Os benefícios do acteoside - tratar glioblastoma

Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

TAE WOONG HWANG;DONG HUN KIM; DA BI KIM1;TAE WON JANG;GUN-HWA KIM;MINHO MOON;KYUNG AH YOON;DAE EUN CHO;JAE HO PARK;JWA-JIN KIM

1. Introdução

Glioblastomaé o tipo mais comum de tumor cerebral primário maligno e o tumor cerebral primário mais invasivo e devastador (1,2), com uma taxa de sobrevivência mediana de ~18 meses com terapia agressiva de multimodalidade. As decisões atuais de tratamento são limitadas e incluem radiação, quimioterapia e cirurgia em combinação com o agente alquilante temozolomide (TMZ) (3,4). Apesar da disponibilidade de terapias agressivas, pacientes comglioblastomageralmente têm um prognóstico ruim (5). TMZ é a principal droga quimioterápica usada no tratamento clínico de malignosglioblastoma(6‑8); como um agente alquilante na série, é capaz de penetrar na barreira hemencefálica (9-11). Durante a progressão maligna do glioblastoma e a extensa invasão em todo o cérebro, o aumento constante da resistência medicamentosa ao TMZ diminui sua eficácia terapêutica (12,13). Assim, novas drogas terapêuticas para combaterglioblastomasão procurados urgentemente.

Estudos anteriores relataram que as células de glioma sofrem morte celular por autofagia, ou morte celular programada tipo II, em resposta ao TMZ (14,15). A autofagia pode ser inibida por 3-metiladenina (3-MA) através da conversão de proteína associada a micro-túbulos 1 cadeia leve 3 (LC3)-I para LC3-II, reduzindo assimglioblastomamorte celular (16,17); no entanto, o papel da autofagia depende do contexto celular. Com exceção de um papel citotóxico durante a ação do TMZ, a indução da autofagia pelo estresse celular é um processo citoprotetor que elimina agregados citoplasmáticos induzidos pelo estresse, organelas e macromoléculas em células mamíferas através do sistema lysosomal. Por sua vez, as células envolvidas na manutenção da homeostase recebem energia através desses processos catabólicos (18,19). As funções complexas da autofagia sugerem que um ativador de autofagia pode ter efeitos anticancerígenos em combinação com o tratamento TMZ induzindoglioblastomaautofagia celular sem exercer efeitos deletérios ou fornecer benefícios aos tecidos normais. Note-se que o TMZ tem exibido efeitos terapêuticos sinérgicos em combinação com vitamina D, incluindo viabilidade celular suprimida e autofagia aprimorada emglioblastomaCélulas. Além disso, a combinação de TMZ e vitamina D tem sido demonstrada para exercer efeitos anticancerígenos in vivo, incluindo redução do tamanho do tumor e taxa de sobrevivência prolongada. Esses estudos sugerem que o tratamento combinado pode ter efeitos anticancerígenos sinérgicos através de mecanismos autofárgicos em base no TMZglioblastomaterapia (15).

Acteosideé um glicoside feniltanóide que é amplamente distribuído em vários medicamentos à base de ervas chineses tradicionais (20,21). Uma série de ações farmacológicas, incluindo ações antioxidantes, anticancerígenas, anti-inflamatórias, anti-anfiríticas e antimetastticas, têm sido associadas a ações antioxidantes, anticancerígenasacteoside(22‑24). Estudos anteriores demonstraram queacteosidetem efeitos protetores contra lesão hepática induzida por tetraclorito de carbono e d-galactosamina. Os mecanismos subjacentes aos efeitos protetores do acteoside provavelmente estão relacionados à sua capacidade de inibir a bioativação mediada por P450 e efeitos radicais livres de limpeza induzidos pela exposição ao tetraclorito de carbono (25,26).

Portanto, as evidências sugerem que ambosacteosidee o TMZ induz efeitos anticancerígenos através da morte celular. No entanto, sua associação e efeitos anticancerígenos no contexto deglioblastomapermanecem a ser elucidados. Portanto, o objetivo do presente estudo foi verificar os efeitos anticancerígenos sinérgicos deacteosidecombinado com tmz emglioblastomaterapia. Um ensaio de viabilidade celular foi realizado para analisar os efeitos anticancerígenos do tratamento combinado em C6glioblastomacélulas (um ratoglioblastomalinha celular), e os resultados foram comparados com aqueles que seguem o tratamento apenas com o TMZ. Para examinar ainda mais o mecanismo de morte celular causado pelo cotreatment comacteosidee tMZ, genes relacionados à apoptose e autofagia em células C6 foram examinados.

acteoside anti-tumor

2. Materiais e métodos

Cultura celular:

O rato C6glioblastomalinha celular foi comprada da American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA). As células foram cultivadas em condições estéreis a 37°C em um ambiente úmido com 5% de CO2 no meio modificado da Águia (DMEM) modificado de Dulbecco, complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), e 1% antibióticos e antimípticos (todos Welgene, Daegu, Coreia).

Material vegetal:

Abeliophyllum distichum Nakai [voucher não. Park1001(ANH)] foi coletado no parque temático Misun-hyang, Seongbul-Mountain Recreation Forest, Coreia.

Indução de Calo:

Para induzir a formação de calos (27), explantas de folha de 1 cm2 foram isoladas das plantas frescas. A explanta foi cultivada em Murachige e Skoog médio (4% de sacarose, 0,9% de ágar complementado com ácido acético de nafenoeno 1 mg/l e 1 mg/l 2,4-ácido acetice fenócio, pH 5,7) a 25°C. O calo foi induzido 20 dias depois. Uma quantidade suficiente deacteosidefoi obtido através da subcultura para separar e purificaracteosidedo calo (Fig. 1). Diferentes lotes de purificadosacteosideforam usados em cada experimento. Cada experimento foi realizado três vezes usando um lote diferente.

Isolamento e purificação:

As frações de acetato etílico foram concentradas em vacuo e utilizadas como amostra para a purificação do acteoside.Acteosidefoi isolado e purificado pelo sistema de isolamento cromatográfico acelerado (Isolera™ Spektra, Biotage, Uppsala, Suécia) usando snap KPHOSPHO-SIL e SNAP Ultra Cartuchos (Biotage). Oacteosidepurificado do calo foi analisado quantitativamente utilizando-se o acteoside padrão pela análise HPLC-PDA. Finalmente, acteoside de ≥95% de pureza foi obtido do calo e usado como amostra para quimioterapia à base de temozolomideglioblastoma.

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-l)-,5-diphenyltetrazolium brometo (MTT) ensaio:

Para identificar a concentração inibitória semi-máxima do TMZ (valor IC50) em células C6, 1x104 células em suspensões unicelulares foram semeadas em poços individuais de placas de 96 poços e incubadas por 24h a 37°C antes do tratamento do TMZ nas concentrações indicadas (1, 5, 10 e 20 mM) a 37°C para 24 h. Seguindo a determinação do valor TMZ IC50 como 5 mm, as células foram tratadas por 24 h com 5 mM TMZ, 50 μMacteoside, ou uma combinação dos dois (5 mM TMZ e 50 μMacteoside). A solução MTT (5 mg/ml) foi adicionada a cada poço (10 μl) e cultivada a 37°C por 2h. Posteriormente, o meio foi removido e o DMSO foi adicionado a um volume de 200 μl cada e reagiu à temperatura ambiente por 30 minutos. A absorvância a 595 nm foi medida para determinar a viabilidade celular.

Ensaio de cicatrização de feridas:

Uma suspensão de célula C6 em 1 ml foi cultivada em uma placa de 12 poços e cresceu para confluência. As células foram tratadas com o TMZ,acteoside, ou TMZ +acteosidee, em seguida, arranhado com uma ponta de pipeta estéril de 10 μl para criar uma ferida artificial. Às 0 e 24 horas após o ferimento, imagens digitais do processo de cicatrização da ferida foram capturadas usando um microscópio invertido. A migração celular foi quantificada medindo o tamanho da cicatriz em 0 e 24 h usando o software de análise de imagem, ImageJ 1.43u/Java1.6.0_22 software (NIH, Bethesda, Maryland, EUA). Cada experimento foi realizado três vezes e as medições foram realizadas em triplicado.

Imunoblotting:

As células C6 foram tratadas com o TMZ,acteoside, ou TMZ +acteosidepor 24 h. As células foram diluidas no gelo pelo RIPA (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1% desoxicolato de sódio, 0,1% SDS) tampão de lise complementado com coquetel de inibidores de protease e fosfatase (Roche, Basileia, Suíça) para 30 mintase. Após centrifugação a 18.341 x g por 15 min a 4°C, o supernatante foi obtido. A concentração proteica foi determinada utilizando-se de Ensaios de Proteínas de Bradford (Bio-rad, Hércules, CA, EUA). Quantidades iguais de proteínas totais (30 μg) foram carregadas em poços únicos e fracionadas via eletroforese através de um SDS-PAGE de 10-15%. As proteínas foram eletrotransferidas para membranas de difluoreto polivinylidene (EMD Millipore, Bedford, MA, EUA). Após a incubação na solução de bloqueio contendo 5% de leite sem gordura em soro fisiológico tampo Tween/Tris por 30 minutos à temperatura ambiente. As manchas foram sondadas com anticorpos primários diluídos de 1:100 (gato nº 9662, caspase 3; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA), Linfoma de células B0 2 (sc-7382, Bcl-2), proteína X associada a Bcl-2 (gato. nº 2772, Bax), fosfoilada (p-)p53 (sc-101762), total-p53 (sc-6243), β-actin (gato. Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, EUA), LC-3 (L8918, Sigma; Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha), Rab7 (gato. nº 9367, Cell Signaling Technology, Inc.), p62 (gato. no 114), p-p38 (gato. 9211), total-p38 (gato). nº 9212), p-c-Jun N-terminal quinasase (cat. no. 9251, p-JNK), total-JNK (gato. no. 9252), quinase p-extracelular regulada por sinal (gato. no. 9101, p-ERK), total-ERK (cat. no. 9102; toda a tecnologia de sinalização celular, Inc.) durante a noite em 4°C. Isso foi seguido pela incubação com anticorpos secundários conjugados por peroxidase conjugados com rabanete (1:2.000; LF-SA8001A, Anti-Rato de Cabra IgG-HRP) ou LF-SA8002A (Anti-Coelho de Cabra IgG-HRP), AB Frontier, Seul, Coreia.) para 2h em temperatura ambiente. As proteínas foram então visualizadas pela exposição ao Chemi-Doc (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hércules, cA, EUA).

Coloração de imunofluorescência:

Proteína de membrana associada à linsossômica 1 (LAMP1) e LC3 são marcadores para linsósomal e autofagia. As células (células 1x105/bem) foram preparadas em tampas de vidro esterilizadas (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) em triplicado. Após o tratamento com o TMZ,acteoside, ou TMZ +acteosidepara 24 h, as células foram fixadas em 4% paraformaldeído por 30 min, bloqueadas com soro de frango normal de 5% (S-3000; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EUA), 0,1% Triton X-100 e depois incubado 1 h para permeabilização e para bloquear interações proteína-proteína não específicas. As células foram então incubadas com o anti-LAMP1 (1:200; sc-19992, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) e anti-LC3 (1:400; PM036, MBL International, Woburn, MA, EUA) durante a noite a 4°C. As células foram então lavadas duas vezes com PBS e incubadas por mais 2 h no escuro com uma mistura de Alexa Fluor 488 e 594 anticorpos secundários (1:200; Alexa Fluor 488 (A-11008) e 594 (A-11007), Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) e lavadas novamente com PBS. Os núcleos foram manchados usando 4,6-diamidino-2-fenilômado (Sigma; Merck KGaA), e depois lavado duas vezes com PBS. Os slides foram então montados e as imagens foram capturadas sob um microscópio confocal laser LSM-700.

Figura 1. Estrutura química de acteoside.

Citometria de fluxo.

As células foram analisadas para Mitotracker Green e MitoSOX por citometria de fluxo utilizando um citómetro de fluxo FACSCanto II, conforme indicado pelo fabricante (BD Biosciences). Após duas lavagemes com PBS, as células foram fixadas em 4% de paraformaldeído por 30 min à temperatura ambiente e permeabilizadas com 0,25% Triton X-100 em PBS por 20 min. As células foram manchadas com anticorpos primários durante a noite a 4°C (1:200) e, em seguida, com anticorpos secundários por 1h no gelo. Após duas lavagems com PBS, as células foram fixadas em 4% de paraformaldeído e avaliadas imediatamente. Os dados de citometria de fluxo foram coletados usando 10.000 células e foram analisados usando o software FlowJo 7.6.1 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA).

Análise estatística:

Todos os dados foram analisados usando o GraphPad Prism 5.0 e são apresentados como o erro padrão ± médio da média. Os dados foram analisados com uma análise unidirecano de variância com o teste pós-hoc de várias comparações de Tukey para a comparação de valores médios entre vários grupos. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Cistanche Echinacoside: Anti-apoptose

3. Resultados

3.1 Cotreatment com TMZ e acteoside suprimeglioblastomaproliferação celular e migração.

Tratamento combinado com o TMZ eacteosideinibiu a viabilidade das células C6. O TMZ reduziu a viabilidade celular de forma dependente de dose (Fig. 2A), enquanto o acteoside sozinho não teve efeito significativo em nenhum nível de tratamento (Fig. 2B). Após a incubação em um meio de cultura contendo TMZ com ou sem acteoside por 24 h, foi realizado um ensaio MTT para comparar as citotoxicidades de diferentes níveis de tratamento. O TMZ suprimiu significativamente a viabilidade celular, enquanto o acteoside não suprimiu significativamente o crescimento celular. Tratamento combinado com TMZ e acteoside notavelmente reduzido viabilidade celular (Fig. 2C). O tratamento com tMZ ou acteoside aplicado sozinho reduziu a capacidade de cicatrização de feridas (Fig. 3A). A distância da ferida (%) foi medida utilizando-se os resultados mostrados em Fig. 3A com software ImageJ. A distância da ferida aumentou significativamente após o tratamento combinado (Fig. 3B), em comparação com qualquer tratamento individual. Estes resultados indicam que o cotreatment com o TMZ e o acteoside foi um inibidor eficaz deglioblastomaproliferação celular e migração.

3.2 Acteoside e TMZ afetam apoptose sinergicamente em células C6.

Os resultados da análise da mancha ocidental revelaram que os níveis de caspase-3, Bax e p53 fosforilados foram mais elevados e os níveis de Bcl-2 foram menores após tratamento combinado com o TMZ eacteosidedo que seguir o tratamento apenas com o TMZ (Fig. 4A).Acteoside-a função mitocondrial mediada e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), que são os principais mediadores da sinalização apoptótica, foram então observadas nas células C6 tratadas pelo TMZ. Para verificar a massa mitocondrial, a análise de classificação celular ativada pela fluorescência foi realizada usando o MitoTracker Green. Cotreatment com o TMZ eacteosideresultou em uma massa mitocondrial maior do que o tratamento apenas com o TMZ (Fig. 4B). A geração ROS foi significativamente maior após o cotreto com o TMZ e o acteoside do que o tratamento apenas com o TMZ (Fig. 4C). Esses resultados sugerem que a geração ROS e a função mitocondrial são importantes na apoptose induzida pelo tratamento com tMZ + acteoside. O cotreatment com o TMZ e o acteoside induz a autofagia em células C6. O TMZ foi relatado para induzir a autofagia (28,29); portanto, o presente estudo analisou até que ponto a autofagia foi induzida pelo tratamento tMZ + acteoside. As células C6 foram tratadas com TMZ com ou sem ato de lado; após 24 h, e as células foram manchadas para imunofluorescência para detectar LAMP1 e LC3 como marcadores de autofagia. Níveis de expressão mais elevados de LAMP1 e LC3 foram observados após o tratamento de combinação (Fig. 5A). A expressão proteica relacionada à autofagia também foi examinada, e descobriu-se que o TMZ induziu a conversão de LC3-I para LC3-II, que é uma assinatura da geração autofagossa. Observou-se maior taxa de conversão de LC3-I para LC3-II após o cotreatment com o TMZ e o acteoside do que o tratamento apenas com o TMZ. Os níveis de expressão de Rab7 e p62 indicaram indução de autofagia nas células tratadas pelo TMZ (Fig. 5B). Esses achados sugerem que o cotreatment com o TMZ e o acteoside melhoraram o processo autofágico emglioblastomaCélulas.

3.3 Acteoside induz a expressão genética da via MAPK no tratamento baseado em TMZ.

Estudos anteriores demonstraram que o TMZ regula a via MAPK, incluindo p38, JNK e ERK (30). Portanto, o presente estudo investigou seacteosideafeta a expressão genética MAPK relacionada ao TMZ. As células C6 foram tratadas com TMZ com ou semacteoside. Após 24 h, o tratamento TMZ resultou em níveis de expressão mais elevados de p-p38, p-JNK e p-ERK. A expressão dos genes regulados pelo TMZ foi significativamente maior após o tratamento TMZ + acteoside do que o tratamento apenas com o TMZ (Fig. 6). Essas observações sugerem queacteosideafeta mecanismos terapêuticos baseados em TMZ através da via MAPK.

Acteoside anti-glioblastoma

Discussão

Os resultados do presente estudo estabelecem que o tratamento combinado com o TMZ comacteosideoferece potencial terapêutico paraglioblastomatratamento, e fornecer evidências de que a quimioensitização a uma combinação de TMZ eacteosidepode ocorrer através do aprimoramento da autofagia. Como a mutação deglioblastomaas células podem levar à inativação da via apoptótica, à indução da autofagia pelo TMZ +acteosidecotreatment pode representar um método alternativo paraglioblastomaterapia. No entanto, se a autofagia é o único mecanismo paraglioblastomaterapia com TMZ +acteosideo cotreatment continua a ser elucidado.

A autofagia é um mecanismo celular essencial para a degradação de proteínas e organelas citoplasmáticas. A vantagem catabólica da autofagia induzida pode ser importante em condições estressantes; portanto, a indução da autofagia pode ser um mecanismo adaptativo para a prevenção da morte celular (31-33). Estudos anteriores relataram que a redução da autofagia está correlacionada com o câncer (34-36). Além disso, várias proteínas e vias de sinalização associadas à autofagia são desregulamentadas durante a transformação maligna, resultando em uma redução da atividade autofágica. Altos níveis de expressão de LC3 também têm sido associados com aumento das taxas de sobrevivência em pacientes comglioblastomacom resultados ruins (37,38). Da mesma forma, os resultados do presente estudo indicam que a restauração da autofagia normal pode ser uma estratégia latente paraglioblastomaterapia, e pode servir como um mecanismo para a restrição do crescimento anormal das células tumorais.

Na autofagia normal, componentes citoplasmados particulares são isolados dentro de autofagossos que, em seguida, fundem-se com um lissomo a ser degradado e reciclado (39,40). Quando a autofagia é regulada, as taxas de formação autofagossas superam as taxas de degradação lysosômicas; esta condição é denominada estresse autofágico. Se o estresse ou a autofagia anormal continuarem, a morte celular pode ocorrer por esgotamento energético ou alterações no equilíbrio beclin-1/Bcl-2. A apoptose também pode ser desencadeada pela hiperatividade autofagosa, engolindo organelas citoplasmáticas, incluindo as mitocôndrias ou órticulo endoplasmático (41). Foi sugerido que a autofagia geral pode induzir a morte celular durante a citoplasmática normal e a rotatividade de organelas em células saudáveis. Nesse processo, a célula se 'canibaliza' por dentro, característica fundamental da morte celular programada tipo II. Embora os mecanismos pelos quaisacteosideaumenta o efeito terapêutico da TMZ baseada emglioblastomaa terapia continua a ser totalmente elucidada, os efeitos anticancerígenos exibidos pelo tratamento combinado examinado no presente estudo podem estar associados a esses mecanismos autofárgicos.

Acteosideé um feniltanóide glicoídeo derivado de plantas (22,26). Estudos anteriores relataram as diversas atividades biológicas do acteoside. As mudanças nos níveis de expressão de caspase-3 e LC3 no presente estudo demonstram que o tratamento com uma combinação de TMZ eacteosideapoptose induzida e autofagia em células C6 (Figs. 4 e 5). O tratamento de combinação mostrou ter um efeito sinérgico emglioblastomaCélulas. Embora outros possíveis mecanismos desses efeitos sinérgicos permaneçam elucidados, o presente estudo identificou a indução da autofagia como um mecanismo tumoricidal crucial deacteosidequimioensitização durante a tMZ baseadaglioblastomaterapia.

Acteoside trata glioblastoma

Referências

1. Friedman HS, Kerby T e Calvert H: Temozolomide e tratamento de glioma maligno. Clin Cancer Res 6: 2585-2597, 2000.

2. Mrugala MM e Chamberlain MC: Mecanismos de doença: Temozolomide eglioblastoma- olhe para o futuro. Nat Clin Pract Oncol 5: 476-486, 2008.

3. Agarwala SS e Kirkwood JM: Temozolomide, um novo agente alquilante com atividade no sistema nervoso central, pode melhorar o tratamento de melanoma metastático avançado. Oncologista 5: 144-151, 2000.

4.Stevens MF, Hickman JA, Stone R, Gibson NW, Baig GU, Lunt E e Newton cG: Antitumor imidazotetrazines. 1. Síntese e química de 8-carbamoyl-3-(2-cloroetila)imidazo[5,1-d]-1,2,3, 5-tetrazina-4(3 H)-um, um novo agente antitumor de amplo espectro. J Med Chem 27: 196-201, 1984.

5. Fulda S: Tratamento celular baseado na morte deglioblastoma. Morte Celular dis 9: 121, 2018.

6. Chen PH, Shen WL, Shih CM, Ho KH, Cheng CH, Lin CW, Lee CC, Liu AJ e Chen KC: A via Notch3 inibida pelo CHAC1 está envolvida na citotoxicidade glioma induzida por temozolomide. Neurofarmacologia 116: 300-314, 2017.

7. Oshiro S, Tsugu H, Komatsu F, Ohmura T, Ohta M, Sakamoto S, Fukushima T e Inoue T: Eficácia do tratamento temozolomide em pacientes com glioma de alto grau. Anticancerígeno Res 29: 911-917, 2009.

8. Van den Bent MJ: Tratamento adjuvante de gliomas de alto grau. Ann Oncol 17 (Suppl 10): x186-x190, 2006.

9. Shen W, Hu JA e Zheng JS: Mecanismo de efeitos antitumorais induzidos por temozolomida em células de glioma. J Int Med Res 42: 164-172, 2014.

10.Barciszewska AM, Gurda D, Głodowicz P, Nowak S e Naskręt-Barciszewska MZ: Um novo mecanismo epigenético da ação temozolomide em células de glioma. PLoS 10: e0136669, 2015.