O direcionamento da lactato desidrogenase A com catequina ressensibiliza células cancerígenas gástricas SNU620/5FU para 5-Fluorouracil Parte 1

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Abstrato:A resistência à terapêutica anticancerígena ocorre em praticamente todos os tipos de câncer e se torna uma grande dificuldade no tratamento do câncer. Embora o 5-fluorouracil (5FU) seja a escolha de primeira linha de terapia anticâncer para câncer gástrico, sua eficácia é limitada devido à resistência aos medicamentos. Recentemente, o metabolismo alterado do câncer, incluindo o efeito Warburg, uma preferência pela glicólise em vez da fosforilação oxidativa para a produção de energia, foi aceito como um mecanismo fundamental que regula a resistência à quimioterapia. Assim, investigamos o mecanismo detalhado e a possível utilidade de agentes antiglicolíticos na melhoria da resistência ao 5FU usando linhas celulares de câncer gástrico estabelecidas, SNU620 e SNU620/5FU.SNU620/5FU, uma célula de câncer gástrico que abriga resistência ao 5FU, mostrou produção e expressão de lactato muito maior doenzimas relacionadas à glicólise, como a lactato desidrogenase A (LDHA), do que as células SNU620 de origem. Para limitar a glicólise, examinamos a catequina e seus derivados, que são conhecidosanti-inflamatórioe produtos naturais anticancerígenos porque o galato de epigalocatequina foi relatado anteriormente como um supressor da expressão de LDHA. A catequina, o composto mais simples entre eles, teve o maior efeito inibitório sobre a produção de lactato e atividade de LDHA. Além disso, a combinação de 5FU e catequina mostrou citotoxicidade adicional e induziu apoptose mediada por espécies reativas de oxigênio (ROS) em células SNU620/5FU. Assim, com base nesses resultados, sugerimos a catequina como candidata para o desenvolvimento de um novo fármaco adjuvante que reduz a quimiorresistência ao 5FU ao restringir o LDHA.

Palavras-chave:5-fluorouracil;quimiorresistente; glicolise; lactato desidrogenase; catequina

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1. Introdução

Progresso notável foi alcançado no tratamento do câncer gástrico com ressecção cirúrgica do tumor primário e quimioterapia combinada baseada em 5-fluorouracil (5FU), como epirrubicina, cisplatina e fluorouracil e docetaxel, oxaliplatina e 5FU[1 ,21 Até o momento, o 5FU, um análogo do uracil que bloqueia a síntese de DNA pela inibição da timidilato sintase [3], continua sendo um medicamento quimioterápico comumente usado para o tratamento do câncer gástrico [1, A4]. No entanto, a eficácia clínica da quimioterapia tem sido insatisfatória devido à recidiva do câncer primário ou metastático relacionado à resistência aos medicamentos [1,5].

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Vários processos celulares são considerados como mecanismos-chave subjacentes à quimiorresistência, incluindo ativação ou inativação de drogas, maquinaria de reparo de danos no DNA, modificações em alvos de drogas, inativação de vias apoptóticas e aumento da autofagia [6,7]. O câncer é heterogêneo e vários tipos de câncer usam tanto a glicólise quanto a fosforilação oxidativa para o metabolismo energético. No entanto, a reprogramação metabólica, especialmente a glicólise aeróbica anormal, tem sido relatada como um fator chave no desenvolvimento de resistência a drogas quimioterápicas, incluindo 5FU, no câncer gástrico [9]. Lactato desidrogenase A (LDHA) e piruvato desidrogenase quinases (PDKs) são conhecidos como reguladores chave da glicólise aeróbica produzindo lactato a partir de piruvato[10,11]. A combinação de dicloroacetato, um inibidor estabelecido de PDK, restaura a sensibilidade ao 5FU [12]. Além disso, o LDHA, uma enzima chave que catalisa a conversão de piruvato em lactato, foi relatado como um alvo potencial para o tratamento do câncer gástrico [13,14]. A eliminação da expressão de LDHA em células cancerígenas inibe a tumorigenicidade através do aumento da respiração mitocondrial e da redução da viabilidade celular [15]. Vários inibidores de LDHA, como FX11, PSTMB e GSK 2837808A, diminuem os níveis de ATP e geram estresse oxidativo e, finalmente, causam morte celular apoptótica [16-18]. Embora um estudo tenha demonstrado que a inibição de LDHA por microRNA-34a recuperou a resistência ao 5FU em câncer de cólon [19], nenhum estudo anterior relatou os efeitos de inibidores de LDHA genéticos ou farmacológicos na quimiorresistência.

Os polifenóis do chá verde, incluindo catequina (CA), epicatequina (EC), galocatequina (GC), epigalocatequina (EGC), epicatequina-3-galato (ECG) e epigalocatequina-3-galato (EGCG), promovem saúde, prevenindo e tratando várias doenças, incluindo inflamação, diabetes, doenças cardiovasculares e câncer maligno [20,21]. Entre os polifenóis, o EGCG aumenta a quimiossensibilidade do 5FU em células de câncer colorretal e carcinoma hepatocelular, ativando as vias AMPK e restringindo a origem do câncer [22,23]. Além disso, foi relatado que o EGCG inibe o LDHA, reprimindo suas expressões nas células cancerígenas da mama e do pâncreas [24,25].

Neste estudo, levantamos a hipótese de que o CA pode ser um candidato a um fármaco adjuvante para reduzir a resistência ao 5FU em células de câncer gástrico. Foi examinado que o efeito inibitório de CA e/ou sua combinação com 5FU sobre a atividade de LDHA induziu assim espécies reativas de oxigênio mitocondriais (ROS) e morte celular apoptótica em células resistentes a 5FU.

2. Resultados

2.1. Características glicolíticas de células resistentes a 5FU

A proliferação aumentada é uma característica da quimiorresistência, incluindo células cancerígenas resistentes a 5FU [26,27]. Primeiro, confirmamos a resistência ao 5FU e as taxas de crescimento de longo prazo das células SNU620 e SNU620/5FU. Quando essas células foram cultivadas com as concentrações indicadas de 5FU por 48 h, a dose estimada causando 50 por cento de inibição do crescimento (Gl50) em células SNU620/5FU (100,63 uM) foi muito maior do que causando GIso em suas células SNU620 parentais (28,88 μM). ）（Figura 1A e Figura Suplementar S1）. Além disso, as taxas de crescimento das células SNU620/5FU foram mais rápidas do que as das células SNU620 (Figura 1B e Figura Suplementar S2). Como a quimiorresistência e as características de crescimento rápido podem estar relacionadas a propriedades glicolíticas elevadas em células de câncer gástrico [28], as taxas de acidificação extracelular (ECAR) e as taxas de consumo de oxigênio (OCR) foram medidas em ambas as células na presença de oxamato, um conhecido inibidor da glicólise ou não. Os resultados demonstraram que as células SNU620/5FU secretaram significativamente mais lactato do que o secretado pelas células SNU620 e posteriormente acidificaram o meio de cultura (Figura 1C e Figura Suplementar S3). No entanto, nenhuma mudança significativa no OCR foi observada entre essas células (Figura 1D). Os níveis de expressão de mRNA e proteína de LDHA foram medidos. A expressão de LDHA foi maior nas células SNU620/5FU do que nas células SNU620 (Figura 1E, F). Além disso, examinamos os níveis de expressão de mRNA e proteína dos isotipos de PDK e descobrimos que os de PDK2 e PDK3 eram maiores em células SNU620/5FU do que em células SNU620 (Figura complementar S4A, B). A fosforilação da subunidade E1 da piruvato desidrogenase (PDHA1), que foi aumentada por PDKs, também foi avaliada, e verificou-se ser maior nas células SNU620/5FU do que nas células SNU620 (Figura complementar S4C). Além disso, usamos oxamato como um inibidor de LDHA para superar a resistência a 5FU em células SNU620/5FU. Este composto inibiu o crescimento celular em células SNU620 e SNU620/5FU (Figura S5 suplementar). Além disso, o co-tratamento com oxamato e 5FU suprimiu o crescimento celular, em comparação com o tratamento individual com oxamato ou 5FU em células SNU620/5FU (Figura 1G). Esses dados sugerem que as células SNU620/5FU expressam altamente LDHA, e a inibição da atividade de LDHA pode superar a resistência das células SNU/5FU ao 5FU.

Figura 1. De acordo com os resultados, as células5-resistentes ao fluorouracil (5FU) apresentam uma característica glicolítica elevada: as células (A)SNU620 e SNU620/5FU foram tratadas com as concentrações indicadas de 5FU por 48 h. A viabilidade dessas células foi avaliada através do ensaio MTT; (B) os níveis de crescimento das células SNU620 e SNU620/5FU foram medidos a cada dia durante 4 dias com o ensaio MTT; (C,D)SNU620 e as células SNU620/5FU foram tratadas com oxamato ( 5mM) ou não por 24 h, e os valores de ECAR e OCR foram avaliados pelo analisador Seahorse XF;(E, F) as expressões de LDHA em células SNU620 e SNU620/5FU foram detectadas via qRT-PCR e análise de Western blot; (G) As células SNU620 e SNU620/5FU foram tratadas com oxamato (25 mM) e/ou 5FU（10μM） por 48h. Os resultados são mostrados como média ± SEM.**p<0.01><><><0.01,and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

2.2. CA suprime atividade LDHA

A produção de lactato foi analisada com CA e seus derivados, incluindo EC, GC, EGC e EGCG, em células SNU620/5FU. Comparado com esses derivados, o CA reduziu a produção de lactato de forma mais eficaz (Figura 2A). Além disso, in vitro, o ensaio de atividade de LDHA foi confirmado e o CA mostrou um efeito inibitório mais forte na atividade de LDHA do que os de seus derivados (Figura 2B). Os efeitos inibitórios do CA nas atividades in vitro de LDHA e LDHB foram medidos de maneira dependente da dose. CA inibiu a atividade de LDHA sem afetar a atividade de LDHB (Figura 2C, D). Além disso, as atividades de LDHA e LDHB foram medidas com EGCG, que é conhecido por inibir a atividade de LDHA, e verificou-se uma diminuição dependente da dose (Figura complementar S6A, B). Além disso, as atividades intracelulares de LDHA e LDHB foram avaliadas com as concentrações indicadas de CA em células SNU620/5FU. CA inibiu a atividade de LDHA de maneira dependente da dose resultados in vitro, mas não a atividade de LDHB (Figura 2E, F). Os níveis de expressão proteica de p-PDHA1, PDK2, PDK3 e LDHA também foram medidos em células SNU620/5FU após tratamento com CA (Figura complementar S7), e observamos que elas não foram afetadas por este tratamento. Esses resultados sugerem que o CA regula a atividade do LDHA sem afetar sua expressão.

2.3. Modo de ação da inibição de LDHA por CA

Para analisar o mecanismo de inibição da atividade do LDHA no CA e seus derivados, realizamos a modelagem molecular da interação de ligação entre o LDHA recombinante humano e o CA (Figura 3A,B). Os resultados mostraram que CA pode interagir com os resíduos de T94, A95, Q99, R105, S136, R168, H192 e T247 de LDHA. Entre eles, R105, S136 e R168 são críticos para a ligação do substrato (piruvato). Assim, assumimos que o CA pode interferir nos sítios de ligação ao substrato. Pelo contrário, o EGCG está vinculado ao LDHA por meio de um site diferente. Para verificar ainda mais o modo de ação da inibição de LDHA por CA, os gráficos de Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk foram confirmados com várias concentrações de piruvato e CA. A atividade de LDHA foi aumentada de forma dependente da dose de piruvato. No entanto, foi revertido pelo aumento da CA. Assim, os resultados dos gráficos de Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk mostraram que o CA é um inibidor não competitivo do LDHA (Figura 3C, D). Além disso, os dados de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) demonstraram que o CA se liga fisicamente ao LDHA por um Kd valor de 197 uM (Figura S8 suplementar). Esses resultados fornecem informações de que a CA suprime a atividade do LDHA por meio da ligação ao local de ligação ao substrato do LDHA.

2.4. CA ressensibiliza a resistência ao 5FU por meio da redução da atividade do LDHA

Avaliamos os efeitos citotóxicos do CA em células SNU620 e SNU620/5FU e descobrimos que o CA suprimiu o crescimento em ambos os grupos de células (Figura 4A). Para verificar que a inibição do crescimento estava relacionada à supressão da atividade de LDHA, a expressão de LDHA foi abolida por ácido ribonucleico em gancho curto (shRNA) para LDHA (shLDHA) e sua expressão foi recuperada por transfecção de plasmídeo expressando LDHA (Figura complementar S9A, B ). Em células SNU620/5FU transfectadas com shLDHA, a produção de lactato e a viabilidade celular não foram marcadamente alteradas pelo tratamento com CA, em comparação com as células transfectadas de forma simulada (Figura 4B, C). Além disso, o efeito inibidor do crescimento de CA foi aumentado pela recuperação da expressão de LDHA em células SNU620/5FU knockdown de LDHA (Figura 4D). Além disso, as células SNU620 e SNU620/5FU foram examinadas após o tratamento de CA e 5FU individualmente ou a combinação de ambos. O co-tratamento com CA e 5FU inibiu significativamente o crescimento de células SNU620/5FU (Figura 4E). Além disso, os efeitos da combinação de CA e 5FU foram examinados em várias outras linhagens celulares, como câncer gástrico humano AGS, câncer de pâncreas Panic-1, MIA PaCa-2 e células de câncer de cólon LS174T e RKO, em comparação com SNU620 e SNU620/5FUcells. A produção de lactato e a expressão de LDHA mostraram uma boa correlação entre si, e essas propriedades glicolíticas são relativamente altas em SNU620/5FU, AGS e RKO (Figura complementar S10A, B). Além disso, o tratamento combinado de CA e 5FU reduziu significativamente a viabilidade das células, em comparação com um único tratamento de 5FU em células glicolíticas, incluindo AGS e RKO (Figura complementar S10C). No entanto, o co-tratamento com CA e 5FU não inibiu significativamente o crescimento nas células SNU620, Panic-1, MIA PaCa-2 e LS174T, que apresentaram baixas expressões de LDHA. Esses resultados sugeriram que o efeito sensibilizador do CA para células resistentes ao 5FU pode estar relacionado ao seu efeito inibitório sobre a atividade do LDHA.

Figura 2. A catequina (CA) inibe a atividade de LDHA, mas não sua expressão: (A) a produção de lactato de SNU620/5FU foi medida após o tratamento com derivados de CA （10 μM） por 24 h;（B）in vitro a atividade de LDHA foi avaliada após o tratamento com derivados de CA (10 uM) e oxamato (20 mM);(C, D)in vitro, atividades de LDHA e LDHB foram estimadas com as concentrações indicadas de CA; (E, F) as células foram tratadas com concentrações indicadas de CA por 24h. As atividades intracelulares de LDHA e LDHB foram medidas usando os lisados ​​celulares como fonte de enzima. Os resultados são apresentados como média ± SEM. **p<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Figura 4. A viabilidade celular foi inibida pelo co-tratamento com catequina (CA) e 5-fluorouracil (5FU) em células resistentes a 5FU:(A) viabilidades de células SNU620 e SNU620/5FU foram avaliadas após o tratamento com as concentrações indicadas de CA por 48 h; （B）SNU620/5FU-pLKO.1 e células SNU620/5FU-shLDHA foram tratadas com CA（10 μM） por 24 h. A produção de lactato foi medida no meio de cultura de células SNU620/5FU-pLKO.1 e SNU620/5FU-shLDHA; (C, D)SNU620/5FU-pLKO.1, SNU620/5FU-shLDHA, SNU620/5FU-shLDHA mais EV , e as células SNU620/5FU-shLDHA mais LDHA#2 foram tratadas com as concentrações indicadas de CA por 48 h. A viabilidade celular foi medida usando um ensaio MTT; （E） células SNU620 e SNU620/5FU foram tratadas com CA （10 μM） e/ou 5FU（10μM） por 48 h. As viabilidades dessas células foram medidas através do ensaio MTT. Os resultados são mostrados como média±SEM.*p<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Este artigo foi extraído de Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms