O Efeito do Tropisetron no Estresse Oxidativo, SIRT1, FOXO3a e Claudina-1 no Tecido Renal de Ratos Diabéticos Induzidos por STZ

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrato

O tropisetron é um antagonista do receptor 5-HT3 que exerce um efeito protetor contra DN. O objetivo deste estudo foi investigar os possíveis mecanismos moleculares associados aos efeitos renoprotetores do tropisetron em ratos diabéticos induzidos por STZ. Os animais foram subdivididos em 5 grupos iguais; controle, tropisetrona, diabetes, tropisetrona mais diabetes e glibenclamida mais diabetes (n=7). Para indução de diabetes tipo 1, uma única injeção de STZ (55 mg/kg, ip) foi administrada aos animais. Ratos diabéticos foram tratados com tropisetron (3 mg/kg) e glibenclamida (1 mg/kg) por 2 semanas. De acordo com a análise realizada, o diabetes levou arenal disfunção (redução da taxa de filtração glomerular e ureia e creatinina urinárias, bem como elevação da ureia e creatinina plasmáticas) e anormalidades no sistema de defesa antioxidante (redução da TAC e elevação do MDA), em comparação com o grupo controle, que foi prevenida pelo tropisetron tratamento. A reação em cadeia da polimerase quantitativa de transcrição reversa e a análise de Western blotting demonstraram que a expressão do gene SIRT1 diminuiu enquanto a expressão do gene FOXO3a e NF-κB, bem como as razões de proteína fosforilada FOXO3a/FOXO3a total e o nível de proteína claudina-1 aumentaram norimde ratos diabéticos em comparação com o grupo controle. Aqui, os resultados desta pesquisa mostraram que o tratamento com tropisetron reverteu essas alterações. Além disso, todas essas alterações foram comparadas com aquelas produzidas pela glibenclamida como controle positivo. Assim, o tropisetron melhoroudano renaldevido à nefropatia diabética possivelmente pela supressão do estresse oxidativo e alteração dos níveis de SIRT1, FOXO3a e claudina-1.

Palavras-chave:dano renal; função renal; doença renal; rim; tecidos renais

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Introdução

A nefropatia diabética (ND) é uma doença microvascular caracterizada por proteinúria excessiva com uma morbidade de 25 a 40 por cento (Chen et al. 2011; Ritz et al. 2010). Alterações morfológicas e funcionais, incluindo hipertrofia glomerular, acúmulo excessivo de matriz extracelular e glomeruloesclerose e, em última análise, perda defunção renalnorimestão associados à hiperglicemia e, posteriormente, ao distúrbio do metabolismo da glicose (Kanwar et al. 2008; Vikram et al. 2014). Portanto, atenção especial tem sido dada ao manejo ou tratamento eficaz que pode ser necessário para combater a doença em estágio inicial. Evidências acumuladas indicam que a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) como um problema direto da hiperglicemia e, posteriormente, a produção de citocinas inflamatórias são os principais mecanismos no desenvolvimento de complicações diabéticas (Beckman e Ames 1998; Giacco e Brownlee 2010; Jaimes et al. 2010 ; Kiritoshi et al. 2003). É evidente que o desequilíbrio entre a capacidade de defesa pró-oxidante e antioxidante resulta no acúmulo de radicais livres que podem danificar macromoléculas celulares, incluindo DNA, bem como modificação de proteínas e peroxidação lipídica (Peluso e Raguzzini 2016).

As sirtuínas de mamíferos são uma família de desacetilases dependentes de NAD plus, incluindo sete membros (SIRT1-7). Entre eles, o SIRT1, o primeiro membro da família, foi o mais estudado (Dong et al. 2014). Estudos recentes revelaram que a SIRT1 desempenha um papel importante na regulação da morte/longevidade celular, bem como uma resposta ao estresse agudo e crônico em mamíferos, atenuando danos no DNA, inflamação e apoptose (Hasegawa et al. 2013; Yun et al. 2012 ). Vários estudos apontam níveis mais elevados de downregulation induzida por ROS da atividade SIRT1 no diabéticorins,tanto in vivo quanto in vitro (Akhtar e Siragy 2019; Du et al. 2016; Kumar et al. 2014; Papadimitriou et al. 2015; Park et al. 2016; Shi e Huang 2018).

A SIRT1 pode exercer sua ação regulando diversas proteínas, como os fatores de transcrição do fator nuclear kappaB (NF-κB) e da família FOXO (Brunet et al. 2004; Langley et al. 2002; Motta et al. 2004; Yeung et al. . 2004). Recentemente, foi notificado que SIRT1 regula o metabolismo da glicose contribuindo para FOXOs (Kobayashi et al. 2005). FOXO3a é um subgrupo da família FOXO de fatores de transcrição que têm um papel importante durante o estresse oxidativo (Accili e Arden 2004). Modificações de FOXO3a ocorrem por fosforilação e acetilação que podem aparecer simultaneamente em várias condições. De acordo com a literatura, SIRT1 pode desacetilar FOXO3a, aumentando assim seu nível de ubiquitinação e protegendo contra estressores (Wang et al. 2017a). Há pouca informação sobre o mecanismo das interações entre SIRT1 e FOXO durante condições hiperglicêmicas (Yun et al. 2012). No entanto, foi sugerido que SIRT1 modula a atividade do FOXO provavelmente por sua translocação nuclear (Brunet et al. 2004) e também controla a transcrição gene-específica (Kobayashi et al. 2005). Portanto, a translocação de FOXO3a do citoplasma para o núcleo é causada principalmente pela atividade de desacetilação da SIRT1, especialmente em estado de estresse oxidativo (Yun et al. 2012).

Wang et ai. relataram que o tratamento com alta glicose modulava a expressão das proteínas SIRT1 e FOXO3a em humanosrimcélulas epiteliais (Wang et al. 2017b). Além disso, o FOXO3a funciona como um regulador positivo da sinalização de NF-κB, no qual pode ser empregado para afetar as estratégias de sobrevivência celular em condições de estresse (Li et al. 2012). Claudin-1 é um marcador específico de células epiteliais parietais putativas (PEC) (Huby et al. 2009; Ohse et al. 2009; Rincon-Choles et al. 2006), que está associado negativamente com a expressão de SIRT1 em ambas túbulos e região glomerular. Foi demonstrado que a regulação negativa de SIRT1 no diabetes é corroborada pela regulação positiva da proteína claudina de junção apertada-1 em podócitos que contribuem para a albuminúria (Gong et al. 2017; Hasegawa et al. 2013). Como o estresse oxidativo, uma citocina inflamatória e seus mediadores moleculares são tópicos importantes no efeito deletério do diabetes, agentes antioxidantes e anti-inflamatórios podem fornecer novas terapias contra ND (Elmarakby e Sullivan 2012).

Tropisetron é um antagonista do receptor 5-HT3 emergente recentemente que foi identificado como uma droga antiemética durante a quimioterapia (Barzegar-Fallah et al. 2015). Vários relatórios mostraram que o tropisetron pode oferecer efeitos antiapoptóticos, antidiabéticos, anticancerígenos, antilipidêmicos, neuroprotetores e cardioprotetores que provavelmente são mediados por mecanismos antioxidantes e anti-inflamatórios (Aminzadeh 2017; Asadi et al. 2016; Barzegar-Fallah et al. 2015; Barzegar-Fallah et al. 2014; Gholizadeh-Ghaleh Aziz et al. 2019; Rashidi e Bazi 2020). Existem alguns estudos que comprovam o efeito antioxidante do tropisetron, tanto in vitro quanto in vivo, como o efeito protetor do tropisetron no distúrbio oxidativo induzido por hiperglicemia em células PC12 (Aminzadeh 2017), melhora da lesão mitocondrial por redução atividade do sistema no cérebro (Haj Mirzaian et al. 2016), ou atenuar o estresse oxidativo contra o envelhecimento cerebral em camundongos (Mirshafa et al. 2020).

Recentemente, Barzegar Fallah et al. revelou que o tropisetron melhora a glicemia e tambémfunção renalcomo evidenciado pela diminuição do nitrogênio ureico no sangue sérico (BUN), níveis séricos de creatinina e excreção urinária de albumina. Além disso, o conteúdo de malondialdeído (MDA), níveis de glutationa (GSH), superóxido dismutase (SOD) e atividades de catalase (CAT) foram melhorou em animais diabéticos tratados com tropisetron (Barzegar-Fallah et al. 2015). No entanto, não há outra evidência forte sobre a modulação do DN pelo tropisetron e seu mecanismo molecular. Este estudo, portanto, visa avaliar, em primeiro lugar: os efeitos do tropisetron em mediadores moleculares, incluindo SIRT1, NF-κB e FOXO3a, bem como claudina-1, que é uma proteína envolvida em junções epiteliais apertadas e desempenha um papel papel principal emrenalnefropatia diabética; segundo, comparar o efeito do tropisetron com o antidiabético padrão comercializado, a glibenclamida, a fim de encontrar um agente mais benéfico e seguro como antidiabético padrão ouro.

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Materiais e métodosEste estudo foi conduzido de acordo com os Princípios de Cuidados com Animais de Laboratório na Universidade de Ciências Médicas de Urmia. A aprovação ética foi obtida a partir da Diretiva da UE 2010/63/UE para experimentos com animais de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética Médica, Ministério da Saúde, Irã (IR.UMSU.REC.1397.291). Trinta e cinco ratos Wistar machos (230-270 g de peso, 3-4 meses de idade) foram alocados em 5 grupos (sete ratos em cada grupo): 1. Grupo controle: Os ratos receberam solução salina intraperitoneal por 2 semanas. 2. Grupo tropisetron: Os ratos receberam tropisetron intraperitoneal por 2 semanas. 3. Grupo Diabetes: O diabetes foi induzido por injeção de estreptozotocina (STZ) em ratos. 4. Grupo tropisetrona mais diabetes: Os ratos receberam 3 mg/kg de tropisetrona (Gholizadeh-Ghaleh Aziz et al. 2019) por via intraperitoneal por 2 semanas após a indução do diabetes. 5. Grupo Glibenclamida mais diabetes: Os ratos receberam 1 mg/kg de glibenclamida (Gholizadeh-Ghaleh Aziz et al. 2019) por via intraperitoneal por 2 semanas após a indução do diabetes.

Indução de diabetesEstreptozotocina (50 mg/kg) foi injetada intraperitonealmente em dose única para induzir diabetes em ratos. Com base neste método, o diabetes tipo I foi induzido nos ratos 72 h após a injeção. O diabetes foi diagnosticado e confirmado pela criação de uma pequena lesão usando uma lanceta na cauda de ratos em jejum e, em seguida, uma gota de sangue foi colocada em uma tira de glicosímetro. Em seguida, foi medida por um glicosímetro (Boehringer Mannheim Indianapolis, IN), e níveis de glicose no sangue acima de 300 mg/dl foram considerados um indicador de indução de diabetes. Após 2 semanas e 24 h antes da anestesia, os ratos foram colocados em gaiolas metabólicas um a um, e a urina foi coletada. Em seguida, as amostras de urina foram imediatamente centrifugadas com a superfície transparente das amostras armazenadas a -20 graus para análise de uréia e creatinina. Em seguida, os ratos foram pesados ​​e anestesiados por injeção intraperitoneal de mistura de cetamina (60 mg/kg) e xilazina (4 mg/kg). Em seguida, a cavidade abdominal foi aberta; o sangue foi obtido do coração por uma seringa estreita e misturado com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e centrifugado a 4000×g por 20 min. Em seguida, o plasma produzido foi armazenado a -80 graus para posterior medição de uréia, creatinina e capacidade antioxidante total (TAC). Ambosrinsdos animais foram excisados, lavados com soro fisiológico frio e pesados. A esquerdarimos tecidos foram homogeneizados por Ultra Turrax (T10B, IKA e Alemanha) em uma solução contendo RNAase para testar os níveis de expressão de SIRT1, NF-κB e FOXO3a usando o método de PCR em tempo real. Certorimfoi congelado a -80 graus para medição de MDA e análise de Western blot (FOXO3a total e fosforilado e claudina-1).

Glicemia em jejumAo final do protocolo, após jejum noturno (14 a 18 h), amostras de sangue foram obtidas da ponta da cauda e, em seguida, os níveis de glicose foram medidos por meio de um glicosímetro digital (Elegance, CT-X10, Frankenberg, Alemanha).Uréia e creatinina urinárias e plasmáticasPara tanto, os níveis urinários e plasmáticos de uréia e creatinina serão mensurados por meio de kits econômicos específicos para dosagem de uréia e creatinina (Biotechnical; Varginha, Minas Gerais, Brasil).Taxa de filtração glomerularA taxa de filtração glomerular (TFG) é o melhor índice geral defunções renais, que foi avaliado pelo cálculo da depuração de creatinina (TFG=[UCr × V]/SCr) e usando as concentrações de creatinina no plasma e na urina e a taxa ou volume de fluxo urinário.

Malondialdeído e capacidade antioxidante totalO MDA como produto final da peroxidação lipídica foi avaliado através de uma reação com ácido tiobarbitúrico (Sigma-Aldrich; EUA) norimamostras de acordo com o protocolo do fabricante (Esterbauer e Cheeseman 1990). Em resumo, 0,3–0,4 g dotecido renalfoi homogeneizado em KCl gelado (150 mM) e depois centrifugado a 3000×g por 10 min. Em seguida, 0,5 ml do sobrenadante foi combinado com 3 ml de ácido fosfórico (1 por cento, v/v), e após a mistura em vórtice, 2 ml de 6,7 g/l de TBA foram adicionados às amostras. Os corpos de prova foram aquecidos a 100 graus por 45 min. Após resfriamento em gelo, n-butanol (3 ml) foi combinado e os produtos foram centrifugados a 3000×g por mais 10 min. Em seguida, considerou-se a absorbância dos produtos em 532 nm por meio de espectrofotometria. O nível de absorbância foi comparado com a curva padrão. O TAC foi medido por um kit de status antioxidante total Randox, no qual ABTS 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) é incubado com peroxidase e H2O2 resultando no cátion radical ABTS mais produção . Isso tem uma cor azul-esverdeada estável, que é avaliada usando um analisador automático 600-nm (Amini et al. 2020).

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Design de primer e PCR em tempo realO RNA foi primeiramente extraído pelo kit relevante (GENALL), e o RNA condensado foi avaliado qualitativamente (eletroforese) e quantitativamente (nano-gota) para garantir a extração do RNA e aplicação em técnicas moleculares subsequentes. Em seguida, o cDNA relevante foi sintetizado a partir de todas as amostras de RNA extraídas. Os primers dos genes alvo e o gene gliceraldeído desidrogenase (GAPDH) como um gene de manutenção foram examinados no sítio NCBI usando o software Generunner (Tabela Suplementar). Em seguida, a expressão gênica foi analisada utilizando os primers sintetizados por um kit de PCR, seguido de análise estatística dos dados.

Western blotO método Western blot foi usado para determinar os níveis de proteína FOXO3a (total e fosforilada) e claudina-1 norim.Dois géis de resolução e empilhamento são usados ​​para fazer o gel de eletroforese. Depois de preparar o gel de resolução e despejá-lo no molde, um gel de empilhamento foi adicionado após uma hora e após o empilhamento. As amostras foram carregadas em poços feitos por um pente especial. Em seguida, foram separados por SDS-PAGE. Dentro de uma hora, todos os espécimes carregados foram transferidos para a membrana de PVDF. Subsequentemente, as amostras foram bloqueadas com 5% de tampão de leite desnatado incluindo 0,1% Tween 20 e foram então incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 graus em uma incubadora shaker. Em seguida, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano. Finalmente, a beta-actina foi usada como padrão interno para a análise de Western Blot. Ao final, os efeitos das amostras blotted, dependendo do nível de proteína alvo, foram avaliados no filme de radiografia em uma sala escura. Para quantificar as proteínas alvo, os resultados da varredura do filme foram calculados por um densitômetro em relação ao nível de actina. Os anticorpos usados ​​nos ensaios de Western blotting são mostrados na Tabela Suplementar (números de catálogo e empresas).

Análise estatísticaOs resultados foram apresentados como média ± SEM. A análise estatística foi realizada usando SPSS 16.0. A comparação entre os grupos foi estimada pelo teste ANOVA seguido do teste post hoc de Tukey. As diferenças foram assumidas estatisticamente significativas em P <>

Resultados

Tropisetron diminuiu a glicemia de jejum (mg/dl), peso renal (g) e índice renal (mg/g), enquanto aumentou o peso corporal (g) nos ratos diabéticos induzidos por STZÀ semelhança de estudos anteriores neste trabalho, os grupos diabéticos apresentaram hiperglicemia grave (P <{0}}.001) em="" comparação="" com="" o="" grupo="" controle.="" o="" consumo="" de="" tropisetron="" (p="">< 0="" 0,01)="" e="" glibenclamida="" (p="">< 0,05)="" por="" 2="" semanas="" reduziu="" significativamente="" a="" glicemia="" em="" grupos="" diabéticos="" induzidos="" por="" stz,="" mas="" ainda="" foi="" significativamente="" maior="" do="" que="" no="" grupo="" controle="" (p="">< 0,001="" ).="" não="" houve="" diferença="" significativa="" no="" peso="" corporal="" (pc)="" entre="" os="" grupos="" no="" início="" deste="" estudo="" (dados="" não="" apresentados).="" a="" indução="" de="" diabetes="" por="" stz="" diminuiu="" significativamente="" (p="">< 0,001)="" finalmente="" (bw)="" em="" ratos="">Rimo peso (KW) não foi significativo entre os grupos no início; porém, aumentou no grupo diabético e diminuiu após as intervenções.Rimíndice (KW/BW) aumentou significativamente (P < {{0}},001)="" no="" dm1="" quando="" comparado="" com="" o="" grupo="" controle.="" curiosamente,="" após="" 2="" semanas="" de="" administração="" de="" tropisetron="" e="" glibenclamida,="" kw/bw="" modulado="" (p="">< 0,05)="" (tabela="">

Tropisetron melhorou a análise bioquímica em ratos diabéticos induzidos por STZComo em estudos anteriores, os níveis de uréia no plasma e na urina do grupo diabético foram significativamente maiores do que os do grupo controle (P < {{0}}.001)="" .="" no="" grupo="" tropisetron="" mais="" diabetes,="" plasma="" (p="">< 0.{{10}}01)="" e="" urina="" (p="">< 0.0="" 5)="" os="" níveis="" de="" uréia="" diminuíram="" significativamente="" em="" comparação="" com="" os="" dos="" grupos="" de="" diabetes.="" no="" entanto,="" a="" uréia="" na="" urina="" ainda="" foi="" significativamente="" menor="" do="" que="" no="" grupo="" controle="" (p=""><0,01). não="" há="" diferença="" significativa="" no="" nível="" plasmático="" de="" uréia="" entre="" tropisetron="" mais="" diabetes="" e="" grupos="" controle.="" os="" níveis="" de="" creatinina="" no="" plasma="" (p="">< 0,001)="" e="" na="" urina="" (p="">< 0,05)="" mostraram="" um="" aumento="" significativo="" nos="" ratos="" diabéticos="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" controle.="" a="" administração="" de="" tropisetron="" reduziu="" significativamente="" os="" níveis="" de="" creatinina="" na="" urina="" e="" no="" plasma="" (p="">< 0,001)="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" diabético.="" nos="" animais="" diabéticos,="" o="" clearance="" de="" creatinina,="" como="" indicador="" da="" taxa="" de="" filtração="" glomerular,="" foi="" significativamente="" menor="" do="" que="" no="" grupo="" controle="" (p="">< 0,05).="" o="" tratamento="" com="" tropisetron="" aumentou="" significativamente="" a="" depuração="" de="" creatinina="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" diabetes="" (p=""><0,001). os="" mesmos="" resultados="" foram="" obtidos="" no="" grupo="" tratado="" com="" glibenclamida.="" no="" entanto,="" a="" uréia="" plasmática="" é="" muito="" menor="" no="" grupo="" tratado="" com="" tropisetron="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" glibenclamida="" mais="" diabetes="" (p="">< 0,01)="" (tabela="">

Tropisetron aumentou o conteúdo plasmático de TAC e atenuou o nível de MDA em ratos diabéticos induzidos por STZO nível de MDA nos grupos controle, tropisetron, diabetes mellitus, tropisetron mais diabetes e glibenclamida mais diabetes foi de 8,65 ± 1.01, 10,89 ± 1.6 35,54 ± 7,1, 18,76 ± 3,6 e 16,89 ± 4,1 nmol/mg de proteína, respectivamente. Nosso estudo, juntamente com os de outros, demonstrou o maior nível de MDA no grupo de diabetes, que apresentou um aumento significativo em comparação com o grupo controle (P < 0.00="" 1).="" o="" nível="" de="" mda="" nos="" grupos="" de="" tropisetron="" mais="" diabetes="" e="" glibenclamida="" mais="" diabetes="" mostrou="" uma="" redução="" significativa="" (p=""><{{30}}.01) em="" comparação="" com="" o="" grupo="" de="" diabetes="" (fig.="" 1a).="" os="" níveis="" de="" tac="" nos="" grupos="" controle,="" tropisetron,="" diabetes,="" tropisetron="" mais="" diabetes="" e="" glibenclamida="" mais="" diabetes="" foram="" 0,65="" ±="" 0.{{40}}3,="" {{44}="" },76="" ±="" 0,06,="" 0,26="" ±="" 0,08,="" 0,45="" ±="" 0,06="" e="" 0,57="" ±="" 0,08="" nmol/ml,="" respectivamente.="" os="" níveis="" de="" tac="" diminuíram="" no="" grupo="" diabetes="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" controle="" (p="">< 0,001),="" conforme="" mostrado="" anteriormente.="" as="" administrações="" de="" tropisetron="" e="" glibenclamida="" aumentaram="" significativamente="" (p="">< 0,01)="" os="" níveis="" plasmáticos="" de="" tac="" em="" animais="" diabéticos="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" diabético="" (fig.="">

Tropisetron aumentou SIRT1 e diminuiu as expressões gênicas de FOXO3a e NF-κB As expressões gênicas foram avaliadas por PCR em tempo real que forneceu evidências importantes para uma diferença entre os grupos. Assim, o diabetes foi associado a uma diminuição significativa (0,65 ± 0.08) na expressão do gene SIRT1 (P < 0.01)="" )="" e="" um="" aumento="" significativo="" (p="">< 0.001)="" em="" foxo3a="" (1,98="" ±="" 0.08)="" e="" nf-κb="" (1,71="" ±="" 0.14)="" expressão="" gênica="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" controle.="" o="" tratamento="" com="" tropisetron="" aumentou="" sirt1="" (0,88="" ±="" 0,3)="" e="" diminuiu="" os="" níveis="" de="" mrna="" de="" foxo3a="" (1,53="" ±="" 0,08)="" (p="">< 0,05)="" e="" nf-κb="" (1,27="" ±="" 0,03)="" (p="">< 0,01)="" significativamente="" em="" ratos="" diabéticos="" (fig.="" .="" 2a–c).="" resultados="" semelhantes="" foram="" fornecidos="" nos="" animais="" tratados="" com="" a="" droga="" padrão,="">

O tropisetron diminuiu as expressões das proteínas FOXO3a e claudina-1Para avaliar a expressão da proteína FOXO3a (total e fosforilada) e claudina- 1 após o tratamento com tropisetron e glibenclamida, foi utilizado western blotting norimde grupos diferentes. A análise de dados exibe um aumento significativo nas razões de proteína FOXO3a fosforilada/FOXO3a total (4,6 ± 0,17) e claudina-1 (3.02 ± 0,16) ) níveis de proteína no grupo diabético em comparação com o controle (P < 0.001).="" a="" administração="" de="" tropisetron="" diminuiu="" acentuadamente="" os="" níveis="" de="" proteína="" fosforilada="" foxo3a/foxo3a="" total="" (2,14="" ±="" 0,31)="" e="" claudina-1="" (2,4="" ±="" 0,12)="">rimde ratos diabéticos (P < {{0}}.01).="" o="" tratamento="" com="" glibenclamida="" atenuou="" significativamente="" ambas="" as="" razões="" de="" proteína="" fosforilada="" foxo3a/total="" foxo3a="" (2,57="" ±="" 0,5)="" (p="">< 0,001)="" e="" claudina-1="" (2,2="" ±="" 0,11)="" (p="">< 0,05="" )="" níveis="" de="" proteína="" nos="" ratos="" diabéticos="" induzidos="" por="" stz="" (fig.="">

Discussão Os achados do presente estudo são apresentados nas seguintes seções: injeção única de DM1 induzida por STZ foi associada a hiperglicemia grave, perda de peso erimdisfunção, que se manifesta por um aumento acentuado da creatinina e ureia plasmáticas e uma diminuição acentuada da depuração de creatinina como índice de TFG em comparação com o grupo controle. STZ interrompeu o equilíbrio oxidativo norimtecido que foi comprovado aumentando o MDA e diminuindo o teor de TAC. Análises moleculares posteriores mostraram que o diabetes diminuiu o mRNA de SIRT1 e aumentou o mRNA de NF-κB, bem como as razões de proteína fosforilada FOXO3a/total FOXO3a e o nível de proteína claudina-1 norimde ratos machos. Melhoria significativa de ureia, creatinina, creatinina

depuração, bem como mRNA de SIRT1, mRNA de NF-κB, razões de proteína fosforilada FOXO3a/FOXO3a total e proteína claudina-1, semelhantes às dos animais controle, foram observadas no grupo tropisetron mais diabetes. DN que é caracterizado por vários recursos, como interrupção narenalintegridade estrutural e funcional, aumento darimtamanho, bem como hipertrofia glomerular e tubular, é uma das principais causas do estágio finaldoença renal(Singh et al. 2018; Yaribeygi et al. 2018). Albuminúria progressiva, TFG diminuída e elevação da pressão arterial são os sintomas funcionais mais pronunciados observados em pacientes diabéticos (Alzahrani et al. 2020). O marcador mais precoce de ND é a albuminúria, que é causada devido ao dano glomerular progressivo como característica central no início da doença.lesão renal(Elsherbiny et al. 2018). Consistente com nossos achados, estudos anteriores destacaram que a ND é acompanhada por incrementos na creatinina sérica e ureia sugerindo disfunção dotecido renal(Sharma et al. 2006; Tang et al. 2018).

Evidências acumuladas indicam que a geração de radicais livres devido à hiperglicemia é um evento chave no aparecimento e progressão de complicações microvasculares diabéticas, incluindo ND. A produção excessiva de ROS contribui para o dano oxidativo ao afetar macromoléculas, células e tecidos e resulta em insultos irreversíveis ou distúrbios funcionais (Kiritoshi et al. 2003).

O MDA como marcador de peroxidação lipídica é desencadeado pelo ataque de radicais livres em ácidos graxos insaturados de membrana, que têm contribuído para complicações diabéticas (Pieme et al. 2017). O status antioxidante total foi estimado pelo TAC, que é um biomarcador para determinar o estresse oxidativo em muitas condições patológicas. Assim, deficiências de MDA e TAC em pacientes diabéticos refletem a produção de radicais livres que induzem o estado de estresse oxidativo (Peluso e Raguzzini 2016). Consistentemente, os resultados deste estudo mostraram aumento dos níveis de MDA e diminuição dos níveis de TAC em ratos diabéticosrim. Considerando este fato, a atenuação do estresse oxidativo melhorou as complicações diabéticas, incluindolesão renal(Alzahrani et al. 2020; Barzegar-Fallah et al. 2015).

Tropisetron, como um 5-antagonista de HT3 com atividades antioxidantes e anti-inflamatórias, apresenta efeitos protetores em várias condições patológicas, como diabetes (Barzegar-Fallah et al. 2015; Rashidi e Bazi 2020). O efeito nefroprotetor do tropisetron foi previamente descrito em experimentos com animais. Dentro dessa visão, o tropisetron melhorou o DN de maneira 5-independente do receptor HT3, prevenindo o aumento da glicose no sangue,renalNíveis de MDA, CAT, SOD, Gpx e TNF- e diminuição da excreção urinária de citocinas e albuminúria (Barzegar-Fallah et al. 2015).

De acordo com essa questão, na investigação atual, a evidência é fornecida para mostrar que o tropisetron modula a hiperglicemia, a perda de peso e o estado de estresse oxidativo que é exibido pela diminuição do MDA e aumento do conteúdo de TAC e melhorarimdisfunção (uma depleção significativa na ureia e creatinina plasmáticas). A glibenclamida foi aplicada como medicamento padrão de acordo com estudos anteriores (Amini et al. 2020). Curiosamente, nenhuma diferença significativa foi observada nos parâmetros mencionados nos grupos administrados com glibenclamida e tropisetron no gruporimde ratos diabéticos. No entanto, os mecanismos precisos por trás do efeito protetor do tropisetron na ND ainda são desconhecidos. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a demonstrar que o tropisetron aumentou a expressão do gene SIRT1 e diminuiu as razões de proteína fosforilada FOXO3a/total FOXO3a, NF-κB e os níveis de proteína claudina- 1 norimde animais diabéticos.

A SIRT1 é uma proteína desacetilase de classe III que se envolve na sobrevivência das células sob condições estressantes, ativando várias proteínas-chave. É um fator essencial para modular a expressão gênica em resposta à geração de ROS, como NF-κB e fatores de transcrição foxo (Brunet et al. 2004; Sengupta et al. 2011). Entre a família foxo, assume-se que FOXO3a tem um papel importante durante o estresse oxidativo, regulando vários antioxidantes, incluindo SOD e CAT

(Hasegawa et al. 2008; Kops et al. 2002). Em particular, a inativação de FOXO3a foi associada à regulação negativa do estresse oxidativo induzido por CAT durante condições de hiperglicemia (Wang et al. 2017b). SIRT1 gerencia a ativação de FOXO3a por desacetilação e modula a resposta celular ao estresse oxidativo direta ou indiretamente (Hori et al. 2013). Foi declarado que existe uma associação funcional entre a regulação SIRT1 e FOXO3 do sistema de defesa antioxidante mediado por MnSOD (Tanaka et al. 2009; Zhang et al. 2015). Assim, Zhang et al. (2015) demonstraram que a icariina protegeu a lesão pulmonar aguda causada pela via de sinalização SIRT1/FOXO3 mediada por isquemia/reperfusão intestinal pela regulação positiva da expressão de MnSOD. Relatórios anteriores também sugeriram que a regulação positiva de SIRT1 alivia a nefropatia induzida por cisplatina,renallesão isquêmica/reperfusão e nefropatia diabética (Funk e Schnellmann 2013; Gu et al. 2016; Kim et al. 2011). Notavelmente, a regulação negativa da SIRT1 induzida pelo diabetes que conduz as alterações fisiopatológicas leva arenaltoxicidade (Wang et al. 2017b). Hasegawa et ai. (2013) demonstraram que a diminuição da SIRT1 nos túbulos proximais desencadeou o início da ND e resultou em albuminúria. Em linha, os resultados desta pesquisa identificaram diminuiçãorenalExpressão do gene SIRT1 no grupo diabético. Portanto, a ativação de SIRT1 causou a resistência derenalcélulas tubulares ao estresse celular (Kume et al. 2013). Em suma, os ativadores de SIRT1 ganharam atenção notável como candidatos interessantes para terapia de diabetes (Song et al. 2018)

Além disso, a presente pesquisa também mostrou marcada resposta inflamatória em pacientes diabéticos.rinscomo evidenciado pela elevação de NF-κB. É um fator regulador essencial ligado à resposta imune e inflamação (Hayden e Ghosh 2012). Consistente com os achados desta pesquisa, vários estudos relataram que a ativação do NF-κB e sua translocação nuclear aumentam tanto no DN experimental quanto no humano (Alzahrani et al. 2020; Kuhad e Chopra 2009). Além disso, a elevação de SIRT1 contribui para a inativação de NF-κB para resgatar podócitos de lesão no diabéticorim(Liu et al. 2014). Curiosamente, a superexpressão de SIRT1 atenua uma expressão proteica em junções epiteliais apertadas, a saber, claudina-1, em ratos hiperglicêmicos, que está em correlação com o nível de proteinúria. Claudina ativada-1 em podócitos deteriora a função de barreira glomerular por meio da redução da expressão de sinaptopodina ou podocina, resultando em albuminúria (Hasegawa et al. 2013). Esses achados também foram aprovados nos rins dos ratos diabéticos.

Aqui, foi demonstrado pela primeira vez que, sob condições diabéticas, a administração de tropisetron levou a um aumento da expressão do gene SIRT1 e, concomitantemente, diminuição das razões de proteína fosforilada FOXO3a/FOXO3a total, NF-κB e níveis de proteína claudina-1. Portanto, é muito lógico que tal ativação na SIRT1 e a consequente diminuição nas razões de proteína fosforilada FOXO3a/FOXO3a total, NF-κB e claudina-1 sejam, em parte, responsáveis ​​pela melhora na diabéticofunção renal. Os pesquisadores relataram que os efeitos protetores do tropisetron no DN parecem ser 5-independentes do receptor HT3, uma vez que o granisetron, outro bloqueador seletivo do receptor 5-HT3, falhou em proteger o DN. Foi declarado que os mecanismos antioxidantes e anti-inflamatórios do tropisetron podem ter um papel crítico natecido renalproteção no diabetes (Barzegar-Fallah et al. 2015). Recentemente, nosso laboratório observou que o tratamento com tropisetron aumentou a secreção de insulina e diminuiu o nível de glicose no sangue, elevando a expressão do gene GLUT2, bem como a via UCP2/ZnT8 (Naderi et al. 2020). Tropisetron como um bloqueador do receptor 5-HT3 aumentou a liberação de insulina da linha de células beta produtoras de insulina pancreática que resultou em hipoglicemia (Heimes et al. 2009). Portanto, parece que a modulação da liberação de insulina e, posteriormente, a homeostase da glicose podem envolver respostas antioxidantes e anti-inflamatórias contribuindo pararimproteção.

Em consonância com os presentes achados, o tropisetron reverteu o dano oxidativo aumentando a expressão do gene SIRT1 na senescência em camundongos (Mirshafa et al. 2020). Além disso, a atenuação da lesão hepática, os níveis de proteína TNF- e IL-6 foram observados no fígado de ratos diabéticos após o co-tratamento com tropisetron (Amini et al. 2020; Gholizadeh-Ghaleh Aziz et al. 2019). Além disso, na presente pesquisa, o tropisetron mostrou uma resposta semelhante a uma droga padrão, a glibenclamida. Consequentemente, a exposição à glibenclamida aumentou SIRT1 e diminuiu as razões de proteína fosforilada FOXO3a/FOXO3a total, NF-κB e níveis de claudina{12}} no diabéticorinsno estudo atual. A glibenclamida é uma droga estabelecida que tem sido amplamente utilizada no tratamento de pacientes diabéticos por inibir os canais de K+ sensíveis a ATP. Uma vez que houve alguns resultados contraditórios sobre o efeito da glibenclamida na ND (Akbar et al. 2013; Elmalí et al. 2004; Nakamura et al. 2000), provavelmente devido à dosagem ou duração do tratamento, este evento motivou a introdução de um novo medicamento para pacientes diabéticos como um agente seguro e eficaz com menos efeitos colaterais

No geral, o tropisetron melhora efetivamentefunção renalem DN provavelmente alterando a expressão de SIRT1, razões de proteína fosforilada FOXO3a/FOXO3a total, NF-κB e claudina-1. Este estudo teve algumas limitações em apoiar este assunto. Por exemplo, estudos morfológicos devem tentar fornecer mais evidências para validar a presente investigação. Além disso, os pesquisadores não empregaram inibidores de moléculas para validar o mecanismo exato da via de sinalização.

Conclusão

Em conclusão, os achados deste estudo mostraram o efeito nefroprotetor do tropisetron no DM1 induzido por STZ. Os achados notáveis ​​desta investigação indicaram que o efeito nefroprotetor do tropisetron possivelmente envolveu alterações na expressão de SIRT1, FOXO3a, NF-κB e claudina-1. Esses dados podem ser estimulantes para novas pesquisas nessa área.