Reativando memórias mediadas pelo hipocampo durante a reconsolidação para romper o medo - Parte 2

Em seguida, avaliamos os efeitos a longo prazo da nossa manipulação. Foram replicados os resultados acima com um desenho experimental semelhante.

Indiscutivelmente, existe uma forte ligação entre os efeitos a longo prazo e a memória. Por um lado, os efeitos a longo prazo podem ter efeitos profundos na memória e, por outro lado, a memória pode afectar os nossos efeitos a longo prazo.

Em primeiro lugar, o impacto a longo prazo na memória reflecte-se principalmente em dois aspectos: um é o impacto nas funções fisiológicas das pessoas e o outro é o impacto no estado psicológico das pessoas.

Os efeitos a longo prazo podem afetar a nossa fisiologia, como em áreas como dieta, sono e exercício. Se vivermos por muito tempo em um ambiente pouco saudável, como alimentação desequilibrada, má qualidade do sono, falta prolongada de exercícios, etc., esses efeitos adversos a longo prazo deixarão uma certa memória em nosso corpo, afetando assim nosso cérebro atividade e memória.

Ao mesmo tempo, os efeitos a longo prazo também afectarão o nosso estado mental, tais como tensão excessiva, ansiedade e stress, o que prejudicará a nossa memória.

O impacto da memória a longo prazo também é muito importante. Uma boa memória pode nos dar maior clareza, independência e confiança, dando-nos maior controle sobre nossas próprias vidas e sobre as consequências a longo prazo. Pode ajudar-nos a ajustar melhor o nosso estado, reduzindo assim o stress, a ansiedade e outros factores adversos, melhorando a nossa capacidade de resistir à frustração e aumentando a nossa capacidade de adaptação.

Portanto, devemos prestar atenção ao impacto dos efeitos a longo prazo sobre nós na nossa vida diária, prestar atenção à saúde e ao bom estado mental, e cultivar hábitos de vida saudáveis ​​e boa adaptabilidade, para dar pleno desempenho à nossa memória e lidar melhor com efeitos de longo prazo, alcançar seu próprio crescimento substancial. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e a Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória, pois a Cistanche deserticola também pode regular o equilíbrio dos neurotransmissores, como aumentar os níveis de acetilcolina e fatores de crescimento. Estas substâncias são muito importantes para a memória e a aprendizagem. Além disso, a Cistanche deserticola também pode melhorar o fluxo sanguíneo e promover o fornecimento de oxigênio, o que pode garantir que o cérebro receba nutrientes e energia suficientes, melhorando assim a vitalidade e a resistência do cérebro.

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No entanto, em vez de aplicar aos ratos um teste de reintegração após o choque imediato, deixamos os ratos imperturbados em sua gaiola por 2 semanas após a extinção e depois aplicamos a eles um teste para a recuperação espontânea do medo (Fig. 1n).

Vinte e quatro horas após o condicionamento pelo medo (Fig.1o), durante o recall, tanto os grupos positivos quanto os neutros de ChR2 congelaram menos na última metade da sessão em comparação aos controles eYFP (Fig. 1p). Não vimos diferenças de grupo durante a extinção (Fig. 1q e Fig. Complementar 1c).

Consistente com os efeitos observados durante a recordação, o teste de recuperação espontânea revelou que tanto os camundongos ChR2 positivos quanto os neutros congelaram menos em comparação com os controles eYFP e em comparação com o grupo Chr2 negativo, demonstrando que nossa manipulação produziu efeitos duradouros nos processos de recuperação de memória de medo evidentes duas semanas após a extinção (Fig. 1r, s).

É importante ressaltar que mostramos que as reduções no congelamento observadas após a marcação e no estímulo de uma memória positiva não podem ser atribuídas apenas à injeção viral ou à estimulação luminosa. Especificamente, descobrimos que a reativação de uma memória positiva marcada (exposição feminina) (Fig. Complementar 3a), depois que os ratos foram FC para mostrar aumento do congelamento pós-choque (Fig. Complementar 3b, c), resultou em menos congelamento apenas em camundongos ChR2 que receberam estimulação a laser .

Isso foi em comparação com camundongos ChR2 que não receberam estimulação, camundongos eYFP que receberam estimulação e o grupo sem vírus/sem laser. Isto foi verdade durante a recuperação (Fig. Complementar 3d), no primeiro dia de extinção, e durante os primeiros 3 min de extinção (Fig. Complementar 3e, f). Como esperado, não vimos diferenças de grupo durante o choque imediato (Fig. Complementar 3g), mas vimos uma diminuição significativa no congelamento no grupo ChR2-Laser On em comparação com todos os outros grupos na reintegração (Fig. Complementar 3h, I).

Além disso, este efeito só esteve presente quando os ratos receberam reativação artificial de uma memória marcada no contexto FC (Figura 4a Complementar). Em seguida, marcamos uma memória positiva (exposição feminina) e depois camundongos FC que demonstraram congelamento pós-choque (Figura 4b suplementar).

Quando esta memória foi reativada em um contexto novo e os camundongos retornaram ao contexto de condicionamento 24 horas depois, o congelamento não diminuiu no grupo ChR2 durante a recordação (Figura 4c suplementar).

O congelamento permaneceu semelhante aos controles eYFP durante a extinção e reintegração (Figura 4d, e suplementar). Estas descobertas fornecem evidências de que a nossa manipulação ocorre através da reconsolidação, uma vez que é específica quando os ratos experimentam a recordação natural da memória do medo, que neste caso, é estimulada pela exposição ao contexto de condicionamento.

A valência é importante: a reativação artificial de uma experiência de gaiola neutra durante a reconsolidação não é suficiente para perturbar a memória do medo

Os resultados acima ilustram que a interferência do hipocampo resultante da reativação de engramas positivos ou neutros é mais eficaz na redução do medo condicionado do que os engramas associados a uma experiência negativa.

Para avaliar melhor a importância da valência, primeiro testamos se a nova experiência de gaiola limpa era de fato "neutra", em vez de positiva ou negativa, uma vez que novos estímulos podem envolver um conjunto complexo de abordagens e evitar vias dopaminérgicas relacionadas à saliência, recompensa e neofobia. –52. Portanto, para o componente neutro do próximo experimento, usamos uma experiência em gaiola doméstica, onde os ratos não foram perturbados.

Em segundo lugar, perguntámos se uma experiência positiva separada que não envolvesse a exposição feminina era suficiente para reduzir o medo. Consequentemente, utilizamos a exposição aguda à cocaína53 como nossa próxima experiência positiva. Finalmente, questionamos se a incapacidade de reduzir o congelamento através da estimulação de um engrama negativo durante a recordação da memória do medo era o resultado da sobreposição dessas memórias.

Para testar isso, marcamos células dDG ativas quando os ratos estavam FC no contexto C como nossa próxima experiência negativa, já que esse engrama interferente seria teoricamente composto de algumas das mesmas células que a memória do medo adquirida no contexto A devido à generalização. novamente abriu uma janela de marcação do DOX e rotulou uma memória positiva, neutra ou negativa no dDG (Fig. 2a).

Os ratos atribuídos a grupos negativos foram inicialmente FC no contexto C, demonstrando congelamento pós-choque significativo (Fig. 2b). No dia seguinte eles eram FC como antes no contexto A. Os ratos FC no dia anterior apresentaram congelamento mais alto do que os outros grupos pré e pós-choque (Fig. 2c). Durante a recordação, os camundongos ChR2 negativos continuaram a exibir mais congelamento em comparação com outros grupos ChR2 (Fig. 2d), o que foi observado durante toda a sessão.

No entanto, não houve reduções em tempo real no congelamento em nenhum dos grupos ChR2-, em comparação com as contrapartes eYFP em qualquer parte da sessão de recall (Fig. 2d). Não foram observadas diferenças de grupo durante a extinção (Fig. 2e e Fig. Complementar 1d) nem choque imediato (Fig. 2f).

A estimulação óptica da memória homecage não foi suficiente para competir com a memória do medo, uma vez que durante a reintegração, observamos que apenas camundongos ChR2 positivos apresentaram menos congelamento em comparação com os controles eYFP e os grupos negativos (Fig. 2g). Camundongos ChR2 negativos demonstraram congelamento igual aos controles (Fig. 2g, h).

Esses resultados corroboram nossas descobertas anteriores, mostrando que a estimulação óptica de uma memória positiva concorrente, mas não de uma memória neutra ou negativa, é suficiente para interromper a reconsolidação do medo.

A redução no congelamento observada não se deve ao aumento da locomoção

Em uma coorte separada de camundongos, as células dDG envolvidas na codificação de uma exposição aguda à cocaína foram marcadas com DOX (Fig. 2i). No dia seguinte, para avaliar se a ativação de um engrama de cocaína induziria atividade hiperlocomotora, testamos camundongos em campo aberto, onde reativamos o engrama de cocaína nos últimos 5 minutos do teste de 10 minutos.

Não encontramos diferenças de grupo no número total de cruzamentos de linha (Fig. 2j), distância percorrida (Fig. 2k) ou velocidade (Fig. 2l), sugerindo que as diminuições no congelamento observadas no experimento anterior não foram devidas ao aumento da locomoção.

Além disso, o tempo gasto na região central não revelou diferenças entre grupos (Fig. 2m), sugerindo que a ativação artificial da memória relacionada à cocaína não é ansiogênica nem ansiolítica.

Os ratos realizarão uma resposta operante para a reativação artificial de uma memória positiva

Embora o hipocampo esteja implicado no processamento de experiências positivas, pensa-se que o faz em conjunto com várias regiões envolvidas na neuromodulação, incluindo a área tegmental ventral (VTA).

A VTA é um componente crítico do sistema de recompensa do cérebro, e estados afetivos negativos (por exemplo, ansiedade) são mediados pela desregulação da VTA. Está bem estabelecido que a autoestimulação intracraniana (ICSS) da VTA é um comportamento operante poderosamente recompensador, onde os roedores mantêm a entrega de impulsos elétricos, resultando na liberação de dopamina .

Este procedimento foi previamente adaptado para incorporar estimulação optogenética in vivo de neurônios dopaminérgicos na ATV. Para marcar e reativar células dDG ativas durante esta experiência positiva, expressamos seletivamente ChR2 em células VTA dopaminérgicas usando camundongos transgênicos que expressam Cre sob controle do transportador de dopamina (DAT).

Injetamos nossos vetores virais AAV5-Ef1a-DIO-(hChR2-E123A)-eYFP e implantamos uma fibra óptica unilateralmente no VTA. Também injetamos c-Fos-tTA-TRE- (ChR2) -eYFP e implantamos fibras ópticas bilateralmente direcionadas ao dDG (Fig. 3a). Os ratos foram inicialmente habituados à câmara operante e tiveram acesso a uma roda sem consequências, que serviu como medida de base.

No dia seguinte, os camundongos foram colocados de volta na caixa operante e duas portas nasais foram introduzidas, uma ativa e outra inativa. O nariz cutuca a porta ativa produz estimulação VTA optogenética, enquanto o nariz cutuca a porta inativa não produz estimulação e serve como controle discriminativo. Os ratos receberam três sessões de treinamento ICSS e depois foram retirados do DOX.

Eles foram trazidos de volta para uma quarta sessão de treinamento, na qual células dDG que responderam à autoestimulação VTA foram marcadas. No dia seguinte, o acesso às portas do nariz foi restrito e os giros das rodas produziram estimulação óptica dDG para reativar o engrama de autoestimulação VTA. Isso foi feito para avaliar se os ratos realizariam uma resposta operante para um positivo (VTA-ChR2, dDG-ChR2) ou experiência neutra (VTA-eYFP, dDG-ChR2) em comparação com controles dDG-eYFP (Fig. 3a).

Em camundongos injetados com ChR2 na VTA, as cutucadas com o nariz na porta ativa foram significativamente maiores do que na porta inativa, e aumentaram durante as sessões, demonstrando a capacidade dos camundongos de discriminar entre as portas e auto-administrar estimulação óptica para recompensa (Fig. 3b – e). Comparando as medidas basais da roda com o treinamento e o teste, os ratos injetados com ChR2 no VTA e dDG completaram mais rotações da roda, que foram mantidas em movimento por durações e distâncias mais longas (Fig. 3f-h) e produziram mais estímulos (Fig. 3i) em comparação com todos os outros grupos.

Esta descoberta demonstra que os camundongos realizarão uma resposta operante para manter a reativação artificial de uma memória positiva, especificamente a memória da autoestimulação VTA. Os ratos não exibiram esse comportamento para uma memória de exposição à caixa operante na ausência de estimulação VTA. Após este teste, os ratos foram submetidos ao mesmo protocolo experimental de antes, onde estavam FC no contexto A, onde demonstraram congelamento pós-choque (Fig. 3j e Fig. Complementar 1e) e depois fizeram um teste de recuperação de memória de medo.

A reativação do engrama de autoestimulação VTA (VCDC) durante a recordação reduziu o congelamento durante toda a sessão (Fig. 3k). Os níveis permaneceram baixos durante a extinção (Fig. 3l e Fig. Complementar 1e), choque imediato (Fig. 3m) e reintegração (Fig. 3n).

Curiosamente, entre os dois grupos dDG-eYFP, o grupo que recebeu estimulação VTA anteriormente (VCDE) demonstrou um efeito benéfico desta experiência exibindo níveis intermediários de congelamento em comparação com o grupo VCDC e os outros grupos de controle em EXT1 (Fig. 3l), e de choque imediato para reintegração (Fig. 3o). Juntos, esses resultados mostram que a interferência de uma experiência gratificante pode neutralizar estados afetivos negativos.

A ativação de neurônios dDG rotulados aleatoriamente também é suficiente para promover a reconsolidação do medo

A seguir, perguntamos se a reativação artificial de uma memória positiva, que envolve a estimulação de um pequeno conjunto de neurônios (<10%)38, can update a fear memory during reconsolidation, could we circumvent the positive-valence prerequisite to achieve a similar effect if we activate a larger population of neurons not necessarily tied to memory? 

Ao contrário dos experimentos anteriores, onde usamos uma estratégia de marcação induzível por cFos para rotular células envolvidas em diferentes experiências, aqui usamos um vírus com um promotor constitutivo (CaMKIIa) para marcar aleatoriamente neurônios dDG com ChR2 (Fig. 4a).

Os ratos foram injetados com vírus não diluído ou diluído para marcar uma grande porcentagem ou fração de células dDG, respectivamente. Os ratos demonstraram congelamento pós-choque após serem FC (Fig. 4b e Fig. Complementar 1f).

Durante a recordação no dia seguinte, os neurônios marcados foram estimulados opticamente. Durante a primeira metade da sessão, vimos reduções em tempo real no congelamento nos grupos ChR2 não diluído e diluído, mas na segunda metade, apenas o grupo não diluído apresentou menos congelamento (Fig. 4c).

O grupo ChR2 não diluído continuou a exibir menos congelamento durante a extinção (EXT1 e EXT2) (Fig. 4d) e ambos os grupos ChR2 não diluídos e diluídos congelaram menos que os grupos eYFP durante os primeiros 3 min de EXT1 (Fig. Complementar 1f).

Como esperado, não houve diferenças de grupo durante o choque imediato (fig. 4e). Na reintegração, observamos congelamento reduzido nos grupos ChR2 não diluído e diluído em comparação com os controles eYFP (Fig. 4f) e em comparação com o choque imediato (Fig. 4g).

Nossos efeitos foram maiores no grupo não diluído, sugerindo que processos baseados em reconsolidação podem ser potencialmente envolvidos pela ativação de conjuntos que não estão conectados a um engrama de uma valência específica se células suficientes forem ativadas. Esta estratégia de modulação da memória pode ser semelhante aos protocolos de estimulação atualmente aprovados para uso em humanos62,63.

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