Efeitos anti-inflamatórios sinérgicos do extrato de Laminaria Japonica Fucoidan e Cistanche Tubulosa
Mar 03, 2022
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Abstrato
oanti-inflamatórioefeitos de fucoidan eCistanche tubulosa (CT) foram investigados no sistema de cultura de macrófagos Vitro e no modelo de inflamação da bolsa de ar induzida por carragenina in vivo.Cistanche Tubulosaextrato inibiu a produção de óxido nítrico a partir de células de macrófagos RAW 264.7 ativadas, enquanto fucoidan foi inativo. O modelo de inflamação da bolsa de ar in vivo, exsudação vascular induzida por carragenina e concentrações aumentadas de óxido nítrico e prostaglandina E2 nos exsudatos foram suprimidos sinergicamente pela coadministração de fucoidan ouCistanche Ttubosaextrair. Além disso, a inflamação do tecido foi substancialmente atenuada pela terapia combinada. No entanto, não houve efeito sinérgico contra oinflamatórioinfiltração celular, embora fucoidan e CT(Cistanche tubulosa)extrair cada um reduziu marcadamente o número de células. Portanto, sugere-se que fucoidan bloqueia a infiltração deinflamatóriocélulas, enquanto CT(Cistanche tubulosa) inibe a ativação das células, e que seu tratamento combinado pode ser um candidato promissor para o alívio de vários tipos de inflamação.
Palavras-chave: Carragenina, inflamação, fucoidan, extrato de Cistanche tubulosa.
Como resposta imune contra antígenos estranhos, os macrófagos liberam citocinas pró-inflamatórias, como fator de necrose tumoral- (TNF-), interleucina-1 (IL-1), IL-6 e outros [1,2]. Tais citocinas induzem um influxo quimiotático de granulócitos, monócitos, linfócitos e mastócitos para o tecido danificado que promove a remoção do antígeno e a recuperação do tecido [3,4]. No entanto, a infiltração e ativação excessivas das células agravam as lesões teciduais, levando ao edema (exsudação vascular) e à dor, fenômenos inflamatórios bem conhecidos.
O TNF- é um fator importante para induzir a expressão do gene da sintase do óxido nítrico (iNOS) em várias linhagens celulares. mas também causa inflamação [8,9]. Após a lesão tecidual, a degradação por fosfolipases dos fosfolipídios da membrana celular gera ácido araquidônico. O ácido araquidônico é ainda decomposto pela ciclooxigenase (COX) em prostaglandinas (PGs) [10]. Uma quantidade excessiva de PGE2 formada pela COX-II induz várias citocinas para inflamação. Uma vez que tanto o NO quanto a PGE2 atuam como principais fatores de inflamação e indução da dor, as vias TNF- e COX-II-PGE2 são as principais vias do processo inflamatório, que são inibidas por corticosteróides e não esteróides.anti-inflamatóriomedicamentos (AINEs), respectivamente [10,11].
Embora existam vários esteroides e AINEs para a terapia de doenças inflamatórias, esses medicamentos podem causar efeitos adversos no sistema imunológico, trato gastrointestinal, rins, fígado, sistema nervoso central, pressão arterial e sistema cardiovascular [12-14 ]. Portanto, é necessário minimizar os efeitos adversos das terapêuticas químicas, substituindo-as ou utilizando-as em combinação com produtos naturais.
O fucoidan, complexo polissacarídeo sulfato de algas marinhas como Laminaria japonica e Cladosiphonokamuranus amplamente distribuído em muitos países, tem sido utilizado como terapêutica na medicina oriental por um longo período. Em estudos anteriores, foi demonstrado que o fucoidan tem propriedades antioxidantes, anticoagulantes, anticancerígenas eanti-inflamatórioatividades [15,16]. Assim, os efeitos benéficos do fucoidan em doenças inflamatórias, isquemia, disfunção imune e tumores estão atraindo a atenção dos pesquisadores [17,18]. Por outro lado,Cistanche tubulosa(CT) também tem sido amplamente utilizado para medicamentos tradicionais na China. Foi relatado que o extrato de CT reduz a produção de TNF-á e IL-4 que são os principais fatores para a produção de NO na via inflamatória [19].
Esses achados anteriores nos levaram a investigar a eficácia da combinação de fucoidan e CT(Cistanche tubulosa)extrair nas 2 principais vias de inflamação. Para elucidar o mecanismo de ação, analisamos NO e PGE2 nos exsudatos da inflamação da bolsa de ar induzida por carragenina [20].
Materiais e métodos
Materiais
Fucoidan semi-purificado e extrato aquoso de CT(Cistanche tubulosa)foram obtidos de Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Coréia). O fucoidan e o extrato de CT foram mantidos a 4oC, misturados (1:3) e dissolvidos em água purificada antes do uso e administrados por via oral em um volume de 5 mL/kg
Cultura celular e quantificação de NO
A linhagem celular de macrófago murino RAW 264.7 foi adquirida da American Type Culture Collection (Manassas, EUA), e cultivada em meio de águia modificado por Dulbecco (Sigma, St. Louis, EUA) contendo 10 por cento de soro fetal bovino e antibióticos [100 U/mLpenicilina ( Sigma) e 100 µg/mL de estreptomicina (Sigma)]. As células foram incubadas em uma atmosfera de CO2 umidificada a 5% a 37oC.
Para avaliar os efeitos de fucoidan e CT(Cistanche tubulosa)extrato na secreção de NO, células RAW 264.7 (1×106 células/mL) foram incubadas com fucoidan ou extrato de CT (1–320 µg/mL) por 5 min, seguido de interferon- (IFN- , 10 U/mL) e lipopolissacarídeo (LPS, 10 µg/mL) por 24 horas. Em nossos estudos preliminares, foi confirmado que o tratamento com IFN- mais LPS para ativação de células RAW 264.7 não afetou a viabilidade das células até 24 horas e que o fucoidan e o extrato de CT não foram citotóxicos até 1 mg/mL. A concentração de nitrito (NO2–), o produto oxidado do NO, foi medida como indicador de NO. O meio de cultura foi misturado com igual volume de reagente de Griess (1 por cento de sulfanilamida, 0,1 por cento de naftiletilenodiamida em 2,5 por cento de ácido fosfórico) [21], e incubado à temperatura ambiente por 10 min. A concentração de nitrito foi analisada em 540 nm, onde NaNO2 foi usado para gerar uma curva padrão.
Animais e tratamento
Camundongos ICR machos (7 semanas de idade) foram adquiridos da Daehan Biolink (Eumseong, Coréia), e alojados em uma sala com condições ambientais constantes (22±2ºC;40-70 por cento de umidade relativa; 12-hora de luz -ciclo escuro;150-300 brilho lux). A ração granulada e a água purificada estavam disponíveis ad libitum. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and use Committee (IACUC) da Chungbuk National University (CBNU), Coréia, e conduzidos de acordo com os Procedimentos Operacionais Padrão (SOP) do LaboratoryAnimal Research Center, CBNU.
Os camundongos (n=8/grupo) foram tratados oralmente com fucoidan (18 ou 54 mg/kg), CT(Cistanche tubulosa)extrato (54 ou 162 mg/kg), ou sua mistura (18 mais 54, 54 mais 162 ou 90 mais 270 mg/kg) uma vez ao dia durante 7 dias. Baixas doses de fucoidan (18 mg/kg) e extrato de CT (54 mg/kg) foram de doses humanas estimadas de 100 mg/corpo (70 kg) e 300 mg/corpo após tradução da área de superfície do peso corporal (Km{{14) }} para humano/Km=3 para mouse), respectivamente. Altas doses de fucoidan e extrato de CT foram fixadas em 3 vezes, sozinho ou na mistura, e a mistura de dose mais alta foi fixada em 5 vezes para avaliar os efeitos sinérgicos máximos.
No 1º dia de fucoidan e CT(Cistanche tubulosa)tratamento com extrato, os camundongos foram injetados subcutaneamente com 10 mL de ar estéril na parte traseira para formar uma bolsa [22,23]. Após 2 e 5 dias, a bolsa foi reinjetada com 5 mL de ar. Uma hora após o tratamento final, 1 mL de carragenina (1 por cento em solução salina; Sigma) ou seu veículo (solução salina) foi injetado na bolsa.
Análise dos exsudatos
A bolsa de ar foi lavada com 1 mL de solução salina fria 6 horas após a injeção de carragenina, e o volume líquido de fluido de lavagem foi registrado. Os números totais de células inflamatórias, neutrófilos, monócitos e linfócitos foram determinados usando um contador de colter. As concentrações de NO e PGE2 foram determinadas por reagente de Griess (Sigma) e imunoensaio enzimático (EIA) usando um kit correlate-EIA (Assay Designs, Ann Arbor, AnnArboUSA), respectivamente.
Exame histopatológico
O tecido de revestimento da bolsa foi removido e fixado em solução de formalina neutra. Lâminas de tecido embebidas em parafina foram coradas com hematoxilina-eosina e examinadas sob um microscópio de luz para as lesões inflamatórias.
Análise estatística
Os resultados são apresentados como média±EP. As comparações dos grupos experimentais foram feitas por análise de variância unidirecional seguida de correção do teste de Tukey. Um valor P<0.05 was="" considered="" statistically="">
Resultados
A cultura de células RAW 264.7 in vitro, o tratamento com IFN- e LPS aumentaram muito a produção de NO (Figura 1). O pré-tratamento com fucoidan (1–320 µg/mL) não afetou a liberação de NO da linhagem celular de macrófagos (Figura 1A). Em comparação, a TC(Cistanche tubulosa)extrato (32-320 µg/mL) suprimiu significativamente a produção de NO, indicativo deanti-inflamatórioatividade (Figura 1B).
A injeção de carragenina na bolsa de ar do mouse aumentou marcadamente o volume de exsudato dentro da bolsa (Figura 2). Essa exsudação aumentada foi atenuada pelo tratamento com fucoidan (18 mg/kg) e TC(Cistanche tubulosa)extrato (54 e 162mg/kg). Notavelmente, o tratamento combinado de fucoidan e CT(Cistanche tubulosa)O extrato diminuiu ainda mais o volume de exsudatos, em comparação com os efeitos individuais, embora combinações de doses mais altas (54 mais 162 mg/kg e 90 mais 270 mg/kg) não tenham apresentado eficácia adicional para a combinação de dose mais baixa (18 mais 54 mg/kg) (Figura 2A). O conteúdo de NO na bolsa também aumentou drasticamente após a injeção de carragenina (Figura 2B). Em comparação com o efeito leve de fucoidan, CT(Cistanche tubulosa)extrato reduziu acentuadamente a concentração de NO. O tratamento combinado de extrato de fucoidan e CT diminuiu ainda mais o nível de NO de maneira dose-dependente. Da mesma forma, o conteúdo aumentado de PGE2 foi suprimido sinergicamente pela terapia combinada de fucoidan e CT(Cistanche tubulosa)extrato (Figura 2C). Em paralelo com os mediadores inflamatórios na bolsa, o número de células inflamatórias aumentou drasticamente pela injeção de carragenina: 37,8, 4,8 e 24,1 vezes os níveis de controle para neutrófilos, monócitos e linfócitos, respectivamente (Tabela 1) . No entanto, fucoidan e CT(Cistanche tubulosa)O extrato reduziu significativamente a infiltração de células inflamatórias, na qual o fucoidan foi um pouco superior ao extrato de CT. Inesperadamente, nenhum efeito sinérgico na infiltração de células inflamatórias foi alcançado pela coadministração de fucoidan e CT(Cistanche tubulosa)extrair.
Conforme inferido pela infiltração de células inflamatórias nos exsudatos, o tecido subcutâneo ao redor das bolsas de ar exibiu lesões inflamatórias graves (Figura 3). Enormes muitas células no tecido subcutâneo espessado expostas a carragenina foram observadas (Figura 3B), em comparação com as características quase normais em animais de controle (Figura 3A). Tais lesões inflamatórias foram notavelmente atenuadas pelo tratamento com fucoidan (Figuras 3C e 3D) ou TC(Cistanche tubulosa)extrato (Figuras 3E e 3F). Notavelmente, maiores efeitos anti-inflamatórios foram obtidos pela terapia combinada com fucoidan e CT(Cistanche tubulosa)extract(Figuras 3G-3I)
Discussão
Usando um modelo in vivo de inflamação da bolsa de ar induzida por carragenina, a injeção de ar nas costas de roedores induz a proliferação de células que se estratificam na superfície da cavidade para formar uma estrutura semelhante à sinóvia. Neste modelo, a injeção de infiltração de células inflamatórias induzidas por carragenina aumentou o exsudato, o que é indicativo de vazamento vascular. A bolsa de ar serve como um reservatório de células inflamatórias e mediadores que podem ser facilmente medidos no fluido que se acumula localmente.
Dentre os diversos mediadores inflamatórios que podem induzir a permeabilidade vascular, sabe-se que NO e PGE2 são os principais fatores envolvidos na patogênese de muitas doenças inflamatórias [24,25]. Também são conhecidos como mediadores da indução e percepção da dor[10,11]. A iNOS, que é expressa e ativada em diversos tipos de células por estimulação com TNF- e/ou LPS durante a inflamação, produz altas e persistentes concentrações de NO [3,5-7]. O NO é uma importante molécula reguladora em diversas funções fisiológicas, como a vasodilatação levando ao extravasamento vascular [8,9]. A PGE2, que é gerada a partir do ácido araquidônico via cox, contribui para o desenvolvimento de muitas doenças inflamatórias [26,27], e A superprodução de PGE2 em resposta a vários estímulos inflamatórios está associada à regulação positiva do nível de COX-II e à progressão da inflamação [28]. Portanto, as vias TNF- -NO e COX-II-PGE2 têm sido consideradas duas correntes principais de processos inflamatórios, que são bloqueadas por inibidores de iNOS (corticosteróides) e COX (AINEs), respectivamente [22,29].
No presente estudo, a coadministração de fucoidan e CT(Cistanche tubulosa)extrato reduziu o volume de exsudato na bolsa, sugerindo que eles possuem atividade supressora contra vazamento vascular (Figura 2A). Em comparação com os efeitos individuais de cada fucoidan e CT(Cistanche tubulosa)extrato, o tratamento combinado aumentou ainda mais, implicando que a ação dos dois compostos sinergicamente. Tais efeitos sinérgicos entre fucoidan e extrato de CT foram apoiados por suas atividades nos níveis de NO e PGE2 nos exsudatos (Figuras 3B e 2C).
Curiosamente, no entanto, foi confirmado que fucoidan não inibe diretamente a ativação do ensaio in vitro de macrófagos (Figura 1A). Da mesma forma, o potencial inibitório do fucoidan no acúmulo de NO e PGE2 no bioensaio foi relativamente menor que o do CT(Cistanche tubulosa)extrato (Figuras 2B e 2C). Tal mecanismo de ação do fucoidan é diferente de uma inativação direta das células pelo extrato de CT (Figura 1B). Em comparação, o fucoidan exerceu uma alta eficácia na inibição da infiltração de células inflamatórias nas bolsas (Tabela 1). Fucoidan foi superior ao extrato de CT no bloqueio da migração de neutrófilos, monócitos e linfócitos para os locais de lesão tecidual induzida por carragenina. Curiosamente, não houve efeito anti-migratório sinérgico, indicativo de diferentes mecanismos de ação entre o fucoidan e o extrato de CT: ou seja, o fucoidan bloqueia a infiltração de células inflamatórias, enquanto o CT(Cistanche tubulosa)extrato inibe a ativação das células.
As células polimorfonucleares, especialmente os neutrófilos, são os principais componentes celulares recrutados para os sítios inflamatórios agudos induzidos pela carragenina. Além disso, células inflamatórias subsequentes, como macrófagos e linfócitos, também desempenham papéis centrais no processo inflamatório, secretando citocinas [22,30,31]. Quando pré-tratado com fucoidan ou CT(Cistanche tubulosa)extrato, o número de glóbulos brancos que migraram para as bolsas de ar injetadas com carragenina foi marcadamente suprimido. Este resultado foi consistente com um efeito que seria obtido por corticosteróides como a dexametasona, mas não por AINEs incluindo indometacina [23,30]. Portanto, assume-se que o fucoidan e o CT(Cistanche tubulosa)extrato têm em parte uma propriedade de esteróides.
Além da ação bloqueadora na quimiotaxia das células inflamatórias, a TC(Cistanche tubulosa)extrato pareceu suprimir a ativação de macrófagos. Isso foi confirmado por suas ações inibitórias sobre o NO in vitro e in vivo, que é o principal mediador inflamatório produzido pelos macrófagos. Assim, o efeito da TC(Cistanche tubulosa)extrato em macrófagos pode ser devido a uma supressão da expressão de mRNA e/ou uma inibição direta da atividade de iNOS nessas células.
A PGE2 também é um dos principais mediadores inflamatórios. Aumenta em paralelo com o edema tecidual, que é suprimido pelos AINEs, inibidores da COX [21,22]. A carragenina pode aumentar a produção de PGE2 induzindo COX-II mRNA e proteína COX-II no exsudato da bolsa [32]. Neste modelo, a carragenina aumentou significativamente a quantidade de PGE2 e foi substancialmente suprimida por CT(Cistanche tubulosa)extrair. É interessante notar que este resultado foi consistente com um efeito que seria obtido por um AINE indometacina [23]. Portanto, infere-se dos resultados que o extrato de CT possui a propriedade adicional dos AINEs. Em conjunto, acredita-se que a TC(Cistanche tubulosa)O extrato exerceu efeitos semelhantes a corticosteróides e AINEs no modelo de inflamação induzida por carragenina, e que fucoidan melhorou aanti-inflamatórioefeitos do extrato de CT bloqueando a infiltração de células inflamatórias.
Embora a definição do mecanismo de ação exato exija mais estudos, uma mistura de fucoidan e CT(Cistanche tubulosa) extrair sinais inflamatórios marcadamente atenuados, bloqueando as vias TNF--NO e COX-II-PGE2 na inflamação da bolsa de ar induzida por carragenina. Esses achados fornecem evidências de que o tratamento combinado de fucoidan e TC(Cistanche tubulosa)extrato pode ser um candidato promissor para o alívio de vários tipos de inflamação que respondem a corticosteróides ou AINEs.
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