A proteína secretora conservada rica em cisteína MaCFEM85 interage com MsWAK16 para ativar as defesas das plantas

Abstrato: Metarhizium anisopliaeé um fungo entomopatogênico que pode aumentar o crescimento e a resistência das plantas quando atua como endófito nas plantas hospedeiras. No entanto, pouco se sabe sobre as interações proteicas ou seus mecanismos de ativação. Proteínas comuns na membrana extracelular de fungos (CFEM) foram identificadas como reguladores imunológicos de plantas que suprimem ou ativam respostas de resistência de plantas. Aqui, identificamos uma proteína contendo o domínio CFEM, MaCFEM85, que estava localizada principalmente na membrana plasmática. Os ensaios de dois híbridos de levedura (Y2H), glutationa-S-transferase (GST) e complementação de fluorescência bimolecular demonstraram que MaCFEM85 interagiu com o domínio extracelular de umMedicago sativa(alfafa) proteína de membrana, MsWAK16. Análises de expressão gênica mostraram que MaCFEM85 e MsWAK16 foram significativamente regulados positivamente emM. anisopliaeeM. sativa, respectivamente, de 12 a 60 horas após a coinoculação. Ensaios adicionais de dois híbridos de levedura e mutação específica do local de aminoácidos indicaram que o domínio CFEM e a 52ª cisteína foram especificamente necessários para a interação de MaCFEM85 com MsWAK16. Ensaios de função de defesa mostraram que o JA foi regulado positivamente, mas o tamanho da lesão de Botrytis cinerea e a reprodução de Myzus persicae foram suprimidos pela expressão transitória de MaCFEM85 e MsWAK16 na planta hospedeira modelo Nicotiana benthamiana. Coletivamente, esses resultados fornecem novos insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes às interações de M. anisopliae com plantas hospedeiras.

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Palavras-chave: quinase associada à parede; CFEM; Metahizium anisopliae; imunidade vegetal; Medicago sativa

1. Introdução

As interações entre plantas e micróbios são generalizadas e são o resultado de coevoluções passadas e contínuas. Essas interações podem ter resultados benéficos, neutros ou adversos para cada participante [1–3]. A microbiota rizosférica benéfica pode melhorar o crescimento das plantas e melhorar a saúde geral, protegendo contra doenças transmitidas pelo solo ou melhorando a absorção de nutrientes [4,5]. Uma ampla gama de micróbios benéficos pode melhorar as capacidades das plantas, como absorção de nutrientes, crescimento e defesas contra patógenos e insetos [6,7]. Metarhizium Sorok¯ın é um gênero importante de fungos entomopatogênicos com a capacidade de colonizar plantas [8], mas também há evidências que sugerem que membros do gênero podem aumentar a resistência a patógenos de plantas. Por exemplo, um estudo de laboratório encontrou 60% de inibição de Fusarium solani (Mart.) Sacc. na presença de Metarhizium robertsii (anteriormente conhecido como M. anisopliae) em comparação com controles sem M. robertsii [9]. Algumas cepas de Metarhizium têm o potencial de melhorar a resistência das plantas a pragas e doenças de insetos, alterando a expressão dos genes de defesa das plantas. A colonização endofítica com M. Roberts ativa a expressão das vias de defesa do ácido jasmônico (JA) e do ácido salicílico (SA) nas folhas de milho; além disso, tal colonização está associada à promoção do crescimento das plantas e à supressão do desenvolvimento larval de Agrotis epsilon (Hufnagel) [10]. Metarhizium guizhouense ativou a -1,3-glucanase e quitinase na casca da fruta de Lansium parasiticum resultando na inibição do crescimento de Botrytis sp. e Fusarium sp. no fruto de Aglaia dookkoo Griff [11]. Além disso, quando M. anisopliae foi aplicado a mudas de amendoim, uma variedade de fatores de transcrição, incluindo WRKYs, MYCs, TGAs e fatores de transcrição responsivos ao etileno, foram ativados, enquanto transportadores de nitrato e proteínas que se ligam a elementos responsivos à desidratação também foram expressos diferencialmente [12] . Isto sugere que M. anisopliae regula os genes de defesa das plantas à medida que coloniza a planta. No entanto, relativamente pouco se sabe sobre os mecanismos subjacentes às respostas de defesa das plantas após a infecção por Metarhizium. Os efetores são um meio comum pelo qual os microrganismos regulam a resistência das plantas [13]. A ativação da resistência das plantas é geralmente caracterizada por uma explosão oxidativa e pela indução de hormônios, metabólitos e outros sinais [13]. Os hormônios vegetais SA e JA desempenham papéis importantes na indução da resistência das plantas, mediando duas vias separadas de sinalização de defesa [14]. A via de sinalização SA funciona principalmente na resposta alérgica das plantas e na resistência sistêmica adquirida a patógenos, mas também pode estar envolvida nas respostas indiretas de defesa das plantas induzidas pela alimentação de insetos que picam [15]. O acúmulo de SA está associado ao aumento da expressão de genes que codificam proteínas de transferência lipídica (LTPs) e fenilalanina amônia-liase (PAL) (16), que medeiam a síntese e acúmulo de metabólitos especializados a jusante, como flavonóides e lignina (17). A via de sinalização JA funciona em respostas diretas e indiretas a danos mecânicos, patógenos fúngicos e pragas de insetos. Estudos demonstraram que a sinalização de JA tem um efeito regulador na síntese de metabólitos especializados, como terpenóides, fenilpropanóides e alcalóides, que possuem uma ampla gama de funções biológicas [18]. Foi demonstrado que alguns metabólitos especializados se acumulam nas células vegetais após o tratamento com metilJA (MeJA), incluindo paclitaxel em espécies de Taxus [19,20], terpenóides em Centella Asiatica (L.) Urban [21] e saponinas em ginseng [22] . A aplicação de SA e quitosana (CHT) como elicitores induziu acúmulo de lignina e reações enzimáticas de defesa em tomates, o que reduziu a incidência de infecção por Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi [23]. Além disso, os níveis de JA e SA no trigo foram significativamente acumulados pela aplicação do elicitor PeaT, melhorando a resposta de defesa ao pulgão da aveia Sitobion avenae (Fabricius) [24]. Isto indica que a imunidade das plantas pode ser regulada por estes efetores através de hormônios e metabólitos vegetais.

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Comuns nas proteínas da membrana extracelular fúngica (CFEM), estão presentes em uma ampla gama de fungos. Eles codificam domínios que geralmente têm 60 aminoácidos (aa) de comprimento e contêm oito cisteínas caracteristicamente espaçadas [25]. Os domínios CFEM são semelhantes aos domínios semelhantes ao fator de crescimento epidérmico (EGF), que funcionam como receptores extracelulares, transdutores de sinal ou moléculas de adesão nas interações hospedeiro-patógeno [26]. Proteínas contendo domínios CFEM podem manipular a resposta de resistência das plantas agindo como efetores. No fungo da ferrugem da folha do trigo, Puccinia triticina Erikas, o candidato efetor CFEM PTTG_08198 acelerou o progresso da morte celular e promoveu o acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) [27]. O fungo antracnose Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils contém cinco efetores (CgCFEM6, 7, 8, 9 e 15) que demonstraram suprimir a morte celular programada induzida por BAX em Nicotiana benthamiana Domin (28). Foi relatado que o fungo micorrízico fitossimbiótico Laccaria bicolor (Maire) PDOrton secreta várias proteínas CFEM, como Lac310796, Lac296573 e Lac296572, em tecidos simbióticos [29]. Embora as funções complexas destas proteínas não tenham sido mais estudadas na simbiose micorrízica, resultados anteriores sugerem que as proteínas CFEM podem funcionar na sinalização entre fungos e plantas. M. anisopliae pode funcionar como fungo entomopatogênico ou endofítico em uma planta hospedeira [30]. No entanto, os papéis das proteínas CFEM ainda não foram relatados. Identificamos anteriormente uma proteína contendo o domínio CFEM em M. anisopliae, MaCFEM85 (GenBank ID: MZ682609) [31]. Aqui, relatamos a relação entre o MaCFEM85 e a quinase associada à parede do Medicago sativa, MsWAK16. Analisamos a sequência MaCFEM85 e conduzimos experimentos para determinar quais resíduos são críticos para a interação com MsWAK16. Finalmente, utilizando N. benthamiana como planta modelo, avaliamos as respostas de defesa das plantas a Botrytis cinerea e ao pulgão Myzus persicae com e sem expressão transitória de MaCFEM85 e MsWAK16.

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2. Resultados

2.1. MaCFEM85 foi mais intimamente relacionado a CFEMs fúngicos não patogênicos e localizado na membrana plasmática

Uma árvore filogenética foi construída para analisar as relações entre MaCFEM85 e outras proteínas CFEM de fungos modelo patogênicos e não patogênicos. Estes incluíram Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl)., Neurospora crassa Shear & BODodge e Beauveria bassiana (Bals.) (ver Secção 4). O MaCFEM85 estava mais intimamente relacionado às proteínas CFEM em B. bassiana e, portanto, evolutivamente mais próximo dos fungos não patogênicos do que dos patogênicos (Figura 1a).

Figura 1a

2.2. MaCFEM85 foi regulado positivamente durante interações com M. sativa

As quinases semelhantes a receptores associados à parede (WAKs) representam um subgrupo dentro da superfamília de proteínas quinases semelhantes a receptores (RLKs) e incluem um domínio extracelular, uma hélice transmembrana e um domínio quinase intracelular. Eles desempenham um papel importante na regulação do crescimento, desenvolvimento das plantas, resposta ao estresse e vias de sinalização de resistência a patógenos [32]. O RNA foi extraído de hifas de M. anisopliae e raízes de M. sativa após co-incubação para investigar os padrões de expressão de MaCFEM85 e MsWAK16. Tanto MaCFEM85 quanto MsWAK16 foram expressos em níveis significativamente mais altos durante a co-incubação de 12 a 60 h (Figura 1c,d). De 0 a 36 horas, a expressão de MaCFEM85 aumentou gradualmente, atingindo o pico às 36 horas. Foi × 593 vezes mais expresso na combinação de M. anisopliae e M. sativa em comparação com M. anisopliae cultivada sozinha. Embora a expressão de MaCFEM85 tenha diminuído ligeiramente no período de 48-60 horas, ainda foi expressa em níveis significativamente mais elevados do que em M. anisopliae cultivada isoladamente. MsWAK16 também foi significativamente regulado positivamente, com pico de expressão às 36 h. Em M. sativa infectada com M. anisopliae, o MsWAK16 foi × 89,06 vezes mais expresso do que em M. sativa sem M. anisopliae. De 36 a 60 h, os níveis de MsWAK16 diminuíram ligeiramente, mas sua expressão ainda foi significativamente maior do que nas plantas não inoculadas.

2.3. MaCFEM85 interage com MsWAK16 in vitro e in vivo

Para investigar o potencial mecanismo funcional do MaCFEM85 em resposta ao tratamento com M. anisopliae, foi realizada uma triagem de dois híbridos de levedura (Y2H) para identificar preliminarmente proteínas hospedeiras que interagem com o MaCFEM85. A interação entre o domínio extracelular de MsWAK16 (MsWAK 16- ED) e MaCFEM85 foi examinada com um ensaio de dois híbridos de levedura um para um usando MaCFEM85 em pGBKT7 como vetor BD e MsWAK16 em pGADT7 como vetor AD. Todas as leveduras transformadas cresceram bem em meio deficiente em SD-T/L, e o grupo de controle positivo e o grupo experimental cresceram com sucesso em meio deficiente em SD-T/L/H/A + X- -gal. Isso indicou que MaCFEM85 poderia interagir com MsWAK16-ED (Figura 2a).

Figura 2. Validação da interação entre MaCFEM85 e MsWAK16.

Para validação in vitro, MsWAK16-ED marcado com glutationa-S-transferase (GST) (codificando um produto de 60 kDa) foi inserido em pGEX6-P2 e MaCFEM85 marcado com polihistidina (His) ( codificando um produto de 17 kDa) foi inserido em pET-21b. A imunotransferência com anticorpos His e GST mostrou que a proteína recombinante MaCFEM85-His interagiu com a presa GST-MsWAK16-ED, mas não apenas com GST e que GST-MsWAK16- ED interagiu com His -MaCFEM85 (Figura 2b). Para confirmar ainda mais a interação entre MaCFEM85 e MsWAK16, realizamos um ensaio de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) com construções MaCFEM85-YFPN e MsWAK16-YFPC. A coexpressão de MaCFEM85-YFPN e MsWAK16-YFPC em folhas de tabaco gerou um sinal de fluorescência amarelo, indicando que MaCFEM85 interagiu com MsWAK16 (Figura 2c).

2.4. Principais sites para interações MaCFEM85 e MsWAK16

Para definir a região do MaCFEM85 necessária para a interação com o MsWAK16-ED, os domínios proteicos foram previstos com o software online SMART (Figura 3a). MaCFEM85 continha um domínio CFEM na região 19-86 aa. A estrutura terciária também foi prevista (Figura 3b). As oito cisteínas neste domínio resultaram em quatro ligações dissulfeto (CYS26 e CYS69, CYS30 e CYS64, CYS43 e CYS50 e CYS52 e CYS85), mantendo a estabilidade da proteína (Figura 3b). Para validar o(s) local(is) de interação putativo(s) em MaCFEM85, sete versões mutadas da proteína foram geradas e inseridas em pGBKT7 como proteínas de isca. Cada vetor recombinante foi co-transfectado com AD-MsWAK16-ED na cepa Y2H Gold. A cepa com CYS52 mutado não cresceu em meio seletivo (Figura 3c, delineado em vermelho), indicando que CYS52 é necessário para a interação de MaCFEM85 com MsWAK16-ED.

2.5. A interação do MaCFEM85 com o MsWAK16 ativa a resposta imunológica da planta

2.5.1. Avaliando o papel de MaCFEM85 e MsWAK16 na resistência a doenças contra B. cinerea

Para explorar o possível envolvimento de MaCFEM85 e MsWAK16 nas respostas de defesa de patógenos, examinamos se a superexpressão de MaCFEM85, MsWAK16 ou MaCFEM85 e MsWAK16 poderia conferir maior resistência a B. cinerea. Expressamos transitoriamente esses vetores em folhas de N. benthamiana. Um ensaio Western blot mostrou que MaCFEM85 e MsWAK16 foram expressos em níveis comparáveis ​​quando foram expressos isoladamente ou em conjunto, o que mostra que MaCFEM85 e MsWAK16 foram expressos com sucesso no tabaco (Figura 4a). Os ensaios de doenças também foram realizados usando N. benthamiana infiltrada com MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 ou o controle GFP. As lesões foram significativamente menores (em ~30% aos 2 dias após a inoculação) nas folhas infiltradas com MaCFEM85, MsWAK16 ou MaCFEM85+MsWAK16 em comparação com as plantas de controle (Figura 4b). Estes dados demonstram que a expressão transitória de MaCFEM85 em N. benthamiana conferiu maior resistência a B. cinerea e que MaCFEM85 e MsWAK16 regularam positivamente a resposta de defesa contra B. cinerea.

Figura 3. Identificação do sítio de interação entre MaCFEM5 e MsWAK16.

Figura 4. Indução de resistência de plantas pela expressão transitória de MaCFEM85 e MsWAK16.

2.5.2. Avaliando o papel de MaCFEM85 e MsWAK16 na defesa contra pulgões em N. benthamiana

Para investigar melhor o papel de MaCFEM85 e MsWAK16, as plantas de N. benthamiana que expressam transitoriamente MaCFEM85 e MsWAK16 foram infestadas com M. persicae, e as populações foram avaliadas. Para este experimento, uma grande área de cada folha de N. benthamiana foi agroinfiltrada com o vetor binário recombinante pYBA1132 contendo MaCFEM85 e MsWAK16. GFP foi usado como controle. Às 12 horas após a infiltração, 20 adultos de M. persicae foram enjaulados em cada folha, expondo a área infiltrada aos pulgões. Nos três dias seguintes, foram registradas a mortalidade de pulgões adultos e o número de ninfas; as ninfas foram então removidas. Não houve diferença significativa no risco de mortalidade entre populações de M. persicae alimentando-se de plantas que expressam MaCFEM85, MsWAK16 ou MaCFEM85+MsWAK16 (χ2=3.65827, DF=3, p < 0,30081 ) (Figura 4c). No entanto, às 24, 48 e 72 h, o número médio de progênie produzida por cada pulgão adulto foi significativamente maior em N. benthamiana expressando o controle GFP em comparação com aqueles expressando MaCFEM85, MsWAK16 ou MaCFEM85+MsWAK16 (Figura 4d).

2.5.3. Avaliando o papel de MaCFEM85 e MsWAK16 no acúmulo hormonal e na expressão gênica relacionada a hormônios

Para analisar as diferenças entre as respostas de defesa de plantas de N. benthamiana que expressam eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 e MaCFEM85+MsWAK16, medimos os níveis de JA, SA e flavonóides totais, e a expressão de genes relacionados. Os resultados mostraram que os níveis de JA e SA diferiram entre plantas que expressam eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 e MaCFEM85+MsWAK16 (Figura 5a). Em comparação com aqueles que expressam eGFP, os níveis de JA foram significativamente mais baixos nas plantas que expressam MaCFEM85; Os níveis de SA aumentaram ligeiramente, mas as diferenças não foram significativas. Em contraste, as plantas que expressam MsWAK16 não mostraram diferenças significativas nos níveis de JA em comparação com o controlo eGFP, enquanto os níveis de SA foram significativamente mais baixos do que no controlo (Figura 5a). Os níveis de JA e SA aumentaram e diminuíram significativamente, respectivamente, em plantas que expressam MaCFEM85+MsWAK16 em comparação com eGFP.

Figura 5. Níveis hormonais e expressão gênica de resposta hormonal

O conteúdo total de flavonóides foi significativamente maior nas plantas que expressam MaCFEM85+MsWAK16 em comparação com todos os outros grupos de tratamento (Figura 5a). Os níveis de expressão gênica biossintética foram semelhantes em plantas que expressam MsWAK16 e MaCFEM85+MsWAK16. Por exemplo, os genes relacionados com a resposta JA, nomeadamente COI1, MYC2 e PDF1.2, foram significativamente regulados positivamente em comparação com plantas que expressam GFP (Figura 5b). Da mesma forma, os genes relacionados ao SA NPR1, WRKY70 e PR1 foram expressos de forma significativamente diferencial em plantas que expressam MsWAK16 e MaCFEM85+MsWAK16; NPR1 foi regulado positivamente, enquanto WRKY70 e PR1 foram regulados negativamente em comparação com o controle (Figura 5b). Também examinamos a expressão de genes-chave nas vias de síntese do ácido shiquímico e dos fenilpropanóides, ambos relacionados à síntese de flavonóides. Em geral, a expressão de MaCFEM85 por si só não induziu uma expressão significativamente maior destes genes no tabaco. No entanto, esses genes foram regulados positivamente no tabaco que expressa MsWAK16 ou MsWAK16+MaCFEM85 em comparação com o controle GFP (Figura 5c).

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3. Discussão

3.1. O motivo da proteína CFEM conservado desempenha múltiplas funções em espécies de fungos

O domínio CFEM é exclusivo dos fungos e comumente ocorre nas proteínas da membrana extracelular dos fungos. O domínio originou-se no ancestral comum mais recente de Ascomycota e Basidiomycota [33]. Pesquisas recentes mostraram que as proteínas CFEM em patógenos fúngicos podem atuar como reguladores imunológicos das plantas, causando supressão ou ativação imunológica da planta hospedeira, dependendo do tipo de infecção [28,34,35]. Houve poucos relatos de proteínas contendo o domínio CFEM em M. anisopliae, apenas no contexto de uma comparação evolutiva com outros fungos (36). Neste estudo, comparamos proteínas CFEM de M. anisopliae com outras proteínas CFEM conhecidas em fungos patogênicos e não patogênicos. Confirmamos que o homólogo mais próximo do MaCFEM85 é o Cfem5 encontrado em Beauveria bassiana, uma das 12 proteínas CFEM dessa espécie (Figura Suplementar S1). BbCfem5 é essencial para aquisição de ferro [37]. Além disso, com base na estrutura terciária prevista, o domínio CFEM em MaCFEM85 é muito semelhante à Proteína de Antígeno de Superfície 2 (CSA2) encontrada em Candida albicans (CPRobin) Berkhout, na qual 65 resíduos (96% da sequência) foram modelados com 99,8. % de confiança [31]. Candida albicans é um patógeno animal; O CSA2 desempenha um papel importante no crescimento e na patogenicidade, extraindo o heme da hemoglobina e transportando o heme da parede celular para o plasma [38–40]. Nossa hipótese é que MaCFEM85 pode estar envolvido na virulência de M. anisopliae em insetos hospedeiros. Estas funções combinadas do MaCFEM85 na infecção patogênica animal e na ativação da imunidade das plantas tornam a proteína um interessante foco de pesquisa futura.

3.2. Ligações dissulfeto são estruturas importantes para a função proteica

A integridade conformacional de uma estrutura proteica está diretamente relacionada à sua capacidade de funcionamento. As ligações dissulfeto formadas por pares de cisteína promovem o dobramento de proteínas e a estabilidade conformacional e são consideradas locais-chave para reconhecimento e ligação de receptores ou ligantes específicos (41). Por exemplo, a ruptura de qualquer uma das três ligações dissulfeto conservadas na proteína efetora AVR4 do patógeno vegetal Cladosporium fulvum resulta em sensibilidade à protease e capacidade reduzida de ligação à quitina [42]. Em três outras proteínas de C. fulvum (ECP1, ECP2 e ECP5), substituições únicas de alaninas por cisteínas amortecem a resposta de hipersensibilidade do tomate, indicando que as cisteínas são críticas para manter a estabilidade e a atividade indutora de resposta de hipersensibilidade [43]. Além disso, na proteína madura MC69 de Magnaporthe oryzae, a mutagênese de dois resíduos conservados de cisteína (Cys36 e Cys46) pode prejudicar a função do MC69 sem afetar a secreção, sugerindo a importância da ligação dissulfeto especificamente na patogenicidade do MC69 (44). O domínio CFEM parece ser semelhante em tamanho e no padrão de resíduos de cisteína aos domínios semelhantes a EGF, que contêm três ou quatro pares de ligações dissulfureto. As proteínas EGF podem funcionar como receptores de superfície celular, transdutores de sinal ou moléculas de adesão nas interações hospedeiro-patógeno [45]. Neste estudo, não apenas descobrimos que o domínio CFEM do MaCFEM85 continha oito cisteínas conservadas que formavam quatro pares de ligações dissulfeto (Figura 3b), mas também validamos que o CFEM era o domínio crítico para a interação entre MaCFEM85 e MsWAK16. Além disso, através da mutação dirigida ao local de resíduos de cisteína em alanina, descobrimos que o resíduo de cisteína na posição 52 era o sítio central necessário para a interação (Figura 3c). Estes resultados fornecem uma base para estudos adicionais das funções fisiológicas da interação CFEM85 – WAK16.

3.3. A interação do MaCFEM85 com as defesas vegetais ativadas pelo MsWAK16

Nas interações microbianas-plantas, as respostas de defesa das plantas são geralmente ativadas por proteínas efetoras microbianas. A defesa induzida está se tornando uma ferramenta importante no controle biológico de pragas para promover resistência. As proteínas CFEM foram identificadas como efetoras envolvidas na regulação da ativação ou inibição imunológica das plantas [28,46]. No entanto, há uma escassez de pesquisas publicadas que liguem a regulação desses fatores imunológicos aos seus papéis específicos nas doenças das plantas e na resistência aos insetos. Neste estudo, utilizamos um fungo entomopatogênico e endofítico, M. anisopliae, para identificar uma interação entre MaCFEM85 e uma quinase associada à parede celular, MsWAK16, em M. sativa. Os resultados mostraram que esta interação reduziu a proporção de lesões após a inoculação com B. cinerea (Figura 4b) e diminuiu a taxa de crescimento populacional de M. persicae (Figura 4d), indicando que a interação entre MaCFEM85 e MsWAK16 aumentou a resistência de M. sativa a pulgões. Mudanças nos níveis de JA, SA e etileno (ET) podem ser usadas como marcadores para avaliar a indução de resistência das plantas [47,48]. Aqui, demonstramos que o MaCFEM85 interagiu com o MsWAK16 para influenciar a resistência das plantas através da regulação hormonal e para inibir a taxa reprodutiva de M. persicae (Figura 4d). Estudos semelhantes foram relatados anteriormente. Por exemplo, foi demonstrado que a proteína efetora PeBL1 de Brevibacillus laterosporus induz o acúmulo de JA e SA em tomates e diminui a taxa de crescimento das populações de segunda e terceira geração de M. persicae que se alimentaram dessas plantas. Além disso, os tomateiros pulverizados com efetores têm um efeito repelente sobre M. persicae [49]. A aplicação da proteína elicitora PeBC1 ao feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) leva a efeitos subletais pronunciados e significativos em pulgões verdes do pêssego. As plantas tratadas com PeBC1 apresentam uma regulação positiva significativa de genes relacionados a JA e SA (50). O elicitor PeBb1 de Beauveria bassiana reduz a fecundidade de M. persicae no tabaco e induz a expressão de genes relacionados a JA e ET (51). No presente estudo, a expressão transitória de MaCFEM85 e MsWAK16 no tabaco regulou significativamente os genes COI1, MYC2 e PDF1.2 relacionados à resposta de JA (Figura 5b) e aumentou o conteúdo de JA e flavonóides totais (Figura 5a), que foi comparável aos resultados na literatura como descrito acima. No entanto, não detectamos altos níveis de SA no tabaco 12 horas após a infiltração, e as plantas que expressam transitoriamente MsWAK16 ou MaCFEM85+MsWAK16 mostraram níveis de SA significativamente reduzidos e regulação negativa de genes envolvidos na resposta de SA (Figura 5a,b) . Isto demonstrou que a estimulação de diferentes hormonas vegetais pode levar não só a atividades sinérgicas, mas também a crosstalk e feedback, permitindo que as plantas respondam adequadamente a diferentes estímulos. Níveis aumentados de JA, mas níveis baixos de SA foram relatados anteriormente em plantas. Por exemplo, em A. thaliana com defeito para acúmulo de SA, os níveis de JA foram 25- vezes maiores do que em A. thaliana do tipo selvagem, e genes responsivos a JA foram ativados (52). Também foi relatado que algumas bactérias podem aumentar os níveis de JA nas plantas para inibir o acúmulo de SA, evitando os danos causados ​​pelo SA. Por exemplo, Pseudomonas syringae tem como alvo o receptor COI1 através de uma toxina, a coronatina, que regula negativamente a via JA [53]. Isso promove a regulação positiva induzida por MYC dos fatores de transcrição ANAC019, ANAC055 e ANAC072 (54), inibindo a transcrição de ICS1 (um gene chave para a síntese de SA) e, assim, regulando negativamente a produção de SA e a transdução de sinal. No presente estudo, a interação entre MaCFEM85 e MsWAK16 levou ao aumento do acúmulo de JA e à regulação positiva de genes responsivos ao JA, mas à inibição do acúmulo de SA e à transcrição de genes relacionados ao SA. Isto indicou que a interação entre MaCFEM85 e MsWAK16 induziu JA, melhorando assim a resistência das plantas aos pulgões.

Em N. benthamiana expressando transitoriamente MaCFEM85 e MsWAK16, os níveis de JA aumentaram e o tamanho das lesões de B. cinerea diminuiu (Figura 4b), consistente com estudos anteriores. JA está envolvido na resistência das plantas a insetos e patógenos necrotróficos [52,55]. Como patógeno necrotrófico, B. cinerea foi inibido pelo acúmulo de JA e ET (56). No mutante deficiente em ET de A. thaliana ein 2-1 e no mutante de resposta JA coi 1-1, os níveis do gene de defesa a jusante, PDF1.2 foram significativamente reduzidos e a sensibilidade a B. cinerea foi aumentada [ 57]. Descobrimos aqui que o acúmulo de JA e a transcrição de genes relacionados ao JA foram significativamente aumentados em N. benthamiana expressando transitoriamente MaCFEM85 e MsWAK16, enquanto o acúmulo de SA e a transcrição de genes relacionados ao SA foram inibidos. A expressão de MaCFEM85 e MsWAK16 também mostrou efeito inibitório sobre B. cinerea. Isto indicou que o JA foi ativado por MaCFEM85 e MsWAK16 e desempenhou um papel importante na resistência das plantas a B. cinerea.

4. Materiais e Métodos

4.1. Cepas de fungos, materiais vegetais e métodos de cultivo

Cepas isoladas de Metarhizium anisopliae Ma 9 foram cultivadas em meio batata-açúcar-ágar (PSA) (200 g de extrato de batata descascada fervido em água, 20 g de sacarose e 15 g de ágar/L). Pó de esporângio fresco foi coletado após 10 dias. Plantas de Nicotiana benthamiana foram cultivadas em câmara climática artificial com ciclo claro/escuro de 14/10 horas (27/25 ◦C). Para expressão gênica transitória via transformação mediada por Agrobacterium, a cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens foi cultivada em meio Luria Broth (LB) (10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura e 10 g de NaCl/L). A cepa de levedura Gold (OE Biotech Co., Ltd., Xangai, China) foi cultivada em meio de extrato de levedura peptona dextrose (YPDA) (10 g de extrato de levedura, 20 g de peptona, 20 g de glicose e 0,03 g de hemissulfato de adenina / L). Para cada vetor e cepa, foram utilizados antibióticos apropriados, nomeadamente rifampicina, canamicina ou ampicilina (25, 50 ou 50 µg/mL, respectivamente). As cepas e plasmídeos utilizados neste estudo estão listados na Tabela Suplementar S1. As sementes de Medicago sativa foram esterilizadas superficialmente com etanol 75% por 1 min, seguido de NaClO 50% (5,5%) por 15 min. As sementes foram bem misturadas e depois lavadas em água estéril três vezes durante 5 min cada. As sementes foram incubadas a 4 ◦C no escuro por mais de 24 horas e depois germinadas em placas de ágar água a 1% em temperatura ambiente durante a noite. Três dias após a germinação, as mudas em desenvolvimento foram transferidas para papel filtro em placas de Petri estéreis de 9-cm, com 20 mudas por placa. Os tratamentos e controle foram alocados em 15 pratos cada, respectivamente. As mudas foram então irrigadas com 10 mL de suspensão de esporos de M. anisopliae contendo 107/mL, e o controle foi irrigado com 10 mL de água estéril. Nos tempos 0, 12, 24, 48 e 60 h, foi retirada uma seleção aleatória de mudas de três placas de Petri para cada intervalo de tempo. As amostras foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ◦C.

4.2. qRT-PCR e construção de plasmídeo

O RNA total foi extraído de M. anisopliae (hifas) e M. sativa (raízes) com reagente TRIzol (Invitrogen, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante. A qualidade e abundância do RNA resultante foram medidas com um NanoPhotometer® (Implen, Munique, Alemanha). A síntese da primeira cadeia de cDNA (até 2 µg de RNA) foi realizada utilizando 5× All-In-One RT Master Mix (Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Canadá) seguindo as instruções do fabricante. qRT-PCR foi realizado usando 2 × SYBR Green qPCR Master Mix da US EVER BRIGHT ® INC. e o sistema ABI QuantStudio 5 seguindo as instruções do fabricante. Os primers utilizados para cada gene estão listados na Tabela Suplementar S2. Maury [58], Msactin [59] e Nbactin [60] foram usados ​​como genes de referência interna para normalização de dados de expressão. A reação foi realizada nas seguintes condições: 5 min a 95 ◦C, seguido de 40 ciclos a 95 ◦C por 15 s e a 60 ◦C por 40 s. Houve três réplicas técnicas para cada amostra. A expressão relativa foi calculada usando o método 2−∆∆Ct [61]. A significância estatística foi determinada usando uma análise de variância unidirecional (ANOVA) e o teste de faixa múltipla de Duncan no SPSS v20.0 (SPSS).

4.3. Expressão Transitória de Proteínas em N. benthamiana

A sequência de codificação MaCFEM85 (CDS) foi amplificada com DNA polimerase de ultra-fidelidade usando cDNA como modelo. Para os ensaios de localização subcelular, os produtos de PCR contendo o CDS para MaCFEM85 foram clonados em pYBA1132-eGFP (digerido com EcoRI e SalI) e pcambia1300-cereja (EcoRI e SacI), respectivamente. Todas as construções foram validadas com sequenciamento (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Pequim, China). Os primers utilizados neste estudo estão listados na Tabela Suplementar S2. Para expressão transitória de MaCFEM85-eGFP e MaCFEM85-mCherry em N. benthamiana, a cepa GV3101 de A. tumefaciens foi transformada com cada plasmídeo e verificada com PCR. O Agrobacterium foi cultivado durante a noite a 28 ◦C com agitação. As células foram coletadas através de centrifugação de 5 min a 5000 rpm à temperatura ambiente, lavadas três vezes com água bidestilada estéril e ressuspensas em tampão MgCl2 10 mM (contendo MES 10 mM e acetosiringona 10 mM, pH 5,7). A suspensão de células foi ajustada para uma DO600 de 0,5, depois infiltrada na parte inferior de folhas de N. benthamiana de 4- a 5- semanas de idade com uma seringa de 1-mL. Cada folha foi infiltrada com 50 µL de A. tumefaciens; três folhas foram tratadas por planta e três plantas estavam em cada grupo de tratamento. As folhas tratadas foram coletadas após 30 h e visualizadas com um microscópio confocal Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Alemanha) para determinar a localização subcelular.

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4.4. Análise filogenética

Uma árvore filogenética foi construída usando o método de junção de vizinhos no MEGA X. 1000 réplicas de bootstrap usaram o modelo de distância P. As sequências de aminoácidos usadas para gerar a árvore foram obtidas com pesquisas BLASTP no banco de dados NCBI de fungos relacionados (por exemplo, Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus, Lasiodiplodia theobromae, Gliocladium roseum , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana e Paecilomyces lilacinus) usando MaCFEM85 como consulta.

4.5. Ensaios de dois híbridos de levedura

O sistema Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid (Clontech Laboratories, Inc.; agora Takara Bio USA, Inc.) foi usado para verificar a interação entre MaCFEM85 e MsWAK16. MaCFEM85 sem o peptídeo sinal foi introduzido em pGBKT7 como isca e o domínio extracelular de MsWAK16 (MsWAK16-ED) foi inserido em pGADT7 como presa. A preparação e transformações de células competentes para leveduras foram realizadas usando um Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ (ZYMO Research, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Os plasmídeos da isca e da presa foram co-transformados na cepa de levedura Gold. As interações proteína-proteína foram analisadas com base no crescimento em placas de meio de abandono duplo SD (DDO, SD / -Trp-Leu) e meio de abandono quádruplo SD (QDO, SD / -Trp-Leu-His-Ade).

4.6. Ensaio BiFC

Para gerar as construções BiFC, os vetores pUC-SPYNE e pUC-SPYCE foram linearizados por digestão com BamHI. Os CDSs completos de MaCFEM85 e MsWAK16 foram clonados e inseridos nos plasmídeos linearizados usando uma enzima recombinante para obter as construções MaCFEM85-YFPN e MsWAK16-YFPC. Os plasmídeos contendo MaCFEM85 e MsWAK16 foram cotransformados com vetores vazios como controles negativos (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE e pUC-SPYNE + pUC-SPYCE) . Todos os vetores foram introduzidos em N. benthamiana através de transformação mediada por Agrobacterium como descrito acima. Sinais de fluorescência foram observados em células epidérmicas de folhas usando um microscópio confocal Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Alemanha). Os primers utilizados para construção de vetores estão listados na Tabela Suplementar S2.

4.7. Ensaio suspenso de GST

Para os ensaios suspensos de GST, MsWAK16-ED foi inserido no vetor pGEX-6P-2 e MaCFEM85 foi inserido em pET-21b. As proteínas de fusão purificadas (GST-MsWAK16- ED) e a proteína pGEX-6P-2 sem carga (GST) foram usadas como proteína isca e pET purificado-21 A proteína de fusão b-MaCFEM85 (His-MaCFEM85) foi usada como presa. Os ensaios suspensos de GST foram realizados com o sistema de purificação de proteínas Mag-Beads GST Fusion (Sangon Biotech, Xangai, China) seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, Mag-Beads foram lavadas cinco vezes com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) para liberar o protetor de álcool e 10 mL de GST ou GST-MsWAK16-ED foram então adicionados. As pérolas foram misturadas por inversão à temperatura ambiente durante 30 min. Após a remoção do sobrenadante, as Mag-Beads foram lavadas cinco vezes com 1x PBS. His-MaCFEM85 foi adicionado a Mag-Beads já ligadas com GST, e a mistura foi incubada durante a noite a 4 ◦C com rotação. As contas foram então lavadas cinco vezes com 1x PBS para remover proteínas não ligadas. Posteriormente, as proteínas imobilizadas nas esferas foram separadas por SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de nitrocelulose (100 V, 1 h) e analisadas via Western blot. As membranas foram lavadas três vezes durante 10 min cada com PBS + Tween (PBST). As membranas foram bloqueadas por 2 h em temperatura ambiente com 5% de leite desnatado, depois incubadas com anticorpo monoclonal de camundongo anti-His ProteinFind (TransGen Biotech, Pequim, China) (diluído 1:3000) ou anticorpo monoclonal de camundongo anti-GST ProteinFind por 2 h a 4 ◦C. As membranas foram então imersas em anticorpo IgG (H + L) (HRP) de cabra anti-coelho ProteinFind (TransGen Biotech, Pequim, China) (diluído 1: 5000) durante 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram visualizadas com o kit EasySee® Western Blot (TransGen Biotech, Pequim, China) seguindo as instruções do fabricante.

4.8. Identificação do Site Chave no MaCFEM85

Para determinar o tamanho necessário para a interação de MaCFEM85 com MsWAK16, foi realizada amplificação por PCR para gerar múltiplas formas truncadas de MaCFEM85. O domínio CFEM (MaCFEM85-CFEM; aa resíduos 19–86) e o terminal C sem o domínio CFEM (MaCFEM85-C, aa resíduos 87–170) foram inseridos no vetor pGBKT7 como proteína isca (Tabela Suplementar S1). Outras cinco variantes foram construídas usando síntese de polipeptídeos para transformar cisteína em alanina nas posições 26, 30, 43, 52 e 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆CFEM8543, ∆ CFEM8552 e ∆CFEM858, todos, respectivamente). Essas variantes foram usadas para realizar experimentos Y2H com MsWAK16-ED. As células de levedura transformadas foram testadas quanto ao crescimento em placas SD/-Trp-Leu sintéticas e placas SD/-Trp-Leu-His-Ade contendo X- -Galactosidase (X- -Gal).

4.9. Ensaios de resistência de plantas

Myzus persicae foram obtidos da Henan Quanying Biological Co., Ltd. Uma semana antes do início dos bioensaios, 150 pulgões adultos foram colocados em três plantas de N. benthamiana (50 pulgões por planta). Após 72 h, todos os adultos foram removidos com escova macia e as ninfas foram alimentadas por mais quatro dias antes de serem transferidas para N. benthamiana para os ensaios de desempenho do pulgão.

4.10. Ensaios de desempenho de pulgões

Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) foi utilizado para avaliar o desempenho de M. persicae, a resistência das plantas a doenças contra B. cinerea e a expressão de genes relacionados a hormônios. Agrobacterium carregando pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 ou pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16 foram cultivadas em LB suplementados com antibióticos apropriados por 36 horas a 28 ◦C. As células foram lavadas três vezes e depois ressuspensas em tampão de infiltração (MgCl2 10 mM, MES 10 mM e acetosiringona 100 µM, pH 5,6) até uma DO600 de 0,6. Para co-infecção, as bactérias portadoras de MaCFEM85 e MsWAK16 foram ajustadas para uma DO600 de 1,2 e depois misturadas em volumes iguais. Folhas totalmente expandidas foram infiltradas com bactérias usando seringas sem agulha de 1-mL. Três folhas foram infiltradas em cada planta e cada tratamento foi aplicado em três plantas, totalizando 12 plantas por experimento.

Para os ensaios de desempenho de pulgões, 20 pulgões adultos foram aplicados na área infiltrada de cada folha 12 horas após a aplicação do Agrobacterium. Os pulgões foram confinados em gaiolas de 5 mm de diâmetro. Cada tratamento foi repetido cinco vezes. A mortalidade de pulgões adultos e o número de ninfas recém-postos foram registrados diariamente durante três dias. B. cinerea foi cultivada durante cinco dias no PDAY. Às 12 h após a infiltração de Agrobacterium, o B. cinerea recém-cultivado foi perfurado em um bolo de fungo de 5- mm, e a superfície de crescimento do micélio foi anexada à área de infiltração na superfície da folha. Para facilitar o desenvolvimento da doença, as plantas foram mantidas úmidas, cobrindo-as com filme plástico em bandejas a 22 ◦C para facilitar a progressão da doença. Após 48 h, o progresso da doença foi estimado nas folhas inoculadas medindo o tamanho das lesões. Para quantificar a expressão relativa de genes relevantes, as três folhas infiltradas foram coletadas de cada planta 12 horas após a infiltração, depois congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 graus. Extração de RNA total, síntese de cDNA e qRT-PCR foram realizadas conforme descrito na Seção 3.2. Os níveis de ácido salicílico (SA), ácido jasmônico (JA) e flavonóides foram medidos em 15 folhas de N. benthamiana infiltradas por tratamento. As folhas foram coletadas, congeladas em nitrogênio líquido e depois armazenadas a -80 graus. Os hormônios vegetais foram quantificados usando os kits ELISA de ácido salicíclico vegetal e ácido jasmônico vegetal (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.), e os flavonóides foram quantificados usando o kit de ensaio de flavonóides micro vegetais (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) seguindo as instruções do fabricante.

4.11. Análise Estatística

Os dados foram analisados ​​no SPSS v20.0. Diferenças significativas nos níveis de expressão de MaCFEM85 e MsWAK16 foram determinadas usando um teste t de Student. Diferenças significativas nos níveis de SA, JA e flavonóides foram determinadas usando ANOVA unidirecional e teste de faixa múltipla de Duncan com um limiar de p <0,05.

5. Conclusões

Neste estudo, identificamos e caracterizamos uma nova proteína secretada, MaCFEM85, em M. anisopliae. Verificou-se que é um efetor conservado que pode interagir com MsWAK16 e ativar a resposta de defesa de N. benthamiana. Mostramos que o domínio CFEM e o resíduo de cisteína na posição 52 em MaCFEM85 foram críticos para a interação. Esta interação pode ativar respostas imunológicas relacionadas ao JA e mecanismos resistentes a doenças e resistentes a insetos na planta.

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