Estudo da função neuroendócrina-imune de Cistanche Deserticola e seus produtos de vaporização de vinho de arroz em modelo de rato induzido por glicocorticóides

Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Bonan Liu, Ji Shi, Zhe Li, Chao Zhang, Pengpeng Liu, Wei Yao e Tianzhu Jia

1 Escola de Farmácia, Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Liaoning, Dalian 116600, China

2 O Segundo Hospital da Dalian Medical University, Dalian 116600, China

Abstrato

A moradora do desertoErva Cistanchefoi registrado pela primeira vez no "Shen Nong Herbal Classic" e está listado como o fitoterápico de primeira linha nesta publicação. /e A Farmacopeia Chinesa registra que pedaços de Cistanche deserticola(CD) e arroz ao vaporCistanche deserticola(WCD) pode ser usado na clínica como os principais tipos de decocções. Depois de ser cozido no vapor com vinho de arroz, os efeitos antienvelhecimento e tonificantes do rim-yang são aprimorados. Neste estudo, detectamos o conteúdo químico de Cistanche Deserticola e WCD e o mecanismo farmacológico de revigorar a deficiência de rim-yang em ratos modelo. Mirar. O objetivo deste estudo foi examinar os efeitos de Cistanche Deseticola e WCD no neuroendócrino-função imunede deficiência de rim-yang em ratos modelo com overdose de glicocorticóides. Materiais e métodos. Ratos Sprague Dawley (SD) foram selecionados. /e ratos foram injetados subcutaneamente com suspensão de água de corticosterona para os ratos modelo com overdose de glicocorticóides. /e ratos de controle positivo foram injetados com pílulas de Jinkuishenqi e doses altas, médias e baixasCistanche Deserticolasuspensões /WCD (1,646 g/(kg dia), 5,48 g/(kg dia), 2,74 g/(kg dia) e 1,37 g/(kg dia), respectivamente); os grupos controle em branco (BC) e controle modelo (MC) receberam o mesmo volume de água destilada do grupo droga por 40 dias consecutivos na dose de 1 mL/100 g. Após a última administração, o sangue foi coletado da aorta abdominal e os níveis séricos de T, CRH, ACTH, CORT, cortisol, IL-10, IL-6, IL-2, TNF - e IFN-c foram medidos. Índices de órgãos da glândula timo e do baço foram calculados. /e expressão de Bax, Bcl-2, caspase-3, Fas e FasL na glândula adrenal foi medida por imuno-histoquímica. /e alterações patológicas no timo e na glândula adrenal foram observadas pela coloração HE (×200). Subconjuntos de linfócitos T no sangue periférico foram detectados por citometria, e a expressão de CaM mRNA nos tecidos do hipotálamo e da hipófise também foi medida por RT-PCR. Resultados. Comparados com o grupo MC, os grupos Cistanche Deserticola e WCD exibiram aumentos na atividade, no índice de órgãos do timo e do baço, nos níveis séricos de T, CRH, ACTH, CORT, cortisol, IL-2 e IL -10, a razão de CD4 plus /CD8 plus , e a expressão de Bcl-2, caspase-3, Fas, FasL e CaM no tecido da hipófise. /eCistanche Deserticolae os grupos WCD também exibiram reduções nos níveis de IL-6, TNF- e IFN-c no soro e na expressão de CaM mRNA no hipotálamo. Conclusões. Cada dose de Cistanche Deseticola e WCD pode neutralizar o hormônio sexual desregulado e os fatores imunológicos em ratos modelo com overdose de glicocorticóides, aumentando e restaurando a eficácia das células nervosas hipotalâmicas e melhorandofunção imune.

Introdução

Cistanche deserticola, que é chamado de "ginseng do deserto", é uma medicina tradicional chinesa que tem sido usada há séculos como uma erva yang-tônica para revigorar o rim e fortalecer o yang [1]. Oito espécies e uma variação de Cistanches Herba foram registradas na China e apenas Cistanche deserticola YC Ma e Cistanche tubulosa (Schenk) Wight são registradas na Farmacopeia Chinesa [2]. Estudos farmacológicos demonstraram que Cistanches Herba exibiu propriedades neuroprotetoras [3], imunomoduladoras [4], cardioprotetoras [5], antifadiga [6], anti-inflamatória [7], hepatoprotetora [8], antioxidante [9], antibacteriana [10], laxante [11] e efeitos antitumorais [12]. O amplo espectro de atividades biológicas relatadas deste gênero tem sido atribuído à composição fitoquímica complexa e variada. Cistanche deserticola contém glicosídeos feniletanoides, iridóides, polissacarídeos [13], etc. O conteúdo de glicosídeos feniletanoides é o mais alto dos materiais medicinais originais [14]. para tratar, dispensar e fazer preparações de acordo com a teoria da medicina tradicional chinesa. Esses produtos processados ​​são denominados pedaços de decocção, que são usados ​​em clínicas. Os objetivos do processamento são aumentar a eficácia e/ou reduzir a toxicidade de drogas brutas. A Farmacopeia Chinesa de 2015 registrou que fatias grossas de Cistanche (CD) e Cistanche cozido no vapor (WCD) podem ser usadas como pedaços de decocção na clínica. Nosso grupo de pesquisa mostrou que o efeito laxante foi aliviado e os efeitos antienvelhecimento e revigorantes do rim-yang foram aprimorados após Cistanche ser cozido no vapor com vinho de arroz [15].

A função do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal-glândula timo (HPAT) é desordenada na síndrome de deficiência de rim-yang [16]. Pacientes com deficiência de rim-yang também apresentam disfunção imunológica extensa. A disfunção do eixo HPA está intimamente relacionada à imunodeficiência. A teoria da rede neuroendócrina-imune (NEI) mostra que os sistemas imunológico e neuroendócrino compartilham muitos ligantes e receptores [17], e o hipotálamo é considerado o pivô para ligar o neuroendócrino ao sistema imunológico.

Neste estudo, replicamos a deficiência de rim-yang em ratos modelo com injeção exógena de corticosteróides e exploramos o mecanismo da deficiência de rim-yang em resposta a diferentes produtos processados ​​de Cistanche deserticola sob a perspectiva da endócrino-função imune.

Materiais e métodos

Materiais e Reagentes.

Cistanche deserticolafoi coletado de Alashan Neimenggu em 2019.5 e identificado como as hastes carnudas secas de Cistanche deserticola YC Ma pelo Prof. Yanjun Zhai (Escola de Farmácia, Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Liaoning, China). Os espécimes de comprovante foram preservados no Centro de Tecnologia de Engenharia de Processamento de Liaoning.

Os compostos padrão de um jugol foram adquiridos de Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, China); cistanoside F, echinacoside, cistanoside A e iso-acteoside foram adquiridos da Must Company (Sichuan China); acteoside foi adquirido de Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, China). O acetonitrilo de grau MS e o metanol foram adquiridos à Merck KGaA (Darmstadt, Alemanha). O ácido fórmico grau HPLC foi adquirido da Merck KGaA (Darmstadt, Alemanha). O vinho de arroz foi adquirido da Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, China).

Corticosterona (CAS: 50-22-6, pureza > 98 por cento, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), pílulas chinkuei shin chewan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), rato ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF- , IL-2 e IL-10 kits de detecção de ELISA foram adquiridos de Nanjing Jian cheng Co., Ltd. /e kit de ELISA de cortisol de rato foi fornecido por BOSK Co ., anticorpo CD4 de rato, anticorpo CD8a (nos. 561833 e 559976), lisado RBC (Solarbio, R1010), solução tampão PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM e -actina a montante e iniciadores a jusante foram fornecidos pelo Kit de Transcrição Reversa Guangzhou Invitrogen Co. (nº RR037A) e Kit de Síntese de cDNA (nº 10000068167) foram fornecidos pela Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Clorofórmio, isopropanol, 75 por cento de etanol, e solução de uretano foram todos analiticamente puros e produzidos pela Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. A água ultrapura foi produzida pelo sistema Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, MA, EUA).

Instrumentos Experimentais

Um marcador enzimático (Thermo, modelo 3530911931), lavador de placas automático (modelo HBS- 4009), medidor de força push-pull com display digital (modelo VICTOR- 50N), centrifugadora de congelamento de alta velocidade (modelo Sigma 3k15 ), ultramicroespectrofotômetro (modelo B-50Q), amplificador de genes (modelo L96G), PCR quantitativo de fluorescência em tempo real (modelo StepOne), citômetro de fluxo (modelo AC66051710132), micrótomo de parafina (modelo Laika), microscópio (Olympus , modelo BS-53) e um instrumento de água pura (modelo F7JA36507).

Preparação de Amostras para UPLC-Q-TOF-MS e Experimentos Farmacológicos.

O WCD foi processado a partir do mesmo lote de Cistanche deserticola em nosso laboratório. Para a preparação de WCD, pedaços secos de CD (5 mm de espessura) (100 g) foram infundidos com vinho de arroz (30 mL), vaporizados em alta pressão (1,25 kPa) por 4 h e depois secos a 55 graus.

Os pós grosseiros de CD e WCD foram embebidos em 10 vezes 95 por cento de etanol por 0,5 h, extraídos por refluxo 3 vezes de cada vez por 1 h e filtrados, e os filtrados de 3 vezes foram combinados. /e etanol foi recuperado sob pressão reduzida e o extrato foi obtido para administração. /e extrato (1 mL) foi adicionado a 50 por cento de metanol, trazendo o volume total para 20 mL, e armazenado a 4 graus para análise de conteúdo.

Condições UPLC-QqQ-MS para análise de extratos de CD e WCD

O sistema UPLC-MS/MS com o software MassLynx 4.1 Analyst foi utilizado para realizar a aquisição e processamento dos dados. /e coluna analítica era um Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) a uma temperatura de 40 graus C. /e fase móvel foi 0,1 por cento de solução aquosa de ácido fórmico (A) e acetonitrila contendo 0,1 por cento de ácido fórmico (B). /e gradiente de eluição foi 0.00–1.00 min com 3 por cento B, 1,01–2.00 min com 3 por cento –11,5 por cento B, 2,01–3.{{ 29}} min com 12% B, 3,01–4.00 min com 15% B, 4,01–5.00 min com 20% B, 5,01–6.00 min com 22 por cento B, 6,01–8.00 min com 25 por cento B e 8,01–9.00 min com 10 por cento B. /e a taxa de fluxo foi de 0,3 mL/min, e o volume de injeção foi 1,0 μL.

O espectrômetro de massa triplo quádruplo Waters (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, EUA) equipado com uma fonte de ionização por eletrospray (ESI) foi usado no modo de íons negativos. /e gás de dessolvatação era nitrogênio com uma taxa de fluxo de 500 L/h a uma temperatura de 250 graus. Todos os compostos detectados foram medidos no modo de monitoramento de reações múltiplas (MRM); A Tabela 1 mostra os parâmetros de energia e a Tabela 2 mostra as curvas de calibração para os componentes analisados.

Preparação de Substâncias de Referência

Tubulosídeo A (3.02 mg), echinacoside (3.00 mg), 2'-acetilacteoside (2,34 mg), acteosídeo (2,45 mg), isoacteoside (0,61 mg), cistanósido F (2,14 mg), salidroside (3,39 mg), ácido geniposidico (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) e catalpol (2,39 mg) foram dissolvidos em metanol para preparar uma solução estoque. /e solução estoque foi diluída com metanol para obter as concentrações apropriadas para as soluções padrão de trabalho. Todas as soluções preparadas foram armazenadas a 4 graus antes do uso.

Preparação e Agrupamento de Modelos Animais

Ratos machos SD (180-220 g) foram adquiridos de Liaoning Chang sheng Biotechnological Co., número de licença para animais: SCXK (Liao) 2015-0001. Todos os ratos foram mantidos com livre acesso a comida e água a 25 graus e umidade relativa de 30-50 por cento. Os animais foram alojados por 7 dias antes dos experimentos.

Cem ratos foram divididos aleatoriamente em 1{{30}} grupos: grupo controle em branco (BC), grupo controle modelo (MC), grupo controle positivo (PC), grupo controle vinho de arroz (WC), CD grupo de dose alta (CD-HD), grupo de dose média de CD (CD-MD), grupo de dose baixa de CD (CD-LD), grupo de dose alta de WCD (WCD-HD), grupo de dose média de WCD (WCD-MD) ) e grupo WCD de baixa dose (WCD-LD). /e doses de CD-HD/WCD-HD, CD-MD/WCD-MD e CD-LD/WCD-LD foram 5,48 g/(kg ∙ d), 2,74 g/ (kg ∙ d) e 1,37 g /(kg ∙ d), respectivamente. /e para o grupo PC foi de 1,646 g/(kg ∙ d), e para o grupo WC, 1 mL/100 g por 40 dias. /e 6º dia após a administração, os ratos foram injetados subcutaneamente com água de corticosterona sus pensão (corticosterona mais 0,1 por cento de dimetilsulfóxido mais 0,1 por cento de Tween-80 mais 0,9 por cento de sódio cloreto), exceto para o grupo BC [18]. A concentração de corticosterona foi de 5 g/L e a dose foi de 0,1 mL/100 g. /e ratos do grupo BC receberam solução salina normal mais 0,1 por cento de dimetilsulfóxido mais 0,1 por cento de Tween- 80 mais 0,9 por cento de cloreto de sódio por injeção na mesma dose.

Determinação das Funções do Eixo HPA

Teste de peso, temperatura e potência de retenção:Um teste de peso foi realizado a cada 3 dias, e a temperatura foi medida a cada 6 dias. durante o experimento. No 39º dia, a força máxima do membro posterior foi medida por um medidor de preensão. Os ratos /e foram colocados em plataformas lisas, fazendo com que seus membros posteriores agarrassem a vara. Os ratos instintivamente agarram qualquer objeto para evitar o movimento para trás quando a cauda é puxada até que a força de tração exceda o aperto. Quando o rato perde o controle, o pré-amplificador pode registrar automaticamente a força máxima de preensão.

Determinação dos níveis de T, CRH, ACTH, CORT e cortisol no soro: Uma hora após a última administração, os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de solução de uretano (20 g/100 mL). /pt, as amostras de sangue foram coletadas, centrifugadas a 3500 r por 15 min para obtenção do soro e armazenadas a -20 graus . As concentrações de T, CRH, ACTH, CORT e cortisol foram medidas com kits de ELISA de rato de acordo com as instruções do fabricante.

Observações ao microscópio: A estrutura morfológica do tecido da glândula adrenal foi observada por coloração HE. O tecido adrenal foi fixado em paraformaldeído a 10%, desidratado em etanol, tornado transparente por solução de xileno, incorporado por métodos convencionais, cortado em fatias de 4 μm de espessura, desparafinado com solução de xileno, hidratado com gradiente de etanol e corado com hematoxilina e eosina solução de coloração. Depois de transparente com xileno, a placa foi selada com goma neutra e observada ao microscópio.

Coloração imuno-histoquímica de Bax, Bcl-2, Caspase-3, Fas e Expressão de Proteínas FasL na Glândula Adrenal

Secções adrenais de rato fixadas em formalina e embebidas em parafina foram desparafinizadas e reidratadas após serem cortadas com uma espessura de 4 μm. Para o bloqueio da atividade da peroxidase endógena, os cortes foram pré-incubados em bloco de peróxido de hidrogênio por 10 min. Os cortes foram mergulhados em 0,01 M citrato (pH 6,0) e aquecidos até a ebulição. /e processo foi repetido após 5-10 min. Após o resfriamento, as seções foram lavadas com PBS (pH 7,2–7,6) 1–2 vezes, deixadas em temperatura ambiente por aproximadamente 5 min e lavadas com PBS (pH 7,2–7,6) 2–3 vezes. /e solução de bloqueio de BSA a 5 por cento foi adicionada à temperatura ambiente, e o excesso de líquido na seção foi sacudido 20 min depois. Anticorpos primários diluídos específicos para Fas/FasL, Bcl-2/Bax e caspase-3 (1:100 diluído com PBS) foram adicionados e incubados a 37 graus por 1 h ou 4 graus durante a noite. As seções /e foram lavadas 2–3 vezes com PBS (pH 7,2–7,6). /en, foi adicionado IgG anti-camundongo de cabra biotinilado e as seções foram secas a 20–37 graus por 20 min e lavadas com PBS (pH 7,2–7,6) 4 vezes por 5 min. Após lavagem completa em PBS, os cortes foram incubados com uma mistura dos reagentes A e B por 30 min, incubados com PBS por 45 min e finalmente revelados com substrato DAB (DAKO) por 30 min antes de serem levemente contracorados com hematoxilina, desidratados, e montado.

Determinação das Funções Imunes

Cálculo do Índice de Órgãos Imunes:Uma hora após a última administração, os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de solução de uretano (20 g/100 mL) e, em seguida, o baço e o timo foram removidos e pesados ​​imediatamente em uma capela estéril. Os coeficientes de peso do baço ou do timo (por cento) peso do baço ou do timo (mg)/peso corporal (g).

Resultados experimentais

Análise UPLC-QqQ-MS:Para obter a melhor separação, formato de pico e um curto tempo de análise, as condições cromatográficas, incluindo coluna, fase móvel e programa de gradiente, foram estudadas em nosso experimento preliminar. /e cromatogramas típicos com modo MRM são apresentados na Figura.A partir da Tabela 4, pudemos ver que os teores de fenil etanol glicosídeos em WCD aumentaram em comparação com os de CD, especialmente para echinacoside e acteoside, enquanto o teor de iridóides foi diminuído em WCD.

Regulação da função do eixo HPA: Os ratos do grupo MC e dos grupos experimentais apresentaram sintomas de deficiência de rim-yang gradualmente após receberem corticosterona. /e sintomas, como perda de peso, hipotermia, perda de brilho do cabelo, espírito caído, atraso na resposta, diminuição significativa no consumo de água e atividade, melhoraram muito nos grupos CD e WCD. A Figura 2(a) mostra as mudanças de peso. /e peso de cada um dos grupos de drogas aumentou, especialmente nos grupos CD-HD e WCD-HD. O ganho de peso no grupo MC foi o menor. A Figura 2(b) mostra as mudanças de temperatura, que foi a menor no grupo MC, e a temperatura aumentou nos grupos WCD-HD, WCD-MD e WCD-LD.

Níveis de T, CRH, ACTH, CORT e Cortisol: A Figura 3 mostra que em comparação com os do grupo BC, o nível de T, CRH, ACTH e CORT no soro do rato diminuiu (P < 0).="" 01)="" e="" o="" nível="" de="" cortisol="" diminuiu="" (p="">< 0.05)="" no="" grupo="" mc.="" comparado="" aos="" do="" grupo="" mc,="" o="" nível="" de="" t="" nos="" grupos="" wcd-hd="" e="" wcd-md="" aumentou="" (p=""><0.01), o="" nível="" de="" crh="" no="" wcd-ld,="" os="" grupos="" wcd-md="" e="" wc="" melhoraram="" (p="">< 0="" 0,01),="" o="" conteúdo="" de="" acth="" aumentou="" nos="" grupos="" cd-hd,="" wcd-md="" e="" wcd-hd="" (p=""><0,01), o="" nível="" cort="" aumentou="" em="" os="" grupos="" cd-md,="" wcd-md="" e="" wcd-hd="" (p="">< 0,01)="" e="" aumentado="" nos="" grupos="" cd="" hd="" e="" wcd-ld="" (p="">< 0,05),="" e="" o="" nível="" de="" cortisol="" aumentou="" em="" cada="" um="" dos="" grupos="" de="">

Resultados da Observação Microscópica: O tecido da glândula adrenal pode ser dividido em camada cortical e camada medular. As camadas corticais incluem as camadas globular, em feixe e reticular. As células contêm mais lipídios e a camada medular consiste principalmente de células de feocromocitoma e uma pequena quantidade de tecido fibroso. Conforme mostrado na Figura 4, descobrimos que tudo estava normal no grupo BC, enquanto no grupo MC, o córtex adrenal apresentava hiperplasia óbvia, atrofia celular e densidade crescente. A faixa bulbosa engrossou e a zona fascicular translúcida, zona reticular estreita e células menores apresentaram coloração irregular e congestão capilar. No grupo PC, os limites cortical e medular eram visíveis. As células das bandas globular e do feixe foram dispostas uniformemente, e a estrutura morfológica foi restaurada. A mesma melhor restauração foi observada nos grupos WCD, e os efeitos no grupo WCD-MD foram melhores do que os dos grupos WCD-HD e WCD-LD. A morfologia da glândula adrenal nos grupos CD não foi tão boa quanto nos grupos WCD.

Imuno-histoquímica: A apoptose neuronal é controlada por muitos genes apoptóticos e antiapoptóticos, principalmente o gene promotor de apoptose Bax e os genes antiapoptóticos da família de genes Bcl-2. Bcl-2 está localizado em organelas reativas produtoras de oxigênio, como as mitocôndrias, o retículo endoplasmático e as membranas nucleares. Bcl-2 tem pouco impacto nos radicais livres de oxigênio, mas pode prevenir danos oxidativos nas células. Bax transporta do citoplasma para a membrana mitocondrial, altera a estrutura da membrana mitocondrial e promove a liberação de citocromo c e a indução de apoptose.

Houve expressão no citoplasma da adrenal da proteína Bax e Bcl{{0}}. A coloração /e mostrou todas as partículas amarelas. Em comparação com a do grupo BC, a densidade óptica média da proteína Bax no grupo MC aumentou significativamente (P < 0,01).="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" mc,="" a="" densidade="" óptica="" média="" nos="" grupos="" cd-ld="" e="" wcd-ld="" diminuiu="" significativamente="" (p="">< 0,01)="" (figura="">Os resultados demonstraram que CD e WCD podem induzir a apoptose em células inflamatórias e reduzir o dano adrenal através da promoção da expressão da proteína FasL e da ligação à proteína Fas, ativando a proteína caspase-3 e desencadeando uma cascata de caspase. O efeito do grupo WCD-HD foi o melhor.

Determinação da Função Imune

Índice de órgãos imunes

Comparado aos do grupo BC, o coeficiente do timo e o índice do baço do grupo MC diminuíram significativamente (P < {{0}}.01).="" comparado="" ao="" grupo="" mc,="" o="" grupo="" wcd-md="" apresentou="" a="" maior="" diferença="" (p="">< 0,05).="" o="" coeficiente="" de="" timo="" estava="" quase="" de="" volta="" ao="" nível="" normal.="" para="" o="" índice="" do="" baço,="" os="" grupos="" wcd="" md,="" wcd-ld="" e="" cd-md="" apresentaram="" diferenças="" significativas="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" mc="" (p="">< 0,01)="" (ver="" figura="" 6).="" portanto,="" o="" tratamento="" com="" wcd="" e="" dc="" pode="" proteger="" os="" órgãos="" imunológicos,="" e="" os="" efeitos="" do="" wcd="" foram="">

Detecção de Subconjuntos de Linfócitos T no Sangue Periférico

A porcentagem de células CD4 plus no quadrante superior esquerdo e células CD8 plus no quadrante inferior direito no BC e em cada grupo de drogas foi maior do que no grupo MC. Em comparação com o grupo BC, a proporção de CD4 plus /CD8 plus diminuiu significativamente no grupo MC (P < 0.01).="" em="" comparação="" com="" o="" grupo="" mc,="" a="" proporção="" de="" cd4="" mais="" d8="" mais="" aumentou="" significativamente="" no="" grupo="" pc,="" no="" grupo="" wcd="" e="" no="" grupo="" cd-hd="" (p="">< 0,01)="" (figura="" 7).="" determinação="" do="" nível="" de="" il{="" {12}},="" il-6,="" il-2,="" tnf-="" e="" ifn-c="" no="">

A Figura 8 mostra que, em comparação com o grupo BC, o nível de IL-6, TNF- e IFN-c aumentou significativamente (P < 0,01).="" nível="" de="" il-10="" e="" il-2="" diminuiu="" no="" grupo="" mc.="" comparado="" ao="" do="" grupo="" mc,="" o="" nível="" de="" il-6,="" tnf-="" e="" ifn-c="" diminuiu="" e="" il-10="" e="" il-2="" aumentaram="" no="" soro="" em="" cada="" um="" dos="" grupos="" de="" drogas.="" o="" efeito="" do="" wcd="" foi="" melhor="" que="" o="" efeito="" do="" dc,="" principalmente="" no="" grupo="" wcd-md,="" no="" qual="" o="" efeito="" foi="" próximo="" ao="" do="" grupo="">

Resultados do Experimento de Observação do Microscópio de Tecidos do Timo

A Figura 9 mostra que no grupo BC, um grande número de linfócitos estava presente. Linfócitos e reticulócitos foram dispostos frouxamente no centro com timócitos redondos ou ovais dispersos. Não houve necrose, infiltração de células inflamatórias e alterações anormais.

O grupo MC apresentou grande quantidade de tecido de necrose linfóide, com arranjo desordenado de linfócitos e reticulócitos no centro. Os timócitos redondos ou ovais desapareceram, a degeneração celular maciça ou necrose era evidente e havia infiltração de células inflamatórias com alterações patológicas anormais.

Nos grupos DC, as características morfológicas dos linfócitos voltaram ao normal, e o arranjo dos linfócitos e reticulócitos centrais era quase normal. Timócitos redondos ou ovais haviam se recuperado, mas um pequeno número de linfócitos degenerativos ou necróticos e células inflamatórias infiltrantes permaneceram.

Nos grupos WCD e PC, as características morfológicas dos linfócitos foram melhor reparadas. /e linfócitos e reticulócitos no centro estavam bem alinhados, os timócitos redondos ou ovais eram quase normais, mas havia um pequeno número de linfócitos infiltrantes e degenerativos.

Expressão do gene da proteína CaM

O valor RQ (mRNA de CaM/-actina mRNA) foi considerado para examinar a expressão de mRNA de CaM. O QR do grupo BC foi 1. A expressão de CaM mRNA no hipotálamo no grupo MC aumentou significativamente (P < 0.01),="" enquanto="" o="" valor="" diminuiu="" no="" wcd-hd,="" grupos="" wcd-md,="" wcd="" ld="" e="" cd-hd="" (p="">< {{10}},05)="" (figura="" 10).="" a="" expressão="" de="" cam="" mrna="" na="" hipófise="" no="" grupo="" mc="" foi="" menor="" do="" que="" no="" grupo="" bc="" (p="">< 0,01).="" a="" expressão="" de="" nos="" grupos="" wcd-hd,="" wcd-md,="" wcd-ld,="" cd-hd="" e="" cd-ld="" aumentou="" (p="">< 0,05),="" e="" o="" efeito="" nos="" grupos="" wcd="" foi="" melhor="" do="" que="" o="" efeito="" nos="" grupos="">

Discussão

A Farmacopeia Chinesa [2] registra que CD e WCD podem ser usados ​​na clínica como os principais tipos de peças decocção. Depois de ser cozido no vapor com vinho de arroz, os efeitos antienvelhecimento e tonificantes do rim-yang foram aprimorados. Através do UPLC-QqQ-MS, detectamos as alterações quantitativas na base do material químico durante o processo de vaporização do vinho de arroz. Os glicosídeos iridóides mostraram-se instáveis ​​e o conteúdo desses glicosídeos diminuiu, tornando-se até mesmo indetectável. O conteúdo de fenil etanol glicosídeos também mudou, o que poderia induzir alterações na farmacodinâmica e no efeito clínico.

O modelo clássico de deficiência de rim-yang foi replicado por injeção subcutânea de corticosterona [19]. A superdosagem de corticosterona poderia inibir o segredo do CRH no hipotálamo. Enquanto isso, o segredo do ACTH também foi inibido. /e o nível de hormônio do córtex adrenal diminuiu e, assim, a função do eixo HPA foi reduzida. A hipofunção do eixo HPA é uma característica comum da deficiência de rim-yang [20]. Em seguida, os ratos apresentam fenômenos de "depleção", e os sintomas estão de acordo com os da deficiência de rim-yang na clínica.

No grupo MC, o nível de CRH, ACTH, T e CORT no soro do rato diminuiu significativamente (P < 0.01).="" após="" ser="" tratado="" por="" cd="" e="" wcd,="" o="" conteúdo="" de="" crh,="" acth,="" t,="" cort="" e="" cortisol="" aumentou="" em="" algum="" grau,="" e="" o="" efeito="" de="" wcd-md="" foi="" o="" melhor,="" quase="" igual="" ao="" do="" grupo="" pc.="" esses="" resultados="" indicaram="" que="" o="" equilíbrio="" hormonal="" relativo="" no="" eixo="" hpa="" foi="" destruído="" no="" grupo="" mc,="" cd="" e="" wcd="" poderiam="" melhorar="" a="" recuperação="" funcional="" dos="" níveis="" hormonais="" anormais="" do="" eixo="" adrenal,="" mas="" o="" efeito="" do="" wcd="" foi="">

A modulação da proporção de membros da família Bcl{0}} é um dos principais mecanismos pelos quais Fas/FasL medeia a via do receptor de morte, e a família Bcl-2 regula a via mitocondrial [21]. Fator inibidor de apoptose Bcl-2 e fatores indutores de apoptose, como Bax, todos pertencem à família Bcl-2 [22]. A apoptose celular pode ser determinada pela razão relativa de fatores inibidores de apoptose e fatores indutores de apoptose [23]. As mitocôndrias tinham a função de checkpoints centrais para muitas formas de apoptose [24]. O presente estudo mostrou que CD-MD e WCDs podem deduzir a expressão de Bax e aumentar Bcl-2 para melhorar a deficiência de rim-yang. Fas é o principal receptor de morte que induz apoptose por ligação com o ligante Fas (FasL) [25]. A expressão de Fas e FasL no grupo MC aumentou, enquanto esta expressão aumentou significativamente no grupo WCD-MD (P <0.01) em="" comparação="" com="" o="" grupo="" mc.="" ambos="" os="" sistemas="" fas/fasl="" e="" bax/bcl-2="" transduzem="" os="" sinais="" apoptóticos="" para="" a="" família="" das="" caspases="" [26].="" a="" caspase-3="" é="" uma="" das="" proteinases="" fundamentais="" que="" iniciam="" a="" apoptose="" celular.="" a="" ativação="" da="" caspase-3="" indica="" que="" a="" apoptose="" entra="" em="" um="" estágio="" irreversível="" [27].="" a="" expressão="" de="" caspase-3="" no="" grupo="" mc="" aumentou="" e="" aumentou="" significativamente="" nos="" grupos="" wcd-hd="" e="" wcd-md="" (p=""><>

Deficiência defunção imuneé uma das manifestações importantes da deficiência de rim-yang [28]. Neste estudo, descobrimos que o índice do baço e do timo do grupo WCD-MD recuperou significativamente (P < 0.01,="" p="">< 0.{{3{="" {32}}}}5).="" resposta="" imune="" do="" sistema="" imunológico="" é="" regulada="" principalmente="" pelos="" subgrupos="" [29].="" il-2="" é="" o="" fator="" de="" crescimento="" para="" células="" t,="" secretado="" por="" células="" t="" e="" macrófagos,="" participa="" da="" regulação="" inflamatória,="" regula="" a="" imunidade="" e="" aumenta="" a="" resistência="" à="" infecção="" [30].="" nível="" de="" il-2="" no="" grupo="" mc="" diminuiu="" (p="">< 0,01),="" e="" após="" tratamento="" com="" cd="" e="" wcd,="" o="" nível="" de="" il-2="" se="" recuperou.="" il-6="" e="" tnf-="" são="" citocinas="" pró-inflamatórias.="" níveis="" aumentados="" de="" il-6="" e="" citocinas="" tnf-="" causam="" desequilíbrios="" de="" citocinas="" e="" exacerbam="" a="" inflamação.="" os="" níveis="" de="" il-6="" e="" tnf-="" aumentaram="" no="" grupo="" mc,="" enquanto="" após="" o="" tratamento,="" os="" níveis="" de="" il-6="" e="" tnf-="" diminuíram.="" as="" células="" t="" são="" divididas="" em="" células="" cd4="" e="" células="" cd8,="" e="" a="" razão="" cd4="" mais="" d8="" mais="" pode="" ser="" usada="" como="" um="" importante="" índice="" de="" regulação="" imune="" [31].="" cd4="" plus="" d8="" plus="" no="" grupo="" mc="" obviamente="" diminuiu="" (p="">< 0,01),="" enquanto="" nos="" grupos="" wcd="" e="" cd="" hd="" aumentou="" (p=""><>

O eixo HPA é o sistema regulador mais importante porque regula a secreção de glicocorticóides e o sistema endócrino para manter a função secretora do córtex adrenal [32]. A superexpressão de mRNA de CaM no tecido hipotálamo foi relacionada à deficiência de yang do rim. CD e WCD podem bloquear os canais de cálcio, inibir a expressão de mRNA de CaM no hipotálamo e diminuir o influxo de cálcio, diminuindo assim a atividade do complexo Ca2 mais ·CaM.

A formação de deficiência de rim-yang tem um processo de desenvolvimento de doença crônica. O rim não é mais um conceito puramente anatômico, e é um termo geral para imunidade neuroendócrina e sistema geniturinário. A rede neuroendócrina-imune (NEI) é um importante sistema regulador integrado [33]. CD e WCD podem regular a função do eixo HPAT e melhorar a recuperação da deficiência de rim-yang. Este resultado fornece a base experimental para a prevenção clínica e tratamento da deficiência de rim-yang.

Referências

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