Tornando-se Micro na Leptospirose, Doença Renal Ⅱ

4. Respostas de imunidade do hospedeiro a Leptospira spp.

A principal via da Leptospira é a penetração direta de mucosas ou pele aberta através de sangue, tecidos, urina ou água contaminada, que se espalha pela circulação sistêmica e se dissemina em diversos órgãos, como ofígado, pulmão e túbulo proximal donéfron nos rins, onde pode se multiplicar e sobreviver por um mês [51]. Na fase inicial da infecção, oresposta imune inatadesempenha papel fundamental como primeira linha de defesa na leptospirose, afetando a resposta doreceptores de reconhecimento de padrões, fagocitose de macrófagos, indução de extracelularacumulação de neutrófilos, eintervenção do sistema complemento [52].

Oresposta imunenos seres humanos desempenha um papel essencial nadesenvolvimento de sinais clínicos, assim como os fatores de virulência de algumas cepas patogênicas. A maior parte da leptospirose humana é assintomática ou leve, e apenas 10% dos casos desenvolvem formas graves com falência de múltiplos órgãos e aumento das taxas de mortalidade relacionadas a uma doença.tempestade de citocinase um estado de imunoparalisia. As espécies patogênicas estimulam uma resposta humoral na fase de bacteremia, embora o comportamento subsequente daresposta imunenão está claro. Em estudos de pacientes com múltiplas manifestações clínicas de leptospirose, a gravidade do quadro clínico tem sido associada a vários níveis séricos de citocinas, como TNF-, IL-10 e IL-6 [53], mas esta conclusão permanece controversa [54]. Estas condições levaram a um interesse crescente na compreensão da resposta imune em geral e dos eventos biológicos que ocorrem durante a infecção.

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4.1. Leptospira e o Sistema Complemento

A atividade proteolítica das proteases leptospirais contra a matriz extracelular permite que a infecção entre na corrente circulatória. O sistema complemento no sistema circulatório é um dos principais mecanismos da resposta imune inata à Leptospira patogênica. No entanto, a Leptospira desenvolveu estratégias para escapar do ataque do sistema complemento, ligando-se a proteínas a moléculas do complemento e produzindo proteases, como a termolisina, uma enzima metaloproteinase neutra termoestável que afeta a cadeia da proteína C3. Cepas patogênicas ligam-se ao fator H (FH), à proteína 1 relacionada ao fator H do complemento (FHR-1), à proteína 1 semelhante ao fator H (FHL-1) e à proteína de ligação C4b (C4BP), todas dos quais são responsáveis ​​por inibir o sistema complemento [55]. Existem três estratégias principais para a evasão do complemento da Leptospira patogênica [55,56] através da interferência dos reguladores do complemento do hospedeiro, da protease do hospedeiro e da protease bacteriana. Para reguladores do complemento, a Leptospira utiliza o Fator H (FH; um regulador da via alternativa do complemento) e a proteína de ligação ao C4 (C4BP; um regulador das vias clássica e da lectina do complemento) para acelerar o decaimento das convertases C3 e também atuar como cofatores para o Fator I. para a clivagem de C3b e C4b [57,58]. A proteína leptospiral (LcpA), juntamente com a vitronectina (Vn; um regulador da via terminal) liga-se ao C9 e inibe sua polimerização [59], bloqueando potencialmente a formação do complexo ativador de membrana (MAC) [60]. Além disso, a Leptospira patogênica se liga a várias proteases do hospedeiro, como o ativador de plasminogênio do tipo Urokinase (uPA), que induz a plasmina ativa [61] (uma serina protease) para digestão de C3b, C4b e C5 na superfície da Leptospira [62]. Além disso, metaloproteases e termolisina, a protease endógena de Leptospira, podem clivar e inativar várias proteínas do complemento (C2, C3, C4 e Fator B) [60]. A combinação de reguladores do complemento, do hospedeiro e da Leptospira patogênica, facilita a colonização bacteriana nos órgãos-alvo do hospedeiro [63].

4.2. Leptospira e neutrófilos

Durante a infecção, as espécies patogênicas de Leptospira desencadeiam forte ativação de neutrófilos e resposta pró-inflamatória. Os neutrófilos são importantes para o controle de microrganismos, mas também contribuem para danos nos tecidos do hospedeiro. Foi demonstrado que baixos níveis de acúmulo extracelular de neutrófilos devido à baixa atividade de neutrófilos na circulação aumentam a leptospiremia, indicando que a formação intravascular de recrutamento de neutrófilos pode ser crítica na prevenção da disseminação precoce da Leptospira patogênica [64].

4.3. Leptospira e Macrófagos

Na fase inicial da infecção por Leptospira, os macrófagos desempenham um papel importante na eliminação da espiroqueta. Este mecanismo efetor, juntamente com uma resposta eficiente de citocinas, está relacionado ao controle fagocitário e à disseminação da infecção, embora Leptospira spp. demonstrou induzir apoptose em macrófagos através da via Fas/FasL-caspase-8/-3 e facilitar sua sobrevivência e proliferação no hospedeiro devido à liberação de apoptose e endonuclease indutoras de fator mitocondrial em infectados macrófagos [65]. Pesquisas recentes foram conduzidas sobre o microtranscriptoma de macrófagos infectados com Leptospira para determinar os mecanismos epigenéticos, como a regulação pós-transcricional pelo RNA. Macrófagos infectados com Leptospira demonstraram que os microRNAs (miRNAs) são regulados pela infecção pela espiroqueta, demonstrando que esta regulação é de vital importância na resposta dessas células do sistema imunológico na infecção por Leptospira (66). Em macrófagos humanos, a ativação da inflamação mediada por espécies reativas de oxigênio e catepsina B lisossomal gerada pela infecção por Leptospira apresenta níveis proeminentes de NLRP3 e IL-18, favorecendo a produção de IL-1 e levando a uma alta possibilidade de fagocitose e a rápida modelagem de algumas citocinas correlacionadas com a resistência à leptospirose [67].

4.4. Resposta Humoral à Leptospira

A resposta humoral específica contra a Leptospira é caracterizada pela produção de anticorpos IgM e IgG no terceiro dia do início dos sintomas. Além disso, a produção de IgA foi relatada desde o primeiro dia até o nono mês pós-infecção; na verdade, o aumento de IgM tem sido utilizado como medida alternativa no diagnóstico precoce da leptospirose [68]. O efeito da resposta humoral em humanos com leptospirose permite que o diagnóstico sorológico seja feito após a infecção natural [69]. O aspecto mais importante da resposta humoral na infecção por Leptospira pode ser a formação de anticorpos protetores. As vacinas atualmente disponíveis para a leptospirose são compostas por preparações celulares completas e apresentam limitações, como baixa eficácia, múltiplos efeitos colaterais, baixa geração de memória imunológica e falta de proteção cruzada para diferenças sorovares. Assim, o desenvolvimento de novas vacinas é necessário para o controle da doença, e atualmente estão sendo realizadas pesquisas para produzir vacinas a partir da imunização genética [70]. Os OMPs da Leptospira têm sido considerados um antígeno, com melhor imunogenicidade para os linfócitos B, que incluem os epítopos estruturais OmpL187- 98, OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL4130-48, LipL{ {9}} e LipL41263-282 [71]. Estes epítopos são candidatos promissores para o desenvolvimento de uma vacina universal.

4.5. Resposta Imune Adaptativa à Leptospira: Células T e Citocinas

Espécies patogênicas de Leptospira induzem resposta imune mediada por linfócitos T e B, acompanhada pela expressão de citocinas que podem estar associadas a gráficos gravitacionais. A ativação das células T durante a infecção por Leptospira inicia a resposta inflamatória, principalmente através da produção de citocinas. Isto é fundamental na eliminação precoce da infecção, mas a produção descontrolada de citocinas pró-inflamatórias também pode resultar em superprodução de citocinas seguida por um estado de imunoparalisia, que pode levar à sepse e à falência de múltiplos órgãos. Os linfócitos T produzem IL-1, IL-6, IL-12, interferon (IFN)- e TNF-, que funcionam como quimioatraentes para recrutar leucócitos no local da infecção. Curiosamente, in ex vivo, as células T δ virgens proliferaram em culturas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) estimuladas com antígenos de Leptospira juntamente com a produção de IL -17 e IFN (72). Além disso, enquanto camundongos do tipo selvagem infectados com leptospirose demonstraram níveis mais elevados de muitas citocinas, incluindo IL-4, IL-10 e IL-13 em comparação com camundongos não infectados, a doença crônica murina induzida por Leptospira nefrite (camundongos Daf1-/-) apresentaram maior expressão de actina de músculo liso, IL-10, IL-13, mas nenhuma diferença de IL-12 e IL{{21} } níveis [73]. Como tal, Daf1 e IL-17 podem desempenhar um papel protetor crucial na progressão da DRC como a ligação entre a DRC murina induzida pela Leptospira e a fibrose renal [72,73]. No entanto, a hipótese de resposta de citocinas selecionadas na progressão da doença ainda é inconclusiva na leptospirose humana até o momento. Em pacientes com leptospirose grave e envolvimento pulmonar, foram obtidos níveis elevados de IL-6, CXCL8 e IL-10 quando comparados a pacientes com leptospirose leve [53]. Estas altas concentrações de citocinas em pacientes com leptospirose destacam o seu papel fundamental no desenvolvimento da leptospirose grave.

Em pacientes com infecção grave, são encontrados linfócitos T CD4+ com perfil pró-inflamatório e produtores de IL-2 e IFN-, enquanto CD4+CD25altos produtores de IL-10 estão quase ausentes. A regulação da resposta imune mediada por linfócitos T não parece prevenir o dano tecidual gerado pela resposta inflamatória à Leptospira. Nos linfócitos T CD4+ de humanos com leptospirose grave, a produção de TNF e outras citocinas pró-inflamatórias é maior do que naqueles com a forma leve da doença, o que indica que essas citocinas podem ser usadas como marcadores de gravidade na fase imunológica da infecção [74]. A produção de IL-10 tem sido associada ao risco de morte em humanos com leptospirose; entretanto, um estudo realizado em humanos expostos e assintomáticos associou a produção dessa citocina ao controle da resposta inflamatória e à sobrevivência [74]. Durante a infecção por Leptospira, os mediadores inflamatórios e a ação de algumas células leucocitárias, como os linfócitos T, são rapidamente regulados em indivíduos resistentes, ao contrário do que ocorre em indivíduos com formas graves de leptospirose [75].

Em suma, a resposta imune à infecção por Leptospira não é totalmente compreendida devido aos comportamentos clínicos dos pacientes com leptospirose, que interagem com os diferentes fatores de virulência do genoma bacteriano, o que confere à Leptospira uma sólida capacidade patogênica.

5. Manifestações Clínicas

As manifestações clínicas da leptospirose são diversas, variando desde sintomas leves e inespecíficos, como sintomas semelhantes aos da gripe (febre, mialgia e dor de cabeça), até sintomas graves, juntamente com lesões de órgãos em estágio terminal (por exemplo, LRA, insuficiência hepática aguda). e diátese hemorrágica, também conhecida como síndrome de Weil), hemoptise aguda por hemorragia pulmonar, confusão aguda por meningoencefalite asséptica e insuficiência cardíaca aguda por miocardite aguda ou subaguda [7]. Assim, os três indicadores de suspeita de infecção por leptospirose consistem em (i)doença febril aguda, (ii) icterícia e (iii)lesão renal aguda[12]. Os preditores de uma forma grave de leptospirose são mialgia grave no início, tendência a sangramento grave e icterícia acentuada. Curiosamente, a presença de qualquer pré-existentedoença renal crônica(tamanho pequeno do rim) ou rins aumentados e congestionados com anúria estão relacionados ao pior resultado [12]. Assim, os pacientes com doença renal associada à leptospirose devem ser tratados imediatamente.

6. Diagnóstico

6.1. Diagnóstico clínico

O diagnóstico de leptospirose é baseado na história de exposição, fatores de risco e manifestações clínicas. Um alto índice de suspeita pode evitar danos posteriores aos órgãos. No entanto, os sintomas da leptospirose são frequentemente confundidos com outras causas de síndrome febril aguda, como infecção por dengue, malária, hepatite e doença autoimune ativa. A falta de sinais patognomônicos de leptospirose significa que o diagnóstico é provisoriamente baseado na avaliação de febre e mialgia em pacientes de área endêmica. Por esse motivo, o diagnóstico laboratorial da leptospirose é essencial.

6.2. Diagnóstico Laboratorial

A leptospirose é difícil de diagnosticar laboratorialmente, especialmente durante a fase aguda. Pode ser realizada identificando diretamente espiroquetas ou seus componentes em fluidos ou tecidos corporais, isolando leptospiras em cultura ou detectando anticorpos específicos ao longo de diferentes fases clínicas. A leptospirose é difícil de distinguir de doenças como malária, dengue, riquétsias, gripe, hepatite e febre amarela devido à sua aparência clínica vaga. Como resultado, são necessários exames laboratoriais para confirmar o diagnóstico. A detecção de anticorpos contra leptospiras, contra as próprias leptospiras ou contra seu ácido desoxirribonucléico é a base para esses testes (DNA). O diagnóstico laboratorial atual inclui tanto a identificação direta (detecção de espiroquetas ou DNA de Leptospira nas amostras ou isolamento do organismo a partir de amostras) quanto a detecção indireta (diagnóstico sorológico ou sorologia para identificação da infecção por Leptospira, que se baseia na detecção de anticorpos específicos contra vários Antígenos leptospirais) (Tabela 1).

6.2.1. Exame microscópico direto, cultura e detecção de antígeno

As leptospiras são espirais finas, brilhantes e ativamente móveis, com rotação caracteristicamente rápida (motilidade espasmódica) sob o microscópio de campo escuro convencional (DFM) e aproximadamente 10 leptospiras/mL são necessárias para a detecção de uma célula por campo. Com uma semana a mais de duração da infecção, há aproximadamente 10% de óbitos no rendimento de DFM (de 100 a 90%). Para aumentar a sensibilidade, vários métodos especiais de coloração; Coloração de prata estrelada de Warthin [76] e imunocoloração (imuno-histoquímica, imunofluorescência, captura de antígeno imunomagnético e coloração de imunoperoxidase [77]) que requerem anticorpos primários específicos do sorovar (isolados ou combinados).

Tabela 1. Exames laboratoriais para diagnóstico de leptospirose.

LAMP, amplificação isotérmica mediada por loop; PCR, reação em cadeia da polimerase; NGS, sequenciamento de próxima geração; AIH, hemaglutinação indireta; ELISA, ensaio imunoenzimático; IgM, imunoglobulina M; MAT, teste de aglutinação macroscópica; MCAT, teste de aglutinação em microcápsulas; DNA, ácido desoxirribonucléico; DFM, microscopia de campo escuro

Paralelamente, a cultura de Leptospira de sangue, urina, líquido cefalorraquidiano e tecido de biópsia é possível durante os primeiros dias a 10 dias após o início dos sintomas da doença (estágio de leptospirose). Por terem crescimento lento (tempo de duplicação de 6 a 8 horas), serem exigentes e propensas à contaminação, as amostras de cultura devem ser mantidas por pelo menos 3 a 4 meses antes de serem descartadas como negativas) com apenas 23% de sensibilidade, mas é necessário para o teste de sensibilidade a medicamentos [6]. Como tal, o meio EMJH (Ellinghausen – McCullough – Johnson – Harris) (complexo de albumina oleica) consiste em albumina sérica bovina (fração V), Tween 80, cloreto de amônio, tiamina, fosfato monopotássico, fosfato dissódico e vários nutrientes [78] é mais comumente usado, enquanto o meio T80/40/LH mais especializado (polissorbato 40, hidrolisado de lactalbumina, superóxido dismutase e soro de coelho) é necessário para alguns sorovares [79]. Para o isolamento primário da grande e diversificada gama de leptospiras patogênicas exigentes, Hornsby-Alt-Nally (HAN) parece ser um bom meio [80].

A detecção de antígenos leptospirais por imunoperoxidase, imunofluorescência ou um sistema imunomagnético de captura de antígeno foi desenvolvida para amostras com baixa carga bacteriana ou microscopia de campo escuro não pode ser usada, mas não é realizada rotineiramente devido à limitação do anticorpo primário [77]. Em contraste, o reconhecimento de ácidos nucleicos com nova amplificação de DNA; reação em cadeia da polimerase (PCR) (ou seja, nested-PCR, PCR quantitativo [qPCR]), amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) e sequenciamento de próxima geração (NGS) são valiosos para um diagnóstico laboratorial precoce e preciso, especialmente com o Isolamento de Leptospira utilizando inoculação em meio biológico e hibridização de DNA (sonda de DNA) [81,82]. Uma variedade de alvos leptospirais (como RNA ribossômico 16S) ou DNA podem ser amplificados para diagnóstico [83] e a PCR em tempo real (RT-PCR) é mais sensível e específica do que a PCR padrão [84]. Como alguns iniciadores de RT-PCR podem se ligar a um local não específico, levando a resultados falsos positivos, os ensaios mais recentes de PCR multiplex em tempo real foram desenvolvidos usando dois conjuntos de iniciadores [85]. Nested PCR também ajuda na detecção de locais de DNA mais específicos e sensíveis com conjuntos adicionais de primers [86,87]. No entanto, as tendências actuais para o diagnóstico da leptospirose são a utilização de técnicas serológicas e moleculares, tais como PCR e ELISA (mais fáceis do que o padrão-ouro MAT serológico), para países com recursos limitados [88,89]. Além disso, a técnica LAMP [90] para detectar um gene 16S rRNA (rrs) é uma técnica econômica, rápida e de alto rendimento para detectar leptospiras patogênicas na urina. Atualmente, o NGS é o método independente de cultura baseado com mais precisão na análise do genoma central em fluidos corporais (sangue e urina) [91] e a direção futura dos testes de leptospirose seria avançar em direção à classificação molecular das leptospiras, que supera a limitação de isolamento cultural de leptospiras de amostras clínicas. Assim, o valor da PCR no diagnóstico clínico da leptospirose é particularmente bom e estão a surgir várias técnicas modernas

6.2.2. Detecção de Anticorpos Anti-Leptospira

Vários diagnósticos sorológicos são utilizados; por exemplo, testes de anticorpos específicos do gênero (hemaglutinação indireta [IHA], ensaio imunoenzimático [ELISA], Lepto Dri Dot [aglutinação em látex], aglutinação em microcápsula [MCAT]) e testes de anticorpos específicos para sorovares (teste de aglutinação microscópica [ MAT]) [92,93]. Como tal, os critérios MAT para diagnóstico são (i) um aumento de quatro vezes no título em soros pareados (soroconversão da infecção atual) ou (ii) um único título alto (maior ou igual a 1:400 ou 1:800, maior na epidemia áreas) (soropositividade) (os anticorpos podem persistir por algum tempo após a infecção ou reagir de forma cruzada com outras doenças). Além disso, o MAT exige um painel ao vivo de todos os sorovares de Leptospira na região, com um painel de sorovares padronizados localmente [93,94] seguindo a Organização Mundial de Saúde Animal (19 antígenos representativos de 15 sorogrupos) [95]. Como os anticorpos são detectáveis ​​5–7 dias após a infecção, o teste MAT pode ser negativo (título < 1:50) durante os primeiros dias de infecção. O diagnóstico da leptospirose pode ser realizado por amostras de urina [96] usando sorologia e detecção molecular (16S rRNA), particularmente em pacientes com infecção recente (MAT maior ou igual a 1:800 ou ELISA IgM positivo ou ambos) [97] .

Com recursos limitados, uma pontuação de predição clínica [98] baseada na história clínica relevante e testes laboratoriais relacionados com pontuação em sete aspectos é a seguinte: hipotensão (3), icterícia (2), dor muscular (2), LRA (1,5) , hemoglobina baixa (3), hipocalemia com hiponatremia (3) e neutrofilia (1) são propostas (uma pontuação de corte resumida de 4 tem a área sob a curva característica de operação do receptor {{10}}.78 ( IC 95% 00,68–0,89) para diagnóstico de leptospirose [77]). Este escore de probabilidade Thai-Lepto-on-admission pode ser uma ferramenta diagnóstica para o diagnóstico presuntivo precoce de leptospirose em pacientes que apresentam suspeita clínica grave da doença.