O efeito antienvelhecimento do polipeptídeo Velvet Antler depende da modulação da microbiota intestinal e da regulação da via PPAR/APOE4 PARTE 2

3.5 16Análise de predição funcional do gene S rRNA

Usando a análise da via KEGG, as diferenças nas vias metabólicas (genes funcionais) em comunidades microbianas dos diferentes grupos foram investigadas. Caminhos com uma abundância média superior a 0,1 por cento foram selecionados de acordo com os resultados de predição funcional do gene 16S rRNA. Além disso, caminhos com impacto significativo nas diferenças entre grupos foram avaliados por meio de análise de floresta aleatória (Fig. 5). Através da análise KEGG, foram identificadas as seguintes cinco vias com influência significativa na diferença entre os grupos: ko00310 (degradação de lisina), ko00071 (degradação de ácidos graxos), ko00300 (biossíntese de lisina), ko00920 (metabolismo do enxofre) e ko00280 (valina , leucina e degradação de isoleucina). Notavelmente, o valor de ko00071 (degradação de ácidos graxos) ficou em segundo lugar, mas teve um impacto maior em cada grupo.

O glicosídeo de cistanche também pode aumentar a atividade de SOD nos tecidos do coração e do fígado e reduzir significativamente o conteúdo de lipofuscina e MDA em cada tecido, eliminando efetivamente vários radicais reativos de oxigênio (OH-, H₂O₂, etc.) e protegendo contra danos ao DNA causados por radicais OH. Os glicosídeos feniletanóides cistanche têm uma forte capacidade de eliminação de radicais livres, uma capacidade redutora maior do que a vitamina C, melhoram a atividade de SOD na suspensão de esperma, reduzem o conteúdo de MDA e têm um certo efeito protetor na função da membrana espermática. Os polissacarídeos Cistanche podem aumentar a atividade de SOD e GSH-Px em eritrócitos e tecidos pulmonares de camundongos experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactose, bem como reduzir o conteúdo de MDA e colágeno no pulmão e no plasma e aumentar o conteúdo de elastina, têm um bom efeito de eliminação no DPPH, prolongar o tempo de hipóxia em camundongos senescentes, melhorar a atividade de SOD no soro e retardar a degeneração fisiológica do pulmão em camundongos experimentalmente senescentes Com degeneração morfológica celular, experimentos mostraram que Cistanche tem boa capacidade antioxidante e tem potencial para ser um medicamento para prevenir e tratar doenças de envelhecimento da pele. Ao mesmo tempo, o echinacoside em Cistanche tem uma capacidade significativa de eliminar os radicais livres DPPH e tem a capacidade de eliminar espécies reativas de oxigênio e prevenir a degradação do colágeno induzida por radicais livres, e também tem um bom efeito de reparo nos danos causados ​​pelos radicais livres da timina.

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De acordo com as funções previstas da microbiota intestinal, especulamos que o comprometimento cognitivo do envelhecimento causado por Dgal pode estar relacionado ao metabolismo anormal de ácidos graxos in vivo.

3.6 Influência da VAP na via do metabolismo dos ácidos graxos

ults, especulamos que o envelhecimento induzido por D-gal e o consequente comprometimento cognitivo podem estar associados ao metabolismo anormal de ácidos graxos. Com base nessa hipótese, selecionamos as principais enzimas envolvidas na oxidação de ácidos beta-graxo, como ACOX1 e CPT1A, e os principais reguladores PPAR e APOE4 para análise de western blot.

Conforme mostrado na Fig. 6A, B, os níveis de expressão de proteína de PPAR , ACOX1 e CPT1A no grupo modelo foram significativamente menores do que no grupo controle (P <0.01, P < {{10}}.05). Em contraste, em comparação com o grupo modelo, os níveis de expressão de proteína de PPAR, ACOX1 e CPT1A no grupo VAP1 foram significativamente maiores (P <{{20}},05). Além disso, os níveis de expressão de proteína de PPAR , ACOX1 e CPT1A também foram significativamente maiores no grupo VAP2 do que no grupo modelo (P < 0,05, P < 0,01). Além disso, o nível de proteína APOE4 no grupo modelo foi significativamente aumentado em comparação com o observado no grupo controle (P < 0,01). No entanto, a expressão de APOE4 nos grupos VE e VAP2 foi significativamente reduzida em comparação com a observada no grupo modelo (P < 0,05). Esses resultados indicam que a VAP pode reduzir a expressão da proteína APOE4 em tecidos cerebrais de camundongos.

Conforme mostrado na Fig. 6C, em comparação com o grupo de controle, os níveis de FFA no grupo modelo foram significativamente maiores (P <0.01). Em comparação com o grupo modelo, os níveis de FFA nos grupos VE, VAP1 e VAP2 foram significativamente menores (P <0.01, P < 0,05). Esses resultados mostram que o VAP reduziu os níveis de FFA no tecido cerebral de camundongos idosos e, quanto maior a dose, mais óbvio o efeito.

O conteúdo de ATP do tecido cerebral do camundongo foi analisado para determinar o efeito de VAP no conteúdo de ATP. Conforme mostrado na Fig. 6D, o conteúdo de ATP no grupo modelo foi significativamente menor do que o observado no grupo controle (P < 0.01). O tratamento com D-gal reduziu o conteúdo de ATP no tecido cerebral de camundongos. Em comparação com o grupo modelo, o tratamento com VAP e VE aumentou significativamente o conteúdo de ATP no tecido cerebral de camundongos (P < 0,01).

4. Discussão

O envelhecimento é marcado por mudanças nas funções fisiológicas do cérebro. O envelhecimento cerebral é acompanhado por distúrbios de aprendizagem e memória [23], e o hipocampo desempenha um papel central no processo de memória. O teste MWM é um dos métodos clássicos utilizados para detectar alterações na etologia na capacidade de aprendizagem e memória [24]. Os resultados comportamentais mostraram que distúrbios de aprendizagem e memória induzidos por D-gal ocorreram em camundongos, com o comportamento dos camundongos demonstrando alterações associadas à senescência. Notavelmente, a administração de VAP melhorou significativamente a capacidade cognitiva de camundongos idosos. Além disso, a coloração H&E e os resultados TEM revelaram que o número de neurônios no grupo modelo diminuiu e sua morfologia era anormal. Juntos, esses resultados sugerem que o VAP pode proteger a microestrutura dos neurônios e melhorar o comprometimento cognitivo em camundongos com envelhecimento induzido por D-gal.

O envelhecimento é uma etapa inevitável do processo da vida, durante o qual o corpo experimenta vários graus de dano, levando à ocorrência de doenças neurodegenerativas e ao consequente comprometimento do aprendizado e das funções cognitivas. O acúmulo excessivo de espécies reativas de oxigênio (ROS) também está intimamente associado ao envelhecimento [25, 26]. Normalmente, as ROS estão envolvidas na fosforilação de proteínas em várias redes do sistema de transporte. No entanto, quando os níveis de ROS são excessivos, ocorre a peroxidação lipídica, resultando em dano oxidativo [27, 28]. Como enzimas antioxidantes importantes no corpo, SOD, CAT e GSH-Px protegem as células contra danos ao eliminar os radicais livres [29]. A SOD pode catalisar a redução de O 2− em peróxido de hidrogênio (H2O2), regular os níveis de ROS e grupos reativos de nitrogênio (RNS) e reduzir o dano celular [30]. CAT catalisa a decomposição de H2O2 em água e oxigênio, reduz a concentração de H2O2, acelera a remoção de O2− e reduz os danos de H2O2 ao corpo. Como um dos produtos da reação de peroxidação lipídica das biomembranas, a concentração de MDA reflete o grau de dano ao organismo [31]. GSH-Px atua como uma enzima de decomposição de peróxido que reduz o dano celular induzido por peróxido. Os resultados mostraram que as atividades de SOD, GSHPx, CAT e outras enzimas antioxidantes no grupo modelo diminuíram. Ao mesmo tempo, o conteúdo de MDA aumentou, o que é consistente com os achados de estudos anteriores [32]. Também observamos que sob a administração de VAP, as atividades de enzimas antioxidantes como SOD, GSH-Px e CAT nos tecidos séricos de camundongos foram significativamente melhoradas, e o nível de peróxido lipídico MDA foi significativamente reduzido. O VAP é rico em componentes funcionais antioxidantes [33] que podem efetivamente remover os radicais livres e peróxidos acumulados durante o processo de envelhecimento, impactando positivamente o processo de envelhecimento.

A microbiota intestinal, também conhecida como "segundo genoma", tem sido cada vez mais associada à saúde humana [34]. De fato, com o recente aumento no número de estudos sobre esse tópico, o importante papel da microbiota intestinal no corpo tem sido amplamente reconhecido [35]. Combinamos experimentos comportamentais com tecnologia de sequenciamento de alto rendimento e observamos que a administração de VAP melhorou significativamente as habilidades de aprendizado e memória de camundongos idosos. A análise da diversidade alfa da flora intestinal de camundongos em cada grupo não mostrou diferença significativa na diversidade alfa da flora intestinal de camundongos entre o grupo modelo e cada grupo de tratamento. Os resultados do PCA mostraram que D-gal induziu um grande desvio no tipo de flora em camundongos idosos. A administração de VAP causou um aumento na similaridade do tipo de flora observada entre camundongos idosos e normais. Por exemplo, em nível de gênero, o VAP aumentou significativamente a abundância de Lactobacillus benéficos. Vale a pena notar que os probióticos Lactobacillus demonstraram proteger a função cognitiva e melhorar o metabolismo lipídico.

Com base nas funções previstas dos genes funcionais do gene 16S rRNA, os resultados da análise KEGG [36] destacaram a via de degradação de ácidos graxos. Especulamos que o envelhecimento causado pelo D-gal pode estar relacionado ao metabolismo anormal dos ácidos graxos no organismo. Os ácidos graxos são importantes componentes estruturais e fontes de energia do corpo, e seu conteúdo é afetado pelas taxas de decomposição e síntese [37]. Como o cérebro é rico em lipídios [38], este órgão é particularmente sensível ao OS devido à sua baixa capacidade de eliminação de radicais livres e fraco ambiente antioxidante. Estudos clínicos demonstraram que o acúmulo de ácidos graxos saturados de cadeia extremamente longa aumenta em pacientes com defeitos na peroxidase oxidase. Ao mesmo tempo, esses pacientes sofrem de comprometimento da função cerebral e comprometimento cognitivo [39]. Probióticos intestinais, como Lactobacillus, ajudam a regular a função cerebral e o comportamento [40]. Através da regulação do sistema imunológico neuroendócrino, medeia direta ou indiretamente o eixo microbiano intestino-cérebro, que tem um impacto importante na função fisiológica do hospedeiro [41, 42]. O eixo intestino-cérebro refere-se ao mecanismo de sinal bidirecional entre o trato gastrointestinal e o sistema nervoso central. Metabólitos relacionados de micróbios intestinais podem efetivamente melhorar a função cognitiva, participando do estresse oxidativo e do metabolismo de ácidos graxos [43, 44]. Portanto, a VAP pode desempenhar um papel através do eixo cérebro-intestino, regulando a composição da flora intestinal, reduzindo o estresse oxidativo e o acúmulo de ácidos graxos, promovendo o suprimento de energia ATP e, finalmente, melhorando o comprometimento cognitivo em camundongos idosos.

O metabolismo dos ácidos graxos ocorre principalmente nas mitocôndrias e peroxissomos via -oxidação. As mitocôndrias quebram principalmente os ácidos graxos de cadeia curta e média a longa, enquanto os peroxissomos quebram principalmente os ácidos graxos de cadeia longa e muito longa. O resultado do metabolismo dos ácidos graxos é a geração de ATP [45]. Este experimento mostra que depois que o VAP regula o metabolismo de ácidos graxos em camundongos idosos, ele aumenta ainda mais o conteúdo de ATP de camundongos idosos e melhora o metabolismo energético em camundongos idosos [46, 47]. Embora os produtos de decomposição da oxidação de ácidos graxos peroxissômicos e mitocondriais sejam os mesmos, eles são catalisados ​​por diferentes enzimas. É importante ressaltar que a senescência é conhecida por reduzir a oxidação peroxissomal e os níveis de ACOX1 [48]. A ACOX1 atua como uma enzima limitante de velocidade que catalisa o metabolismo de ácidos graxos de cadeia linear e está envolvida na síntese de precursores de mediadores de decomposição específicos (SPMs).

Curiosamente, em doenças neurodegenerativas, o aumento do conteúdo de SPM demonstrou efetivamente melhorar a taxa de sobrevivência dos neurônios e a patogênese das doenças [49]. A CPT1A está localizada na membrana mitocondrial externa e também é uma enzima chave na oxidação mitocondrial de ácidos graxos. Notavelmente, tanto ACOX1 quanto CPT1A são regulados por PPAR, cuja ativação aumenta a expressão dessas duas enzimas-chave e acelera a decomposição de ácidos graxos [50]. A principal função do PPAR é regular o metabolismo da oxidação de ácidos graxos e o consumo de energia regulando a atividade de ACOX1 e CPT1A. Mostramos que a administração de VAP induziu a regulação positiva da expressão de PPAR , CPT1A e ACOX1, sugerindo que ela pode regular positivamente a expressão das duas últimas enzimas-chave por meio da ativação de PPAR para promover a degradação de ácidos graxos.

APOE é o principal componente das lipoproteínas plasmáticas e o mais importante transportador de colesterol cerebral [51], desempenhando um papel na regulação do metabolismo lipídico no sistema nervoso central e na manutenção do equilíbrio do metabolismo lipídico no cérebro [52]. Estudos demonstraram que a APOE pode participar do crescimento e reparo de neurônios, afetar a reconstrução dendrítica e promover a geração de sinapses por meio da regulação do metabolismo lipídico e possivelmente via regulação do citoesqueleto (por exemplo, afetando a fosforilação da proteína tau) [53, 54]. Essas atividades biológicas da APOE sugerem que ela pode desempenhar um papel importante no reparo do tecido nervoso [55]. APOE tem três isotipos comuns (APOE2, APOE3 e APOE4), e estudos mostraram que APOE4 pode levar à disfunção mitocondrial no cérebro. De fato, as sinapses cerebrais nos portadores do gene APOE4 estão severamente danificadas [56] e são mais propensas a sofrer de doenças neurodegenerativas [57]. É importante ressaltar que mostramos que a VAP pode reduzir a expressão de APOE4 no cérebro.

5. Conclusões

Os resultados mostram conclusivamente que o VAP promove a expressão de CPT1A e ACOX1 ativando o PPAR, regula a flora intestinal de camundongos idosos, melhorando assim o metabolismo lipídico em camundongos idosos, reduzindo o conteúdo de ácidos graxos, promovendo a decomposição de ácidos graxos e aumentando o ATP em camundongos idosos. A VAP aumenta o ATP e reduz a expressão de APOE ao reduzir o conteúdo de ácidos graxos no cérebro de camundongos idosos, melhorando assim o comprometimento cognitivo causado pelo envelhecimento, melhorando a capacidade de aprendizado e protegendo os neurônios.

Abreviaturas

VA, chifre de veludo; VAP, polipeptídeo de chifre de veludo; Dgal, D-galactose; H&E, hematoxilina-eosina; TEM, microscopia eletrônica de transmissão; SOD, superóxido dismutase; MDA, malonaldeído; GSH-Px, glutationa peroxidase; CAT, catalase; SNC, sistema nervoso central; EO, estresse oxidativo; ROS, espécies reativas de oxigênio; OTUs, unidades taxonômicas operacionais; KEGG, Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto; PPAR, receptor ativado por proliferador de peroxissoma; CPT1A, carnitina-palmitoil transferase-1 A; ACOXl, acil-CoA oxidase 1; APOE4, apolipoproteína E4.

Contribuições do autor

NL e QY conceberam e projetaram os experimentos; XRL, ZZ, STM, ZL, YXL, YHZ, QHP e SG realizaram os experimentos; XCL, MK, JNL e JFW analisaram os dados; HL contribuiu com materiais; XRL escreveu o artigo.

Aprovação ética e consentimento para participar

Todos os experimentos com animais realizados neste estudo estão alinhados com as diretrizes relevantes e foram aprovados pelo Comitê de Ética em Animais de Laboratório da Universidade de Medicina Chinesa de Changchun (20180056).

Reconhecimento

Agradecemos aos revisores anônimos pela excelente crítica ao artigo.

Financiamento

Este estudo foi financiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Chave da China (2018YFC1706603-05).

Conflito de interesses

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

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