O estado atual da neuroproteção nas doenças cardíacas congênitas, parte 3

3.2. Avaliação semiquantitativa do DNA mitocondrial ectópico

Imagens de coloração Hsp60 (a matriz mitocondrial) e coloração de histona-H2B (o marcador nuclear) foram subtraídas de imagens de coloração de dsDNA. Em seguida, utilizando a função “AdjustThreshold” do software lmage] (National Institutes of Health), as imagens foram binarizadas.

As mitocôndrias são as fábricas de energia nas células, responsáveis ​​pela síntese de ATP para fornecer a energia necessária às células. A matriz mitocondrial é o líquido interno das mitocôndrias, que contém uma variedade de enzimas e íons e é um local chave para várias reações bioquímicas das mitocôndrias. A memória é uma das habilidades cognitivas mais importantes do ser humano. Embora os dois possam parecer não relacionados, eles estão intimamente relacionados.

A pesquisa mostra uma interação entre a matriz mitocondrial e a memória. Enzimas e íons na matriz mitocondrial podem afetar diretamente a excitabilidade dos neurônios, regulando o metabolismo energético e o status dos canais iônicos nas células neuronais, afetando assim a memória. Além disso, há uma variedade de moléculas sinalizadoras na matriz mitocondrial, que podem ser transmitidas aos neurônios a jusante através dos axônios e sinapses dos neurônios, afetando a eficiência de transdução de sinal dos neurônios, afetando assim a formação e consolidação da memória.

Ao mesmo tempo, a atividade da memória também afeta diretamente o estado da matriz mitocondrial. As atividades de memória aumentarão o consumo de energia dos neurônios e promoverão a reação redox na matriz mitocondrial, afetando assim o nível metabólico das mitocôndrias e o equilíbrio iônico intracelular, afetando ainda mais a excitabilidade e a eficiência de transdução de sinal dos neurônios.

Portanto, manter uma boa saúde mitocondrial é crucial para manter uma boa função de memória. Ao manter bons hábitos de vida, como alimentação regular, exercícios moderados, sono adequado, etc., você pode ajudar a manter a saúde da matriz mitocondrial. Além disso, a função da memória também pode ser melhorada através de intervenção farmacêutica apropriada para promover reações bioquímicas e sinalização dentro da matriz mitocondrial.

No dia a dia, podemos exercitar a memória de várias maneiras, como lendo, estudando, pensando, brincando, etc. Ao mesmo tempo, devemos também estar atentos à manutenção de uma boa saúde para melhor manter a saúde da matriz mitocondrial. Acredito que através destes esforços certamente teremos melhor memória e enfrentaremos melhor os diversos desafios da vida e do trabalho. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e a Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória, pois a Cistanche deserticola também pode regular o equilíbrio dos neurotransmissores, como aumentar os níveis de acetilcolina e fatores de crescimento. Essas substâncias são muito importantes para a memória e o aprendizado. Além disso, a Cistanche deserticola também pode melhorar o fluxo sanguíneo e promover o fornecimento de oxigênio, o que pode garantir que o cérebro receba nutrientes e energia suficientes, melhorando assim a vitalidade e a resistência do cérebro.

Clique em conhecer suplementos para aumentar a memória

Selecionamos dsDNA puncta variando em tamanho de 2 a 20 um' (circularidade 0.1-1.0) usando a função "Analyze-Analyze Particles". se necessário, as imagens originais foram examinadas para a contagem final. Se o sinal da histona H2B fosse pequeno. então as imagens subtraídas mostraram estruturas semelhantes a donuts.

Estes representam dsDNA citosólico de origem nuclear e devem ser eliminados da quantidade de dsDNA citosólico de origem mitocondrial. A faixa de tamanho pode ser modificada de acordo com o tipo de célula ou origem das amostras histológicas. A Figura lE mostra um exemplo de contagem de DNA mitocondrial ectópico

pontos usando 1B D.

Alternativamente, as imagens da coloração Hsp60 foram subtraídas das imagens da coloração dsDNA. Em seguida, o número de dsDNA puncta foi contado usando as funções "Adjust-Threshold "Analyze-Analyze Particles". Posteriormente, dsDNA puncta sem o sinal de histona-H2B foram contados por observação direta. O último método é adequado quando as imagens de histona-H2B mostram uma baixa relação sinal-ruído.

No total, este método pode mostrar claramente o vazamento de DNA mitocondrial ectópico no citoplasma e permite uma avaliação objetiva e estatística desse DNA mitocondrial ectópico nas células.

4. Discussão

Em nosso estudo, desenvolvemos um método que permite a contagem de DNA mitocondrial citoplasmático. A detecção de DNA mitocondrial citoplasmático foi relatada usando técnicas de imunofluorescência, mas os métodos não eram quantitativos para a avaliação do DNA mitocondrial citoplasmático na maioria dos casos [15,25]. Em outro estudo, a PCR de gotículas foi conduzida para quantificar o DNA mitocondrial circulante [9].

recentemente, Sato et al. [26,27] publicaram um excelente protocolo para avaliar o DNA citoplasmático por microscopia de imunofluorescência usando anticorpos Lamin B1 (LMNB1) como marcador de estrutura nuclear e subunidade 4 da citocromo c oxidase (COX4) como marcador de estrutura mitocondrial. Este protocolo parece muito útil para quantificar dsDNA citoplasmático de origem nuclear.

No entanto, quando tentamos COX4 ou outros marcadores de membrana mitocondrial, incluindo marcadores internos e externos, foi muito difícil discriminar com precisão o citoplasma das mitocôndrias.

Por exemplo, se observássemos sinais circulares usando um marcador de membrana mitocondrial e observássemos sinais de dsDNA dentro, então este dsDNA poderia representar tanto DNA mitocondrial dentro da mitocôndria circular (normal) ou DNA mitocondrial citoplasmático fora da mitocôndria semelhante a um donut (ectópico). Assim, usamos Hsp60 como marcador de marcação da matriz mitocondrial para avaliar o DNA mitocondrial ectópico no citoplasma.

Conforme descrito em uma revisão recente [23], existem muitos tipos diferentes de DNA citoplasmático de origem nuclear, e a maioria deles é positiva para marcadores histonos. Devido à limitação da combinação de anticorpos utilizados para coloração tripla, utilizamos a histona H2Ba como marcador de histonas.

No entanto, se esta limitação for resolvida, o H2AX pode ser um melhor marcador para dsDNA citoplasmático de origem nuclear. O dsDNA citoplasmático negativo para histona-H2B foi raramente observado nas células HeLa de controle usadas neste estudo, mas tal dsDNA de origem nuclear pode estar presente se outras linhas celulares ou condições forem usadas.

A hibridização in situ de DNA mitocondrial usada em nosso artigo recente é adequada para avaliação qualitativa, mas pode ser difícil utilizar a hibridização in situ para avaliação quantitativa [8].

A hibridização in situ expõe a amostra a altas temperaturas, o que pode resultar em deformação ou ruído de algumas partes da amostra. Por outro lado, o método imunocitoquímico apresentado neste artigo pode obter sinais com baixo ruído de fundo. Em nosso artigo recente, nas células humanas e no peixe-zebra usados ​​como modelos da doença de Parkinson, mostramos que o DNA mitocondrial vazou para o citoplasma, o que é tóxico para o células. Observamos também que a quantidade de DNA mitocondrial citosólico aumentou nos tecidos cerebrais post-mortem de pacientes com doença de Parkinson [8].

Estas linhas de evidência sugerem que uma quantidade aumentada de DNA mitocondrial ectópico vazado das mitocôndrias pode induzir inflamação aguda e crônica resultando em várias doenças, incluindo doença de Parkinson e insuficiência cardíaca; assim, a regulação positiva da degradação do DNA citosólico ou a inibição de seus sensores poderia ser um alvo terapêutico potencial para essas doenças [8,28].

O método apresentado neste artigo para a avaliação quantitativa do DNA mitocondrial ectópico serve como uma ferramenta importante para futuras pesquisas neste campo.

Contribuições dos autores: HM e MTH formularam as hipóteses, projetaram a maioria dos experimentos, realizaram os experimentos, analisaram os dados e escreveram o manuscrito. NMrealizou os experimentos relacionados às células cultivadas. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento: Este trabalho foi apoiado por doações da AMED (números de concessão JP21gm6110028 e JP19dm0107154 (HM)), da Takeda Science Foundation (HM), JSPS KAKENHI (números de concessão JP14516799 (HM), JP 16690735 (HM) e JP 17925674 (HM) ), JST (Moonshot R&D; número de concessão JPMJMS2024 (HM)) e Grants-in-Aid da TBRF (número de concessão TBRF-RF 21-135 (HM)).

Declaração de disponibilidade de dados: Os dados e ferramentas descritos neste manuscrito estão disponíveis mediante solicitação.

Agradecimentos: Agradecemos a Shinano Kobayashi por participar de discussões úteis e fornecer suporte contínuo. Reconhecemos a Fundação de Pesquisa Bioquímica de Tóquio (TBRF) por fornecer uma bolsa de pós-doutorado TBRF para pesquisadores estrangeiros em MH (TBRF-RF 21-135).

Conflitos de interesse: Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Referências

1. Li, XD; Wu, J.; Gao, D.; Wang, H.; Sol, L.; Chen, ZJ Papéis principais da sinalização cGAS-cGAMP na defesa antiviral e efeitos imunoadjuvantes. Ciência 2013, 341, 1390–1394. [CrossRef] [PubMed]

2.Ansari, MA; Dutta, S.; Veettil, MV; Dutta, D.; Iqbal, J.; Kumar, B.; Roy, A.; Chikoti, L.; Singh, VV; Chandran, B. O reconhecimento do genoma do herpesvírus induziu a acetilação do IFI16 nuclear é essencial para sua translocação citoplasmática, inflamassoma e respostas de IFN-. PLoS Pathog. 2015, 11, e1005019. [CrossRef] [PubMed]

3. Orzalli, MH; Broekema, NM; Jantar, BA; Hancks, DC; Elde, NC; Cristea, IM; Knipe, a estabilização do IFI16 mediada por DM cGAS promove sinalização inata durante a infecção pelo vírus herpes simplex. Processo. Nacional. Acad. Ciência. EUA 2015, 112, E1773–E1781.[CrossRef] [PubMed]

4. Woodward, JJ; Iavarone, AT; Portnoy, DA c-di-AMP secretado por Listeria monocytogenes intracelular ativa uma resposta de interferon tipo I do hospedeiro. Ciência 2010, 328, 1703–1705. [CrossRef] [PubMed]

5. Dou, Z.; Ghosh, K.; Vizioli, MG; Zhu, J.; Sen, P.; Wangensteen, KJ; Simithy, J.; Lan, Y.; Lin, Y.; Zhou, Z.; e outros. A cromatina citoplasmática desencadeia inflamação na senescência e no câncer. Natureza 2017, 550, 402–406. [RefCruz]

6.Takahashi, A.; Saque.; Okada, R.; Kamachi, F.; Watanabe, Y.; Wakita, M.; Watanabe, S.; Kawamoto, S.; Miyata, K.; Barbeiro, GN; et al.A regulação negativa de DNases citoplasmáticas está implicada no acúmulo de DNA citoplasmático e SASP em células senescentes. Nat.Commun. 2018, 9, 1249. [CrossRef]

7. McArthur, K.; Whitehead, LW; Huddleston, JM; Li, L.; Padman, BS; Oorschot, V.; Geoghegan, ND; Chappaz, S.; Davidson, S.; Chin, HS; e outros. Os macroporos BAK / BAX facilitam a hérnia mitocondrial e o efluxo de mtDNA durante a apoptose. Ciência 2018.359, eaao6047. [RefCruz]

8. Matsui, H.; Ito, J.; Matsui, N.; Uechi, T.; Onodera, O.; Kakita, A. O dsDNA citosólico de origem mitocondrial induz citotoxicidade e neurodegeneração em modelos celulares e de peixe-zebra da doença de Parkinson. Nat. Comum. 2021, 12, 3101. [CrossRef]

9. Sliter, DA; Martinez, J.; Hao, L.; Chen, X.; Sol, N.; Tara, D.; Fischer, TD; Burman, JL; Li, Y.; Zhang, Z.; e outros. Parkin e PINK1 atenuam a inflamação induzida por STING. Natureza 2018, 561, 258–262. [RefCruz]

10. Hou, Y.; Wei, Y.; Lautrup, S.; Yang, B.; Wang, Y.; Cordonnier, S.; Mattson, deputado; Croteau, DL; Bohr, VA A suplementação de NAD(+) reduz a neuroinflamação e a senescência celular em um modelo de camundongo transgênico da doença de Alzheimer via cGAS-STING. Processo. Nacional.Acad. Ciência. EUA 2021, 118, e2011226118.

For more information:1950477648nn@gmail.com