Caracterização estrutural do polissacarídeo deserticola de Cistanche e seu efeito protetor no alto HK induzido por glicose -2 lesão celular

Resumo:

 

Objetivo: Estudar a estrutura dos polissacarídeos deserticola de Cistanche (CDPs) e o efeito protetor e o mecanismo das células epiteliais tubulares proximais humanas (HK {{0}}}}}}). Métodos: A composição química, peso molecular, composição de monossacarídeos e possível estrutura dos CDPs foram detectados pelo método do fenol de ácido sulfúrico, método hidroxil bifenil, método azul de coomassie brilhante, método de cromatógrafo de íons, cromatografia em cromatografia em gel de alto desempenho e infrarificação. The protective effect of CDPs on HK-2 injury and its mechanism were evaluated by establishing a damage model of HK-2 cells induced by high glucose.Results : The average molecular weight of CDPs was 8031,4198,3444 kDa, which was mainly composed of glucose, galactose, rhamnose, mannose e arabinose, e pode haver um vínculo glicosídico. Pode reduzir o dano oxidativo das células HK -2 induzidas pela glicose alta e o dano do potencial da membrana mitocondrial de células HK -2 induzidas por alta glicose. A expressão relativa da proteína do receptor 4 (TLR4) do tipo Toll (TLR4) e a razão do fator p -nuclear (NF) -κB p65 / -Actin e P -IκB / -Actina em HK -2} diminuíram significativamente após a intervenção com diferentes concentrações de CDPS (p <0,05, p <0,01). Conclusão: os CDPs podem reduzir o altocélula epitelial tubular renal induzida por glicoseLesão inibindo TLR4 / NF-κB para promover a proliferação celular e inibir o estresse oxidativo e a apoptose.

 

Palavras -chave: Polissacarídeo deserticola de cistanche; Células epiteliais tubulares renais humanas; Estresse oxidativo; Caminho TLR4/NF-κB

 

 

 

Cistanche para nefropatia de diabetes (DN)

 

Nefropatia do diabetes (DN)é a principal causa de doença renal em estágio terminal e ameaça seriamente a vida e a saúde dos pacientes [1]. A lesão tubular renal desempenha um papel fundamental na ocorrência e desenvolvimento da DN. Anormalidades hemodinâmicas, estresse oxidativo, resposta inflamatória e anormalidades metabólicas causadas por um ambiente de alto açúcar podem induzir apoptose e necrose de células epiteliais tubulares renais, levando a danos tubulares renais [2,3]. O TLR4 no rim é um membro da família TLRS, e sua transdução de sinal relacionada desempenha um papel importante na ocorrência e desenvolvimento da DN [4]. Sob altas condições de glicose, a alta expressão de TLR4 no rim pode ativar a via NF-κB, agravar a apoptose celular celular e causar apoptose celular HK -2 [5, 6].
Cistanches Herba é o caule carnoso seco com folhas de fósforo do deserticola de Cistanche YCMA e (ou) cistanche tubulosa (Schenk) Wight, uma planta medicinal e comestível tradicional. Tem um gosto doce, salgado,

Está aquecendo e entra norim e meridianos do intestino grosso. Ele tem os efeitos de tonificar o rim yang, melhorar a essência e o sangue e umedecer o intestino e aliviar a constipação. [7] Os polissacarídeos são um dos principais ingredientes ativos do deserticola de Cistanche. O conteúdo dos polissacarídeos no extrato de água de Cistanche Deserticola é relativamente alto, com a literatura relatando que o conteúdo é de 29.598 a 39.609 mg/g [8]. É composto principalmente de glicose, galactose, ramnose, arabinose, frutose etc. É composto por monossacarídeos e tem muitos efeitos farmacológicos, incluindo a regulamentação da atividade imune, a anti-envelhecimento, a melhoria da aprendizagem e a memória, protege os nervos, resistindo à danos hepáticos, antivírus e anti-vírus [9]. Nos últimos anos, um grande número de estudos mostrou que os polissacarídeos na medicina tradicional chinesa podem melhorar a nefropatia diabética. As características multi-alvo e multi-patrimônio e os efeitos significativos dos polissacarídeos herbais chineses mostram grande potencial na intervenção na nefropatia diabética [10]. No estudo de Wang et al. [11], os polissacarídeos banyan mostraram efeitos significativos na melhoria do metabolismo da glicose e lipídios, reduzindo as respostas inflamatórias e regulando a microbiota intestinal de camundongos diabéticos tipo 2 através do eixo do fígado. Estudos anteriores da equipe de pesquisa mostraram que o extrato de água do deserticola de cistanche pode aumentar a taxa de sobrevivência de células HK -2 em um ambiente de alto açúcar e alta gordura, regulam a apoptose celular, o estresse oxidativo e os níveis de inflamação e têm um efeito terapêutico potencial na nefropatia diabética [12]. Os resultados experimentais dos animais mostraram que os CDPs podem melhorar a nefropatia diabética em camundongos, e os resultados patológicos mostraram que a fibrose tubular renal foi significativamente melhorada [13]. No entanto, existem poucos estudos sobre o papel dos polissacarídeos deserticola de Cistanche na proteção do modelo de célula HK {22}} induzido por glicose. Em vista da potencial atividade farmacológica e mecanismo dos polissacarídeos, este estudo tem como objetivo detectar a composição química, a estrutura molecular e a estrutura molecular dos CDPs usando o método de fenol do ácido sulfúrico, hidroxibifenil método, método de coomassie Blue, cromatografia de íons. A massa, a composição de monossacarídeos e a possível estrutura foram analisadas, e um modelo de dano de células HK -2 induzido por alta glicose foi estabelecido para avaliar o efeito protetor dos CDPs em HK -2} e seu mecanismo de ação. Forneça evidências teóricas e experimentais para a aplicação potencial de CDPs no tratamento do DN.

1 materiais e métodos
1.1 Materiais e instrumentos

Cdps (conteúdo de polissacarídeo> 8 0%, número do lote: 2306019, shaanxi xintianyu Company); dapagliflozin (DAPA, número do lote: BMS -512148, AstraZeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.); Células epiteliais tubulares renais humanas HK -2 (número do lote: 20231014, ACTT Company, EUA); MEM Medium de cultura, soro fetal bovino (número do lote: 20231014, 20231014, Gibco Company, EUA); Buffer PBS (número do lote: 20230906, Hyclone Company, EUA); Solução de digestão de tripsina contendo EDTA a 0,25% (número do lote: 20240411, empresa Anhui Biososharp); CCK -8 Kit de detecção de viabilidade celular (número do lote: 20240415, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); Superóxido Dismutase (SOD), Malondialdeído (MDA), Glutationa Peroxidase
Kit de detecção de peroxidase, GSH-PX) (lote nº: 20240505, 20240423, 20240423, Shanghai Youxuan Biotechnology Co., Ltd.); HoechSt33258 Kit de apoptose de coloração (lote no.: 20240223, Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.); JC -1 coloração
Kit de detecção de potencial da membrana mitocondrial (lote nº: 20240319, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); Diacetato de diclorofluoresceína (DCF-DA) Espécies reativas de oxigênio (ROS) Reagente de detecção
Kit (lote no.: 20231225, Pequim Solebow Technology Co., Ltd.); Anticorpo monoclonal de TLR4, fator nuclear fosforilado-κB p65 (fosfo-NF-κB p65, p-nf-κB p65) anticorpo monoclonal (lote n.: 10032512, 00128965, Wuhan Saning Biotechnology Co., Ltd.).

Cromatógrafo de íons ICS5000, leitor de microplacas Mul-Tigo (Thermo Fisher, EUA); PowerPac HC+Mini Proteína Eletroforese Instrumento (Biorad, EUA); Microscópio invertido de TS2 (Nikon, Japão); LC -10 Um cromatógrafo líquido de alto desempenho, ri -20 um detector diferencial (Shimadzu Technology Co., Ltd., Japão); 105-103-101 (8 mm × 300 mm) coluna de gel em tandem (BRT Company, Reino Unido); CPA225D Equilíbrio eletrônico, Eppendorf5424 Centrifuge (Sartorius, Alemanha).

 

1.2 Métodos experimentais
1.2.1 Determinação de açúcar total, ácido urônico e teor de proteínas do CDPS

O método foi seguido de acordo com a referência [14]. O teor total de açúcar dos CDPs foi determinado pelo método do ácido fenol-sulfúrico; O teor de ácido urônico dos CDPs foi determinado pelo método colorimétrico m-hidroxibifenil; e o teor de proteínas dos CDPs foi determinado pelo método azul Coomassie brilhante.

 

1.2.2 Determinação da massa molecular

A distribuição de peso molecular dos polissacarídeos foi detectada por colunas em tandem de cromatografia por permeação em gel de alto desempenho. A series of standard dextran (Dextran P{{0}}, P-10, P-20, P-50, P-100, P-200, P-400 and P-800) and samples were dissolved in 0. 0 5 mol/L antes do uso. A concentração final foi de 5 mg/ml, o vórtex para se dissolver e centrifugada a 12 0 00 r/min por 10 min. O sobrenadante foi aspirado e filtrado com uma membrana microporosa de água de 0,22 μm. Após centrifugação de alta velocidade, 0,05 mol/L NaCl foi usado como fase móvel. A coluna cromatográfica era BRT 105-103-101 (8 mm × 300 mm); A taxa de fluxo foi de 0,7 ml /min; Temperatura da coluna: 40 graus; Volume de injeção: 25 μl; Detector: Detector Diferencial Rid -20 A; Tempo de análise: 62 min. Selecione o método cromatográfico acima para análise, obtenha o tempo de retenção e plote o logaritmo do peso molecular de pico (MP) na ordenada (LGMP) e o tempo de retenção (RT) na abscissa (LGMP-RT). Curva padrão: De acordo com o método acima, foram feitos o método da média do peso da média do peso (MW) e o tempo de retenção da média da média (Mn) da curva padrão da curva padrão LGMN-RT para obter o peso molecular. Fórmula de cálculo. Substituindo o tempo de retenção da amostra na fórmula, o peso molecular (MP, MW, MN) pode ser obtido.

1.2.3 Composição de monossacarídeo

A composição de monossacarídeos foi determinada usando cromatografia iônica. Take appropriate amounts of 16 monosaccharide standards (fucose, rhamnose, arabinose, galactose, glucose, xylose, mannose, fructose, ribose, galacturonic acid, glucuronic acid, aminogalactose hydrochloride) , glucosamine hydrochloride, N-acetyl-D-glucosamine, guluronic acid, mannuronic acid) were added with 2 mL de 3 mol/L de ácido trifluoroacético (TFA), hidrolisado a 120 graus por 3 h, seco com nitrogênio e adicionado para remover o vórtice da água desionizada para misturar bem e preparar a solução estoque padrão. Pegue cada solução padrão de monossacarídeo e prepare com precisão o padrão de concentração como padrão misto. De acordo com o método de quantificação absoluta, as massas de diferentes monossacarídeos foram determinadas e a razão molar foi calculada com base na massa molar dos monossacarídeos.
Adicione 2 ml de 3 mol/l tfa ao polissacarídeo e reaja a 12 0 grau por 3 h. Durante a reação, N2 foi usado para proteção. Dissolva após a evaporação sob pressão reduzida. Adicione 5 ml de água e vórtice para misturar. Tome 5 0 µl e adicione 950 µl de água desionizada. Centrífuga a rpm por 5 min. O sobrenadante foi filtrado através de uma membrana de microfiltração de 0,22 µm e analisado por cromatografia íon. A coluna era Dionex carbopactm PA20 (3 mm × 150 mm); A fase móvel era A: H2O; B: 15 mol/lnaoh; C: 15 mol/ L NaOH e 100 mol/ L Naac; Taxa de fluxo: 0,3 ml/min; Volume de injeção: 25 µl; Temperatura da coluna: 30 graus; Detector: detector eletroquímico; Gradiente de eluição Veja a Tabela 1.

 

Tabela 1 Tabela de eluição de gradiente de fase móvel

 

 

1.2.4 Detecção de espectro infravermelho

Pese 1 mg de polissacarídeo seco e pó KBR, moa e misture -os em uma argamassa e pressione -os em folhas finas usando uma prensa de comprimidos. A análise foi realizada usando o espectrômetro infravermelho de transformação de Fourier na faixa de número de ondas de 4500 ~ 400cm -1.

 

1.2.5 Efeito protetor de CDPs em células HK induzidas por glicose alta -2 na nefropatia diabética

1.2.5.1 HK -2 Cultura de células

Depois que as células HK {0}} foram revividas, elas foram cultivadas em meio completo contendo soro fetal bovino a 10% e um anticorpo duplo a 1%, e as células foram colocadas em uma incubadora de cultura de células em 37 graus, 5% de CO2 e umidade saturada para a parede. . Quando as células crescem para 80% a 90%, elas são digeridas com tripsina a 0,25% e subcultivadas. As células HK -2 na fase de crescimento logarítmicas foram usadas para experimentos subsequentes.

 

1.2.5.2 Preparação da solução estoque de CDPs e concentração de dosagem.

Pesar com precisão 3 0 mg de cdps, adicione 6 ml de meio de alta glicose MEM para preparar uma solução de estoque de 5 mg/ml CDPS e armazená-la em uma geladeira de 4 graus. Ao usar, meça um certo volume de solução de mãe CDPS, adicione meio de cultura, misture bem, esterilize com um filtro estéril de 0,22 µm e prepare uma solução de amostra de concentração apropriada.

 

1.2.5.3 Efeitos de CDPs em células normais HK -2

As células HK -2 na fase de crescimento logarítmicas foram semeadas em placas de poço 96- a uma densidade de 3000 células/poço. De acordo com os resultados experimentais preliminares, as células foram divididas em um grupo de controle normal (grupo controle, CON), diferentes concentrações de massa (25, 50, 100, 200, 400, 800, 1000, 1600 ug/ml)
Um grupo em branco contendo apenas meio de cultura foi estabelecido; Depois de cultivar com meio de cultura ou medicamentos por 24 h e 48 h, foram adicionados 100 μl de meio de cultura contendo 10% de CCK -8} a cada poço e as células foram incubadas a 37 graus para evitar a licença na luz por 1,5 h. The optical density (OD) of each well was measured at a wavelength of 450 nm using a microplate reader, and the cell viability (%) was calculated according to the formula "cell viability (%)=[(OD of drug well - OD of blank well) (OD of control well / OD - OD of blank well) ]×100%" to calculate the cell survival rate and evaluate the toxicity of each group of drogas para células normais.

1.2.5.4 HK -2 Cell High Glicose Modelation Time and Concentration triagem
Prepare a solução estoque de glicose (glicose, GLC) (10 mg/ml) e dilua -a com concentrações completas de meio para modelagem de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 e 80 mmol/L, respectivamente, para uso. As células HK -2 na fase de crescimento logarítmicas foram semeadas em placas de poço 96- a 3000/poço, e CON, grupo modelo (modelo, mod) e grupo de ajuste em branco foram configurados e receberam meio cultura completa e alta cultura de glicose de concentrações diferentes, respectivamente. , quantidade igual de meio de cultura completa, cultura por 24 h e 48 h e detecta viabilidade celular de acordo com o método em "1.2.5.3".

 

1.2.5.5 Efeito dos CDPs na taxa de sobrevivência das células modelo

De acordo com os resultados experimentais de "1.2.5.4", as células HK -2 na fase de crescimento logarítmicas foram semeadas em placas de poço 96- a uma densidade de 3000 células por poço. As células foram divididas em CoN, MOD e diferentes concentrações de massa de 50, 100 e 200, as células foram cultivadas a 400 ug/ml, 400 µg/ml e 800 µg/ml de cdps. Um grupo de ajuste em branco sem células foi configurado. Os grupos Con e em branco foram adicionados com uma quantidade igual de meio completo. O MOD e cada grupo tratado com drogas foram adicionados com 60 mmol/L Glc e cultivados por 24 h. , descarte o meio de cultura, adicione meio de cultura ou medicamentos e cultura correspondentes por 24 h e 48 h e detecte a taxa de sobrevivência celular de acordo com o método em "1.2.5.3".

 

1.2.5.6 Efeitos dos CDPs nos indicadores de estresse oxidativo em células modelo

According to the results of the experiment in "1.2.5.5", the cells were divided into Con, Mod, high dose CDPs group (CDPs-H, 400 mg/kg), middle dose CDPs group (CDPs- M, 200 mg/kg), low-dose CDPs group (CDPs-L, 100 mg/kg) and dapagliflozin group (Dapa, 10 μmol/L), and a blank group without cells was set up In the Grupo de ajuste zero, após modelagem, meio de cultura ou medicamentos correspondentes foram adicionados e cultivados por 24 h. As proteínas foram coletadas e os lisados ​​foram normalizados para o mesmo nível por correção de concentração de proteínas. De acordo com as instruções de cada kit indicador, foram detectados o MDA, o conteúdo de GSH-PX e a atividade da SOD em cada grupo de células.

 

1.2.5.7 Detecção de ROS em HK -2 células

Adicione a suspensão celular a uma placa de poço 6- e coloque -a em uma incubadora de cultura de células até que as células cresçam em uma monocamada e receba a estimulação correspondente. Lave as células 3 vezes com PBS pré-resfriado e diluído com o meio MEM livre de soro. O corante fluorescente DCF-DA foi diluído para uma concentração final de 10 µmol/L. O corante foi adicionado a uma placa de poço 6-, as células foram lavadas 3 vezes com PBS pré-resfriado e o corante fluorescente DCFH-DA foi diluído para uma concentração final de 10 µmol/L com meio MEM livre de soro. µmol/L, o corante foi adicionado a uma placa de poço 6-, o corante foi descartado, as células foram lavadas três vezes com meio MEM livre de soro e, em seguida, as imagens foram coletadas sob um microscópio de fluorescência.