pulmonares tratados com pinocembrina melhorou significativamente após as administrações semanais de pinocembrina durante o período de tratamento 4-semana (Fig 3C).

A administração de pinocembrina reduz o acúmulo de células inflamatórias induzidas por bleomicina no líquido de LBA

A Fig4 mostra dados de células de LBA após tratamentos de infusão uma vez por semana com pinocembrina durante um período de tratamento de 4-semanas. As células BAL foram amostradas de segmentos pulmonares durante a semana 12 do ensaio, dois dias antes de as ovelhas serem abatidas. As contagens de células avaliadas no LBA foram apenas neutrófilos e a soma das principais células inflamatórias, que incluiu neutrófilos, eosinófilos e linfócitos. Como esperado, os segmentos pulmonares de controle saudáveis, que não foram tratados, apresentaram números relativamente baixos de células inflamatórias no líquido de LBA (Fig. 4).

Em contraste, os segmentos pulmonares lesados ​​pela bleomicina, sem pinocembrina, apresentaram números significativamente elevados de neutrófilos e outras células inflamatórias no LBA em comparação com segmentos controles saudáveis ​​(Eig 4). Os segmentos pulmonares que receberam o agente danoso bleomicina e receberam tratamentos com pinocembrina apresentaram números significativamente menores de neutrófilos e células inflamatórias quando comparados aos números de células amostradas dos segmentos pulmonares, que receberam bleomicina isolada sem pinocembrina (Fig. 4).

O efeito da pinocembrina nas células T do parênquima pulmonar

A Fig5 mostra dados de células T após quatro tratamentos de infusão com pinocembrina, administrados uma vez por semana. As células T foram avaliadas no parênquima dos segmentos pulmonares tratados diferencialmente, que foram amostrados no post-mortem (semana 12). Como esperado, os segmentos pulmonares de controle saudáveis, que não foram tratados, tinham números relativamente baixos de células T CD8t e CD4* no parênquima pulmonar (Fig. 5).

Em contraste, os segmentos pulmonares lesados ​​pela bleomicina, sem tratamento com pinocembrina, apresentaram números significativamente maiores de células T CD8 e CD4* no parênquima pulmonar em comparação com segmentos controles saudáveis ​​(Eig 5). Os segmentos pulmonares que receberam o agente nocivo bleomicina, e tiveram tratamentos com pinocembrina, apresentaram números significativamente menores de células T CD8t e CD4 plus no parênquima pulmonar quando comparados aos números de células amostradas de segmentos pulmonares, que receberam bleomicina isolada sem pinocembrina (Eig 5 ).

cada parâmetro testado (Eig⑥). É importante ressaltar que os segmentos pulmonares, que receberam o agente injuriante bleomicina, e receberam tratamento com pinocembrina, apresentaram escores médios mais baixos para cada parâmetro avaliado (Eig ⑥). O tratamento com pinocembrina reduziu significativamente a inflamação e os escores gerais de patologia em comparação com os segmentos que receberam apenas infusão de bleomicina (Fig. 6). Enquanto os segmentos pulmonares que receberam infusão de bleomicina e pinocembrina apresentaram escores de fibrose mais baixos em comparação aos segmentos que receberam apenas infusão de bleomicina, a diferença não foi estatisticamente significativa (Fig. 6).

Os efeitos da pinocembrina no conteúdo do tecido conjuntivo

Observações microscópicas das seções coradas com tricrômio de Masson mostraram que o tratamento com pinocembrina reduziu a quantidade de tecido conjuntivo induzida pela infusão de bleomicina (Fig7A). EigZB mostra dados para a porcentagem de área de tecido conjuntivo corada com tricrômio de Masson após quatro tratamentos semanais com pinocembrina. Os dados na Fig 7B mostraram que o tratamento com pinocembrina reduziu significativamente a porcentagem de coloração azul em segmentos pulmonares expostos à bleomicina quando comparado ao pulmão infundido com bleomicina que não recebeu tratamento com pinocembrina (Fig 7B). A Fig ZC mostra os dados para o ensaio de hidroxiprolina para o conteúdo de colágeno após quatro tratamentos semanais com pinocembrina. Os dados na Fig 7C foram coletados de todos os 10 animais no estudo e mostraram que a infusão de bleomicina sozinha (sem pinocembrina) aumentou significativamente a concentração de proteína de colágeno em comparação com as respectivas medições de segmentos de controle de pulmão saudável, que não receberam bleomicina ou pinocembrina. A administração de pinocembrina, no entanto, não reduziu o aumento induzido pela bleomicina na concentração de colágeno (Fig. 7C).

Discussão

Este estudo fez uso de um modelo ovino fisiologicamente e farmacologicamente relevante para fibrose pulmonar [12,13] para verificar a eficácia da pinocembrina. No geral, descobrimos que o tratamento com pinocembrina foi eficaz na melhora da patologia pulmonar induzida experimentalmente e não causou efeitos adversos à saúde em todas as dez ovelhas submetidas ao teste.

cada parâmetro testado (Fig⑥). É importante ressaltar que os segmentos pulmonares, que receberam o agente injuriante bleomicina, e receberam tratamento com pinocembrina, apresentaram escores médios mais baixos para cada parâmetro avaliado (Eig ⑥). O tratamento com pinocembrina reduziu significativamente a inflamação e os escores gerais de patologia em comparação com os segmentos que receberam apenas infusão de bleomicina (Fig. 6). Enquanto os segmentos pulmonares que receberam infusão de bleomicina e pinocembrina apresentaram escores de fibrose mais baixos em comparação aos segmentos que receberam apenas infusão de bleomicina, a diferença não foi estatisticamente significativa (Fig. 6).

Os efeitos da pinocembrina no conteúdo do tecido conjuntivo

Observações microscópicas das seções coradas com tricrômio de Masson mostraram que o tratamento com pinocembrina reduziu a quantidade de tecido conjuntivo induzida pela infusão de bleomicina (Fig7A). EigZB mostra dados para a porcentagem de área de tecido conjuntivo corada com tricrômio de Masson após quatro tratamentos semanais com pinocembrina. Os dados na Fig 7B mostraram que o tratamento com pinocembrina reduziu significativamente a porcentagem de coloração azul em segmentos pulmonares expostos à bleomicina quando comparado ao pulmão infundido com bleomicina que não recebeu tratamento com pinocembrina (Fig 7B). A Fig ZC mostra os dados para o ensaio de hidroxiprolina para o conteúdo de colágeno após quatro tratamentos semanais com pinocembrina. Os dados na Fig 7C foram coletados de todos os 10 animais no estudo e mostraram que a infusão de bleomicina sozinha (sem pinocembrina) aumentou significativamente a concentração de proteína de colágeno em comparação com as respectivas medições de segmentos de controle de pulmão saudável, que não receberam bleomicina ou pinocembrina. A administração de pinocembrina, no entanto, não reduziu o aumento induzido pela bleomicina na concentração de colágeno (Fig. 7C).

Discussão

Este estudo fez uso de um modelo ovino fisiologicamente e farmacologicamente relevante para fibrose pulmonar [12,13] para verificar a eficácia da pinocembrina. No geral, descobrimos que o tratamento com pinocembrina foi eficaz na melhora da patologia pulmonar induzida experimentalmente e não causou efeitos adversos à saúde em todas as dez ovelhas submetidas ao teste.

Os efeitos da pinocembrina na histopatologia

Eig6 mostra dados de pontuação de histopatologia após quatro tratamentos uma vez por semana com pinocembrina. Os parâmetros histopatológicos pontuados foram inflamação, fibrose e patologia geral. Como esperado para um pulmão normal e saudável, os segmentos pulmonares de controle que não foram tratados tiveram pontuações baixas para cada parâmetro patológico avaliado (Fig. 6). Em contraste, os segmentos pulmonares lesados ​​pela bleomicina, sem tratamento com pinocembrina, apresentaram escores médios significativamente altos para

cada parâmetro testado (Eig⑥). É importante ressaltar que os segmentos pulmonares, que receberam o agente injuriante bleomicina, e receberam tratamento com pinocembrina, apresentaram escores médios mais baixos para cada parâmetro avaliado (Eig ⑥). O tratamento com pinocembrina reduziu significativamente a inflamação e os escores gerais de patologia em comparação com os segmentos que receberam apenas infusão de bleomicina (Fig. 6). Enquanto os segmentos pulmonares que receberam infusão de bleomicina e pinocembrina apresentaram escores de fibrose mais baixos em comparação aos segmentos que receberam apenas infusão de bleomicina, a diferença não foi estatisticamente significativa (Fig. 6).

Os efeitos da pinocembrina no conteúdo do tecido conjuntivo

Observações microscópicas das seções coradas com tricrômio de Masson mostraram que o tratamento com pinocembrina reduziu a quantidade de tecido conjuntivo induzida pela infusão de bleomicina (Fig7A). EigZB mostra dados para a porcentagem de área de tecido conjuntivo corada com tricrômio de Masson após quatro tratamentos semanais com pinocembrina. Os dados na Fig 7B mostraram que o tratamento com pinocembrina reduziu significativamente a porcentagem de coloração azul em segmentos pulmonares expostos à bleomicina quando comparado ao pulmão infundido com bleomicina que não recebeu tratamento com pinocembrina (Fig 7B). A Fig ZC mostra os dados para o ensaio de hidroxiprolina para o conteúdo de colágeno após quatro tratamentos semanais com pinocembrina. Os dados na Fig 7C foram coletados de todos os 10 animais no estudo e mostraram que a infusão de bleomicina sozinha (sem pinocembrina) aumentou significativamente a concentração de proteína de colágeno em comparação com as respectivas medições de segmentos de controle de pulmão saudável, que não receberam bleomicina ou pinocembrina. A administração de pinocembrina, no entanto, não reduziu o aumento induzido pela bleomicina na concentração de colágeno (Fig. 7C).

A eficácia da pinocembrina para melhorar vários parâmetros da doença em um modelo ovino de doença pulmonar experimental

No presente estudo, descobrimos que a pinocembrina foi capaz de melhorar vários parâmetros da doença no modelo ovino de fibrose pulmonar. Nossos principais achados foram que a administração de pinocembrina foi capaz de melhorar a função pulmonar, atenuar a inflamação pulmonar e diminuir os escores gerais da patologia, que foram induzidos pela lesão da bleomicina. É importante ressaltar que as análises estatísticas dos dados revelaram que essas leituras da doença foram significativamente melhoradas nos segmentos pulmonares tratados com pinocembrina quando comparados com os dados correspondentes dos segmentos pulmonares não tratados e feridos por bleomicina.

No modelo de ovelha de fibrose pulmonar induzida por bleomicina, a lesão de bleomicina causa perda de complacência pulmonar localizada (uma medida de rigidez pulmonar) em segmentos pulmonares infundidos com bleomicina [12-14,16,22,23]. No estudo atual , descobrimos que o tratamento com pinocembrina melhorou significativamente a complacência funcional nos segmentos pulmonares lesados ​​pela bleomicina. Isso demonstrou que o tratamento com pinocembrina em segmentos pulmonares lesionados resultou em que esses segmentos funcionassem em níveis mais altos do que se não fossem tratados.

No presente estudo, a identificação de células inflamatórias do lavado pulmonar recuperadas de segmentos pulmonares mostrou que o tratamento com pinocembrina reduziu significativamente o número de células inflamatórias que ocupam os espaços liminares dos alvéolos e pequenas vias aéreas. O principal tipo de célula inflamatória que foi reduzido no líquido de lavagem pulmonar foram os neutrófilos, que caíram de 7,4% do total de células BAL nos segmentos pulmonares com bleomicina sem tratamento com drogas para 3,7% nos segmentos pulmonares lesados ​​por bleomicina tratados com pinocembrina. A redução associada à pinocembrina em células T CD4 e CD8 no parênquima pulmonar foi inteiramente consistente com a redução de células inflamatórias recuperadas do fluido de lavagem pulmonar de segmentos pulmonares expostos à pinocembrina e bleomicina. As células T CD4 e CD8 plus são componentes importantes nos braços celulares de muitas respostas imunes. No geral, esses dados apoiam a noção de que a pinocembrina tinha fortes propriedades anti-inflamatórias no modelo de doença estudado.

Em termos de escores histopatológicos, os escores médios de inflamação e patologia geral foram melhorados nos segmentos pulmonares lesionados após o tratamento com pinocembrina. É importante ressaltar que essas leituras foram estatisticamente menores nos pulmões danificados tratados com pinocembrina, em comparação com os pulmões danificados experimentalmente sem tratamento com pinocembrina. Enquanto os escores médios de patologia de fibrose foram menores nos pulmões danificados tratados com pinocembrina, em comparação com o pulmão lesado experimentalmente sem tratamento com pinocembrina, estes não atingiram significância estatística.

Como os dados da pontuação da patologia da fibrose não eram definitivos para a pinocembrina, o ensaio de hidroxiprolina foi realizado em amostras de tecido dos segmentos pulmonares tratados diferencialmente. O ensaio de hidroxiprolina mede o nível de colágeno em uma amostra de proteína e é uma medida de leitura padrão-ouro para quantificar os níveis de fibrose nos tecidos. Este ensaio mostrou que a pinocembrina não reduziu a deposição de colágeno extracelular associada à lesão da bleomicina. O ensaio tricrômico de Masson (outra medida de leitura que é frequentemente usada para avaliar a extensão da fibrose) mostrou que a porcentagem de coloração azul (ou seja, uma medida do conteúdo de tecido conjuntivo) foi significativamente menor em seções pulmonares expostas à bleomicina e tratadas com pinocembrina quando comparadas às expostas à bleomicina secções pulmonares que não receberam tratamentos medicamentosos. Em conjunto, os dados dos ensaios de hidroxiprolina e tricrômio de Masson sugeriram que a pinocembrina tinha a capacidade de reduzir algumas proteínas da matriz extracelular (mostradas pelos dados de tricrômio de Masson), mas não necessariamente colágeno (conforme corroborado pelos dados de hidroxiprolina). No geral, os dados dos escores de fibrose, tricrômio de Masson e ensaios de hidroxiprolina sugeriram que a pinocembrina tinha apenas propriedades antifibróticas e anti-remodelação modestas.

Foi demonstrado anteriormente que muitos compostos bioativos têm propriedades anti-inflamatórias e anti-fibróticas através da modulação de vários biomarcadores pró-fibróticos e pró-inflamatórios, como TNF, TGF-endotelina-1, IFN-y, interleucinas, VEGF, FGF -2, PDGF MMP-9, TIMPs, NF-kB e colágeno-I [24]. Além disso, descobriu-se que a administração de compostos anti-inflamatórios a modelos de camundongos de fibrose pulmonar infundidos com bleomicina muitas vezes resultou em uma redução da patologia fibrótica. Isso ocorreu especialmente se as moléculas anti-inflamatórias foram aplicadas precocemente após a exposição à bleomicina durante o estágio inflamatório (pró-fibrótico) da patologia nesses modelos [25]. É importante ressaltar que, quando muitas dessas moléculas anti-inflamatórias foram testadas na clínica para tratar condições fibróticas, elas se mostraram ineficazes [25]. a pinocembrina também inibiu as citocinas pró-inflamatórias TNF-c, IL-1 e IL-6 e amorteceu as respostas inflamatórias através da depressão da via de sinalização NF-K 9, 10. Outros estudos mecanísticos com LPS de camundongo e bleomicina Os modelos sugeriram que o TLR4 (toll-like receptor 4) e os inflamassomas estão causalmente ligados à supressão da pinocembrina da sinalização inflamatória de NF-K [2]. Tal como acontece com todos os modelos de fibrose pulmonar induzidos por bleomicina, o momento da intervenção medicamentosa é crucial para determinar as contribuições anti-fibróticas e anti-inflamatórias relativas do tratamento [25. O momento do tratamento com pinocembrina no estudo atual foi de 7 dias após a infusão final de bleomicina que está no início da fase fibrótica neste modelo [12,13]. Embora a inflamação tenha sido muito menor neste momento -7, ela ainda estava presente, portanto, não podemos descartar que alguns dos fracos efeitos antifibróticos da pinocembrina foram devidos às suas atividades anti-inflamatórias.

Anteriormente, utilizamos este modelo ovino de fibrose pulmonar para avaliar o potencial terapêutico de duas outras drogas, cujos resultados podem ser úteis para comparar os efeitos da pinocembrina encontrados no presente estudo. Testamos um inibidor do canal iônico KCa3.1 chamado senicapoc [15,16], e também investigamos a eficácia da droga pirfenidona aprovada pela FDA no modelo[14]. Os desenhos de estudo publicados foram essencialmente semelhantes ao estudo atual de pinocembrina, com cada estudo usando 10 ovelhas por grupo. Os períodos de tratamento medicamentoso foram de duração semelhante, sendo de quatro a cinco semanas para cada droga. A principal diferença foi que nos estudos com senicapoc e pirfenidona, as drogas foram administradas por via oral, enquanto a pinocembrina foi administrada intra-pulmão em segmentos pulmonares locais. Além disso, o pulmão inteiro não recebeu pinocembrina no estudo atual, enquanto o pulmão inteiro foi exposto a drogas nos ensaios de pirfenidona e senicapoc. As análises dos dados entre esses estudos revelam que os níveis de melhorias nos marcadores de doença de complacência pulmonar, pontuações gerais de patologia e inflamação estavam em um nível semelhante para o estudo de pinocembrina quando comparados a outros estudos de drogas realizados com o modelo de ovelhas. O principal ponto de diferença entre esses estudos foi que, nos estudos publicados anteriormente, a administração de pirfenidona ou senicapoc resultou em reduções significativas na concentração de proteína de colágeno, conforme avaliado pelo ensaio de hidroxiprolina [14, 16]. drogas sugere que a melhora significativa na função e patologia do pulmão é predominantemente através dos efeitos anti-inflamatórios da pinocembrina e, em menor grau, devido às suas ações antifibróticas.

No estudo atual, as quatro doses de 7 mg de pinocembrina administradas aos pulmões em intervalos semanais foram bem toleradas e não apresentaram efeitos colaterais adversos. Isso é consistente com os dados de um estudo randomizado, duplo-cego, controlado por placebo com 58 pacientes saudáveis, que mostrou que a injeção intravenosa de pinocembrina foi bem tolerada até 120 mg por dia [26]. O estudo avaliou os regimes de dose única e múltipla e descobriu que não havia grandes preocupações de segurança que impediriam qualquer desenvolvimento clínico futuro da administração de pinocembrina por injeção [26]. Os dados do estudo atual mostraram que a entrega intra-pulmão direta de pinocembrina não era apenas segura e viável, mas também apoiava a noção de que esse flavonóide pode ser útil no tratamento de várias doenças inflamatórias do pulmão. A asma é uma importante doença alérgica das vias aéreas que seria suscetível à entrega de pinocembrina aos pulmões. Evidências preliminares que apoiam os efeitos anti-asmáticos da pinocembrina foram demonstradas em um estudo em que injeções intraperitoneais de pinocembrina inibiram a doença alérgica das vias aéreas em camundongos [20]. Poderia, portanto, ser razoavelmente esperado que a entrega localizada de pinocembrina apenas para os pulmões seria mais eficaz no tratamento de condições semelhantes à asma na clínica.

Conclusão

Em conclusão, os dados fortes e significativos derivados deste estudo foram consistentes com a pinocembrina sendo bioativa e melhorando os principais parâmetros da doença no cenário do modelo animal. Os impressionantes efeitos anti-inflamatórios e modestos de remodelação antifibrótica da administração de pinocembrina foram provavelmente ligados à sua capacidade de melhorar a patologia pulmonar e a complacência funcional.