A estabilização simultânea do citoesqueleto de actina em múltiplas células específicas de néfrons protege o rim de lesões diversas

Doenças renais crônicaselesão renal agudasão mecanicamentedoenças renais distintas. Embora as doenças renais crônicas estejam associadas alesão podocitária, lesão renal agudaafeta as células epiteliais tubulares renais. Apesar dessas diferenças,uma característica fundamentalde ambosdoenças renais agudas e crônicasé o citoesqueleto de actina desregulado. Nós mostramos queativação farmacológica da dinamina GTPasemelhora a lesão podocitária emmodelos murinos de doenças renais crônicasporpromovendo a polimerização da actina. Aqui estabelecemos o papel da dinamina na modulação da rigidez e polaridade docélulas epiteliais tubulares renaisreticulando filamentos de actina em redes ramificadas. A ativação da capacidade de reticulação da dinamina por um agonista de molécula pequena estabiliza o córtex da actomiosina da membrana apical contra lesões, que por sua vezpreserva a função renalem vários modelos murinos de lesão renal aguda. Notavelmente, um agonista de dinamina atenua simultaneamente podócitos elesão tubularno modelo genético murino da síndrome de Alport. Nosso estudo fornece evidências da viabilidade e destaca abenefícios de novas terapias holísticas de proteção de néfrons.

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Oprincipais causas de lesão renal aguda(AKI) sãoisquemia, hipóxia, ounefrotoxicidade1. Embora possa ser revertida, a LRA representa um problema de saúde significativo, com alta mortalidade e sem tratamento definitivo. Independentemente de sua etiologia, a LRA lesa principalmente células epiteliais polarizadas dos túbulos renais, cujas microvilosidades apicais formam a borda em escova tubular que participa da coordenação do transporte essencial de eletrólitos e água2. Uma característica morfológica inicial da LRA é a perda da borda em escova e da polaridade celular devido à quebra do córtex da actomiosina na membrana apical1.

O estabelecimento e a manutenção da polaridade celular envolvem cascatas de sinalização, tráfego de membrana e dinâmica do citoesqueleto, todos altamente coordenados3. A organização da membrana apical é em grande parte determinada pela arquitetura das redes de actomiosina4, que estabelece a rigidez do córtex, facilitando assim o agrupamento de proteínas de polaridade. Embora os motores da miosina II sejam considerados o principal gerador de rigidez cortical5,6, a arquitetura do córtex da actomiosina é estabelecida por uma miríade de proteínas de ligação à actina (ABPs)7.

Além dos ABPs conhecidos, a borda em escova dos túbulos renais é altamente enriquecida em dinamina8, uma GTPase mais conhecida por seu papel na endocitose9. A dinamina tem uma propensão intrínseca de se agrupar em múltiplos estados de oligomerização, como dímeros, tetrâmeros, anéis e espirais9. Identificamos pela primeira vez interações diretas dinamina-actina10 e mostramos que a oligomerização da dinamina regula a polimerização da actina em podócitos11,12, células especializadas essenciais para a seletividade do filtro renal. Utilizando modelos murinos de DRC, mostramos que a ativação da polimerização de actina dependente de dinamina reverte a lesão podocitária, restaurando sua estrutura e função únicas .

Aqui mostramos que emcélulas epiteliais tubulares renais, a dinamina faz a ligação cruzada da actina filamentosa (F-actina) em redes ramificadas. A capacidade de reticulação do Dynamin é definida pelo seu estado de oligomerização e pelo comprimento da F-actina. A ativação farmacológica da oligomerização da dinamina neutraliza a LRA, estabilizando as redes de actina e, portanto, a integridade celular, que protege parcialmente as células epiteliais renais da lesão induzida pelo estresse oxidativo. Nosso estudo identifica o córtex de actomiosina da membrana apical da célula tubular renal como um alvo drogado na LRA via dinamina como proxy

Resultados A oligomerização da dinamina estabelece a rigidez e a morfologia da membrana apical.

Para examinar o papel das interações dinamina-actina em células epiteliais tubulares renais polarizadas, utilizamos Bis-T-23, um ativador alostérico da oligomerização de dinamina dependente de actina em um sistema reconstituído13, nas células11,13, e no organismo inteiro12. Os fenótipos celulares foram avaliados em células do Rim Canino Madin-Darby (MDCK) seguindo o status da F-actina e o padrão de coloração de uma proteína de junção estreita zonula occludens-1 (ZO-1), que é considerado um biomarcador de polaridade celular. Citocalasina D (CytoD) e latrunculina A (LatA), inibidores conhecidos da polimerização de actina, diminuíram os níveis de F-actina e induziram coloração descontínua de ZO -1 (Figura 1a suplementar). Em contraste, Bis-T-23 induziu um ligeiro aumento nos níveis de F-actina sem qualquer efeito na coloração ZO-1. Adição de Bis-T-23 antes, mas não depois de LatA, níveis de actina F parcialmente preservados e polaridade celular. Nem o veículo DMSO nem o inibidor de dinamina dynole14 exibiram qualquer efeito (Figura 1a Complementar).

A microscopia eletrônica de varredura (MEV) nos permitiu visualizar alterações da morfologia celular induzidas por drogas, com foco na membrana apical (Fig. 1a). A altura média das células MDCK foi de 11 ± 2 µm, e o comprimento médio das microvilosidades foi de 0,63 ± 0,2 µm (Tabela 1), o que está dentro da faixa observada no rim15. LatA diminuiu a altura das células e o comprimento das microvilosidades e deslocou as microvilosidades uniformemente distribuídas em aglomerados, enquanto Bis-T -23 induziu os efeitos opostos (Tabela 1, Fig. 1a). Quando adicionado antes do LatA, o Bis-T-23 preservou parcialmente a altura das células e o comprimento das microvilosidades. Como as microvilosidades exibem um excelente controle de comprimento definido pela actina cortical em sua base, esses dados fornecem evidências de que o Bis-T -23 modificou o córtex da actomiosina na membrana apical.

Para determinar o efeito exato que o Bis-T-23 teve na actina cortical, visualizamos o córtex da actomiosina dentro dos lamelipódios usando microscopia eletrônica de réplica de platina (PR-EM). LatA diminuiu a densidade das redes de actina, e este efeito foi parcialmente anulado pela adição de Bis-T -23 antes de LatA (Fig. 1b). Como o LatA acelera a despolimerização do filamento de actina sequestrando monômeros de actina, examinamos em seguida se a preservação observada do córtex da actomiosina pelo Bis-T -23 era devida ao seu efeito positivo na polimerização da actina. Em contraste com a potente estimulação da polimerização de actina observada em extratos de células de podócitos , o Bis-T -23 aumentou apenas marginalmente a polimerização de actina no extrato de células MDCK (Figura 1b suplementar). Da mesma forma, a imunodepleção da dinamina endógena -2 (Dyn2) do extrato ou inibição de sua atividade GTPase pelo dínodo resultou em comprometimento marginal da polimerização da actina (Figura 1c Complementar). Embora LatA e CytoD tenham prejudicado significativamente a polimerização da actina, a adição de Bis-T -23 antes de LatA ou CytoD não foi capaz de superar seus efeitos inibitórios (Figura 1d, e suplementar). A jasplakinolida, uma droga que induz a polimerização da actina estimulando a nucleação do filamento de actina, não aumentou significativamente o nível geral de polimerização (Figura 1d suplementar), sugerindo que o lisado de células MDCK exibe um nível quase máximo de actina polimerizada. Juntos, esses dados indicaram que os efeitos do Bis-T-23 na morfologia da membrana apical nas células MDCK foram impulsionados por um mecanismo diferente da polimerização da actina.

Dado o conhecimento comum da localização enriquecida de Dyn2 e F-actina na borda em escova das células epiteliais renais e do papel da dinamina na endocitose, investigamos em seguida se Bis-T -23 estava afetando a actina indiretamente através de alterações na endocitose. Como esperado, tanto a Dyn2 quanto a F-actina co-localizaram-se no córtex da actomiosina abaixo da membrana apical, dentro das microvilosidades e nas fossas revestidas de clatrina (CCPs), definidas por sua forma e tamanho distintos (Figura 1f Complementar). Examinamos a dinâmica dos CCPs usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) . Bis-T-23, mesmo em sua concentração mais alta, não teve efeito na distribuição dos tempos de vida dos CCPs, enquanto o dinole diminuiu o número de CCPs produtivos (Figura 1g Complementar). Esta falta de correlação entre o nível de endocitose e alterações na morfologia celular afirma que o Bis-T- 23 tem como alvo a actina cortical sem influenciar o papel da dinamina na endocitose.

Como a polaridade das células renais é mantida pela arquitetura e contração sustentada das redes de actomiosina, que estabelece a rigidez celular na membrana apical, em seguida medimos a rigidez celular usando microscopia de força atômica (AFM). O sistema Nanoizard IV e o software de análise JPK foram usados ​​para determinar mudanças no Módulo de Young sob diferentes configurações experimentais (Figura 2a Complementar). O tratamento com LatA resultou em uma diminuição significativa na rigidez de contato célula-célula e na rigidez celular apical nas células MDCK (Fig. 1c – e). Em contraste, Bis-T-23 aumentou significativamente a rigidez celular em comparação com o veículo DMSO (Fig. 1c – e), consistente com seus efeitos positivos na altura celular, número de microvilosidades e densidade de redes de actina (Tabela 1 e Figura 1b)22. A adição de Bis-T -23 antes do LatA reduziu fortemente o efeito negativo do LatA na rigidez celular (Fig. 1c – e), de acordo com o efeito positivo do Bis-T -23 nas redes de actina e morfologia celular apical (Tabela 1, Fig. 1b).

Figura 1 A oligomerização da dinamina define a rigidez celular influenciando a arquitetura da actina nas células epiteliais renais. a Imagens SEM representativas de células MDCK tratadas com DMSO (0,1%) ou Bis-T-23 (30 µM, 0,1% DMSO) por 1 0 min antes da adição de DMSO (0,1%) ou LatA (0,2 µM, 0,1% DMSO) por 2{{23} } min. Imagens ampliadas das inserções (regiões em caixa laranja) mostram o arranjo, distribuição e densidade das microvilosidades na membrana apical. b Imagens representativas PR-EM de células MDCK tratadas conforme explicado em (a). As imagens mostram alterações na organização do córtex da actomiosina nas células MDCK nas condições indicadas. c Imagens representativas de mapas de módulo de Young de células MDCK tratadas conforme explicado em (a). d, e Gráficos de barras representando o Módulo de Young representando a rigidez celular medida na junção célula-célula (d) ou na membrana apical (e). Cada símbolo representa a rigidez média de uma única célula. Os resultados mostrados em d, e foram gerados a partir de pelo menos 10 células de pelo menos três placas de cultura. Barras de erro, média ± DP (*P menor ou igual a 0,05, **P menor ou igual a 0,01, ***P menor ou igual a 0,001, ****P menor ou igual a 0,0001, não pareado teste t bicaudal). ns, não significativo.

Também determinamos a rigidez celular usando o sistema BioScope II como uma abordagem experimental alternativa para AFM. Neste caso, as curvas de indentação de força foram obtidas seguindo o modelo de Discher e colaboradores calculado com o software Matlab23. Tendências semelhantes em relação à rigidez celular foram registradas para a interação entre LatA e Bis-T-23 (Fig. Complementar 2b, 2c). Além disso, o dínodo não exibiu qualquer efeito na rigidez celular, enquanto o CytoD diminuiu significativamente a rigidez celular (Fig. Complementar 2d, e), de acordo com os seus fenótipos de actina (Fig. Complementar 1a). Juntos, esses dados estabelecem a correlação entre o estado do córtex da actomiosina, a rigidez celular, a morfologia da membrana apical e a polaridade celular. Estas descobertas também demonstram de forma convincente o papel da oligomerização da dinamina na definição de parâmetros mecânicos da polaridade das células epiteliais através do seu efeito no córtex da actomiosina

Dynamin interliga os filamentos de actina em redes ramificadas que sustentam a polaridade celular. A fim de elucidar o mecanismo molecular pelo qual a oligomerização da dinamina influencia a arquitetura do córtex da actomiosina, examinamos a seguir o efeito da dinamina nos filamentos de actina em um sistema reconstituído. Com base na hipótese atual, o comprimento dos filamentos de actina define o seu modo de reticulação6. Como o comprimento médio dos filamentos de actina corticais dentro de uma rede na borda principal está entre 100 e 150 nm, examinamos os efeitos da dinamina na organização de filamentos mais curtos gerados pelo capeamento da F-actina com gelsolina (Gsn-actina) (Fig. 2a). A adição de Dyn2 resultou na formação de redes grandes e ramificadas (Fig. 2b, c). Com base nos tamanhos e formatos do Dyn2 recombinante (Fig. 2d), as redes foram formadas predominantemente por dímeros Dyn2 (Dyn2DIMER) e tetrâmeros (Dyn2TETRA) que interagiram com vários filamentos de actina (Fig. 2e): Dyn2DIMER ligado a dois filamentos, Dyn2TETRA ligou até quatro filamentos e Dyn2RING ligou até seis filamentos. A baixa ampliação das imagens revelou que as redes dependentes de dinamina formam um padrão de formas anulares menores e maiores (Fig. 2c).

Para correlacionar as observações do sistema reconstituído com o papel da dinamina nas células, determinamos em seguida a localização de Dyn2 endógeno em redes de actina cortical usando um anticorpo monoclonal anti-Dyn2 seguido por um anticorpo secundário conjugado com ouro (Figura 3a-c suplementar). Como visto no sistema reconstituído, a dinamina está associada a um número distinto de F-actina dentro de redes ramificadas (Fig. 2f). Juntos, esses dados identificam uma nova atividade da dinamina, que é a ligação cruzada da F-actina em redes ramificadas.

Para correlacionar a capacidade de reticulação da dinamina e o efeito protetor do Bis-T-23 no córtex da actomiosina e na morfologia da membrana apical, examinamos em seguida os efeitos do Bis-T-23 na mediada pela dinamina redes em sistemas reconstituídos (Fig. 3a). Com base em gráficos de contorno, que fornecem representações topográficas de diferentes densidades de filamentos, Bis T-23 aumentou a densidade geral da rede (Fig. 3a), o que pode ser explicado pelo aumento no número de F-actina ligada à dinamina devido a o aumento da sua oligomerização. Além disso, a dinamina reticulou de forma mais potente os filamentos mais curtos do que a F-actina longa (Fig. 3a-c), sugerindo que a capacidade da dinamina de formar redes ramificadas é definida pelo seu estado de oligomerização e pelo comprimento dos filamentos de actina. A capacidade de interligar filamentos de actina em redes foi compartilhada por duas isoformas de dinamina, Dyn2 onipresentemente expressa e dinamina específica de neurônios -1 (Dyn1) (Fig. 3b, c).

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