Efeitos antiinflamatórios sinérgicos do extrato de Laminaria Japonica Fucoidan e Cistanche Tubulosa

Como resposta imune contra antígenos estranhos, os macrófagos liberam citocinas pró-inflamatórias, como fator de necrose tumoral (TNF-), interleucina-1 (IL- 1 ), IL-6 e outras. Tais citocinas induzem um influxo quimiotático de granulócitos, monócitos, linfócitos e mastócitos para o tecido danificado que promove a remoção do antígeno e a recuperação do tecido. No entanto, a infiltração e ativação excessiva das células agrava as lesões teciduais, levando ao edema (exsudação vascular) e à dor, fenômenos bem conhecidos de inflamação.

O TNF- é um fator importante para induzir a expressão do gene da óxido nítrico sintase (iNOS) em diversas linhagens celulares. A ativação da iNOS leva à produção de óxido nítrico (NO), que não apenas modula diversas funções fisiológicas, como bactericida e vasodilatação, mas também causa inflamação. Após a lesão tecidual, a degradação por fosfolipases dos fosfolipídios da membrana celular gera ácido araquidônico. O ácido araquidônico é ainda decomposto pela ciclooxigenase (COX) em prostaglandinas (PGs). Quantidade excessiva de PGE2 formada pela COX-II induz diversas citocinas para inflamação. Como tanto o NO quanto a PGE2 atuam como fatores importantes para a inflamação e a indução da dor, as vias TNF--NO e COX-II-PGE2 são as principais correntes do processo inflamatório, que são inibidas por corticosteróides e não esteróides.medicamentos anti-inflamatórios(AINEs), respectivamente.

Embora existam vários esteróides e AINEs paraterapia de doenças inflamatórias, esses medicamentos podem causar efeitos adversos no sistema imunológico, no trato gastrointestinal, nos rins, no fígado, no sistema nervoso central, na pressão arterial e no sistema cardiovascular. Portanto, é necessário minimizar os efeitos adversos da terapêutica química, substituindo-os ou utilizando-os em combinação com produtos naturais.

O fucoidan, um complexo polissacarídeo sulfato de algas marinhas como Laminaria japonica e Cladosiphon okamuranus amplamente distribuído em muitos países, tem sido utilizado como terapêutico na medicina oriental há um longo período. Em estudos anteriores, foi demonstrado que o fucoidan tem efeitos antioxidantes, anticoagulantes, anticancerígenos eatividades anti-inflamatórias. Conseqüentemente, os efeitos benéficos do fucoidan em doenças inflamatórias, isquemia, disfunção imunológica e tumores estão atraindo a atenção dos investigadores. Por outro lado,Cistanche tubulosa(CT) também tem sido amplamente utilizado como medicamento tradicional na China. Foi relatado que os extratos de CT diminuem a produção de TNF-á e IL- 4, que são os principais fatores para a produção de NO nas vias inflamatórias [19].

Essas descobertas anteriores nos levaram a investigar a eficácia combinatória do fucoidan e do extrato de CT nas duas principais vias de inflamação. Para elucidar o mecanismo de ação, analisamos NO e PGE2 nos exsudatos da inflamação da bolsa de ar induzida pela carragenina.

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Materiais e métodos

Materiais

O fucoidano semi-purificado e o extrato aquoso de CT foram obtidos da Misuba RTech Co., Ltd. O fucoidan e o extrato de CT foram mantidos a 4 graus, misturados (1:3), dissolvidos em água purificada antes do uso e administrados por via oral em um volume de 5 mL/kg.

Cultura celular e quantificação de NO

A linhagem celular de macrófagos murinos RAW 264.7 foi adquirida da American Type Culture Collection (Manassas, EUA) e cultivada em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Sigma, St. Louis, EUA) contendo 10% de soro bovino fetal e antibióticos [100 U/mL penicilina (Sigma) e 100 µg/mL de estreptomicina (Sigma)]. As células foram incubadas numa atmosfera humidificada com 5% de CO2 a 37 graus.

Para avaliar os efeitos do fucoidan e do extrato de CT na secreção de NO, células RAW 264.7 (1×106 células/mL) foram incubadas com fucoidan ou extrato de CT (1–320 µg/mL) por 5 min , seguido de interferon- (IFN-, 10 U/mL) e lipopolissacarídeo (LPS, 10 µg/mL) por 24 horas. Em nossos estudos preliminares, foi confirmado que o tratamento com IFN-mais LPS para a ativação de células RAW 264.7 não afetou a viabilidade das células até 24 horas e que o fucoidan e o extrato de CT não foram citotóxicos até 1 mg/mL. A concentração de nitrito (NO2 – ), produto oxidado do NO, foi medida como indicador de NO. O meio de cultura foi misturado com igual volume de reagente de Griess (sulfanilamida a 1%, naftil etilenodiamina a 0,1% em ácido fosfórico a 2,5%) [21] e incubado em temperatura ambiente por 10 min. A concentração de nitrito foi analisada a 540 nm, onde NaNO2 foi utilizado para gerar uma curva padrão.

Animais e tratamento

Camundongos ICR machos (7 semanas de idade) foram adquiridos da Daehan Biolink (Eumseong, Coréia) e alojados em uma sala com condições ambientais constantes (22±2ºC; 40-70% de umidade relativa; 12-hora de luz -ciclo escuro; 150-300 brilho lux). A ração granulada e a água purificada estavam disponíveis ad libitum. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Nacional de Chungbuk (CBNU), Coréia, e conduzidos de acordo com os Procedimentos Operacionais Padrão (SOP) do Centro de Pesquisa em Animais de Laboratório, CBNU.

Os camundongos (n=8/grupo) foram tratados oralmente com fucoidan (18 ou 54 mg/kg), extrato de CT (54 ou 162 mg/kg) ou sua mistura (18+54, {{6 }} ou 90+270 mg/kg) uma vez ao dia durante 7 dias. Doses baixas de fucoidan (18 mg/kg) e extrato de CT (54 mg/kg) foram provenientes de doses humanas estimadas de 100 mg/corpo (70 kg) e 300 mg/corpo após tradução da área de superfície do peso corporal (Km{{14 }} para humano/Km=3 para mouse), respectivamente. Doses elevadas de fucoidan e extrato de CT foram fixadas em 3 vezes, isoladamente ou em mistura, e a mistura de dose mais alta foi fixada em 5 vezes para avaliar os efeitos sinérgicos máximos.

No primeiro dia de tratamento com fucoidan e extrato de CT, os camundongos foram injetados por via subcutânea com 10 mL de ar estéril na parte traseira para formar uma bolsa [22,23]. Após 2 e 5 dias, a bolsa foi reinjetada com 5 mL de ar. Uma hora após o tratamento final, 1 mL de carragenina (solução salina a 1%; Sigma) ou seu veículo (solução salina) foi injetado na bolsa.

Análises dos exsudados

A bolsa de ar foi lavada com 1 mL de solução salina fria 6 horas após a injeção de carragenina, e o volume líquido de fluido de lavagem foi registrado. O número total de células inflamatórias, neutrófilos, monócitos e linfócitos, foi determinado utilizando um contador Coulter. As concentrações de NO e PGE2 foram determinadas pelo reagente de Griess (Sigma) e imunoensaio enzimático (EIA) utilizando um kit Correlate-EIA (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA), respectivamente.

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Exame histopatológico

O tecido que reveste a bolsa foi removido e fixado em solução neutra de formalina. Lâminas de tecido embebidas em parafina foram coradas com hematoxilina-eosina e examinadas ao microscópio óptico para lesões inflamatórias.

Análise estatística

Os resultados são apresentados como média±EP. As comparações experimentais dos grupos foram feitas por análise de variância unidirecional seguida de correção do teste de Tukey. Valor de PA<0.05 was considered statistically significant.

Resultados

In vitro, a cultura de células RAW 264.7, o tratamento com IFN- e LPS aumentaram muito a produção de NO (Figura 1). O pré-tratamento com fucoidan (1–320 µg/mL) não afetou a liberação de NO da linhagem celular de macrófagos (Figura 1A). Em comparação, o extrato de CT (32–320 µg/mL) suprimiu significativamente a produção de NO, indicativo de atividade antiinflamatória (Figura 1B).

A injeção de carragenina na bolsa de ar do camundongo aumentou acentuadamente o volume de exsudato dentro da bolsa (Figura 2). Esse aumento da exsudação foi atenuado pelo tratamento com fucoidan (18 mg/kg) e extrato de CT (54 e 162 mg/kg). Notavelmente, o tratamento combinado de fucoidan e extrato de CT diminuiu ainda mais o volume de exsudato, em comparação com os efeitos individuais, embora combinações de doses mais altas (54+162 mg/kg e 90+270 mg/kg) não tenham apresentado eficácia adicional para a combinação de dose mais baixa (18+54 mg/kg) (Figura 2A). O conteúdo de grau N na bolsa também aumentou drasticamente após a injeção de carragenina (Figura 2B). Em comparação com o efeito moderado do fucoidan, o extrato de CT reduziu acentuadamente a concentração do grau N. O tratamento combinado de fucoidan e extrato de CT diminuiu ainda mais o nível de NO de maneira dependente da dose. Da mesma forma, o aumento do conteúdo de PGE2 foi suprimido sinergicamente pela terapia combinada de fucoidan e extrato de CT (Figura 2C).

Paralelamente aos mediadores inflamatórios na bolsa, o número de células inflamatórias aumentou drasticamente pela injeção de carragenina: 37,8, 4,8 e 24,1 vezes os níveis de controle para neutrófilos, monócitos e linfócitos, respectivamente (Tabela 1). No entanto, o fucoidan e o extrato de CT reduziram significativamente a infiltração de células inflamatórias, na qual o fucoidan foi um pouco superior ao extrato de CT. Inesperadamente, nenhum efeito sinérgico na infiltração de células inflamatórias foi alcançado pela coadministração de fucoidano e extrato de CT.

Conforme inferido a partir da infiltração de células inflamatórias nos exsudatos, o tecido subcutâneo ao redor das bolsas de ar exibia lesões inflamatórias graves (Figura 3). Foram observadas enormes muitas células no tecido subcutâneo espessado exposto à carragenina (Figura 3B), em comparação com as características quase normais nos animais de controle (Figura 3A). Tais lesões inflamatórias foram notavelmente atenuadas pelo tratamento com fucoidan (Figuras 3C e 3D) ou extrato de CT (Figuras 3E e 3F).

Notavelmente, efeitos antiinflamatórios mais elevados foram obtidos pela terapia combinada com fucoidan e extrato de CT (Figuras 3G-3I).

Discussão

Usando um modelo de inflamação de bolsa de ar induzida por arragena em grau in vivo, a injeção de ar nas costas dos roedores induz a proliferação de células que se estratificam na superfície da cavidade para formar uma estrutura semelhante à sinóvia. Neste modelo, a injeção de infiltração de células inflamatórias induzida por carragenina aumentou o exsudato, o que é indicativo de vazamento vascular. A bolsa de ar serve como reservatório de células inflamatórias e mediadores que podem ser facilmente medidos no líquido que se acumula localmente.

Entre os diversos mediadores inflamatórios que podem induzir a permeabilidade vascular, é bem conhecido que o NO e a PGE2 são os principais fatores envolvidos na patogênese de muitas doenças inflamatórias. Eles também são conhecidos como mediadores da indução e percepção da dor. A iNOS, que é expressa e ativada em diversos tipos de células por estimulação com TNF e/ou LPS durante a inflamação, produz concentrações elevadas e persistentes de NO. O NO é uma molécula reguladora importante em diversas funções fisiológicas, como a vasodilatação que leva ao vazamento vascular. A PGE2, que é gerada a partir do ácido araquidônico via COXs, contribui para o desenvolvimento de muitas doenças inflamatórias, e a superprodução de PGE2 em resposta a vários estímulos inflamatórios está associada à regulação positiva dos níveis de COX-II e à progressão da inflamação. Portanto, as vias TNF- - NO e COX-II-PGE2 têm sido consideradas como duas correntes principais de processos inflamatórios, que são bloqueadas por inibidores de iNOS (corticosteróides) e COX (AINEs), respectivamente.

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No presente estudo, a coadministração de fucoidan e extrato de CT reduziu o volume de exsudato na bolsa, sugerindo que possuem atividade supressora contra vazamento vascular (Figura 2A). Em comparação com os efeitos individuais de cada extrato de fucoidano e CT, o tratamento combinatório aumentou ainda mais, implicando que os compostos de grau dois atuam sinergicamente. Tais efeitos sinérgicos entre o fucoidan e o extrato de CT foram apoiados por suas atividades nos níveis de NO e PGE2 nos exsudatos (Figuras 3B e 2C).

Curiosamente, no entanto, foi confirmado que o fucoidan não inibe diretamente a ativação de macrófagos no ensaio in vitro (Figura 1A). Da mesma forma, o potencial inibitório do fucoidan no ensaio in vivo de acúmulo de NO e PGE2 foi relativamente menor que o do extrato de CT (Figuras 2B e 2C). Tal mecanismo de ação do fucoidan é diferente de uma inativação direta das células pelo extrato de CT (Figura 1B). Em comparação, o fucoidan exerceu uma elevada eficácia na inibição da infiltração de células inflamatórias nas bolsas (Tabela 1). O fucoidan foi superior ao extrato de CT no bloqueio da migração de neutrófilos, monócitos e linfócitos para os locais de lesão tecidual induzida pela carragenina. Curiosamente, não houve efeito anti-migratório sinérgico, indicativo de diferentes mecanismos de ação entre o fucoidan e o extrato de CT: isto é, o fucoidan bloqueia a infiltração de células inflamatórias, enquanto o extrato de CT inibe a ativação das células.

As células polimorfonucleares, especialmente os neutrófilos, são os principais componentes celulares recrutados para locais inflamatórios agudos induzidos pela carragenina. Além disso, as células inflamatórias subsequentes, como macrófagos e linfócitos, também desempenham papéis centrais no processo inflamatório, secretando citocinas. Quando pré-tratado com fucoidano ou extrato de CT, o número de glóbulos brancos que migraram para as bolsas de ar injetadas com carragenina foi marcadamente suprimido. Este resultado foi consistente com um efeito que seria obtido por corticosteróides como a dexametasona, mas não por AINEs incluindo a indometacina. Portanto, presume-se que o fucoidano e o extrato de CT tenham, em parte, uma propriedade dos esteróides.

Além da ação bloqueadora na quimiotaxia de células inflamatórias, o extrato de CT pareceu suprimir a ativação de macrófagos. Isto foi confirmado pelas suas ações inibitórias sobre o NO in vitro e in vivo, que é o principal mediador inflamatório produzido pelos macrófagos. Assim, o efeito do extrato de CT nos macrófagos pode ser devido a uma supressão da expressão de mRNA e/ou a uma inibição direta da atividade da iNOS nestas células.

A PGE2 também é um dos principais mediadores inflamatórios. Aumenta paralelamente ao edema tecidual, que é suprimido pelos AINEs, inibidores da COX. A carragenina pode aumentar a produção de PGE2 induzindo o mRNA da COX-II e a proteína COX-II no exsudato da bolsa. Neste modelo, a carragenina aumentou significativamente a quantidade de PGE2 e foi substancialmente suprimida pelo extrato de CT. É interessante notar que este resultado foi consistente com um efeito que seria obtido por um AINE indometacina. Portanto, infere-se a partir dos resultados que o extrato de CT possui propriedades adicionais dos AINEs. Tomados em conjunto, acredita-se que o extrato de CT exerceu efeitos semelhantes aos corticosteróides e aos AINEs no modelo de inflamação induzida pela carragenina e que o fucoidano melhorou aefeitos antiinflamatórios do extrato de CTbloqueando a infiltração de células inflamatórias.

Embora a definição do mecanismo exato de ação exija um estudo mais aprofundado, uma mistura de fucoidan e extrato de CT atenuou marcadamente os sinais inflamatórios, bloqueando as vias TNF- –NO e COX-II – PGE2 na inflamação da bolsa de ar induzida pela carragenina. Estas descobertas fornecem evidências de que o tratamento combinado de fucoidan e extrato de CT pode ser um candidato promissor para o alívio de vários tipos de inflamação que respondem a corticosteróides ou AINEs.

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