Avaliação Quantitativa de Infiltrados Inflamatórios em Biópsias de Transplantes Renais Usando Amplificação de Sinal de Tiramida Multiplex e Aprendizado Profundo

Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Meyke Hermsen¹Valery Volk²Jan Hinrich Brasen²e outros

Abstrato

A função tardia do enxerto (DGF) é um forte fator de risco para o desenvolvimento de fibrose intersticial e atrofia tubular (IFTA) em transplantes renais. A avaliação quantitativa de infiltrados inflamatórios em biópsias renais de pacientes com DGF pode revelar marcadores preditivos para o desenvolvimento de IFTA. Neste estudo, combinamos amplificação de sinal de tiramida multiplex (mTSA) e redes neurais convolucionais (CNNs) para avaliar o microambiente inflamatório em biópsias renais de pacientes com DGF (n=22) realizadas 6 semanas após o transplante. Os pacientes foram estratificados para o desenvolvimento de IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

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Introdução

A função tardia do enxerto (DGF) após o transplante renal é multifatorial e está relacionada principalmente às características do doador e ao tempo de isquemia. A DGF é geralmente descrita como a necessidade de diálise dentro de 7 dias após o transplante e é um forte fator de risco para lesão crônica do enxerto renal [1-3]. Um componente clássico da lesão renal crônica é a presença de fibrose intersticial e atrofia tubular (IFTA). No entanto, nem todos os pacientes com DGF evoluem para o desenvolvimento de IFTA, e a complexa relação entre DGF e IFTA ainda é pouco compreendida. Isso se deve primeiro ao intervalo de tempo entre eventos potencialmente causadores e declínio funcional, e segundo por causa dos efeitos variáveis ​​e complexos de potenciais indutores, como rejeição e efeitos colaterais da medicação [1, 4]. A presença geral de inflamação e macrófagos específicos tem sido descrita em vários estudos como um preditor de perda do enxerto [5-8]. No entanto, os processos patológicos subjacentes não são totalmente compreendidos e altos níveis de inflamação não levam invariavelmente à perda do enxerto a longo prazo. Como resultado de estímulos ambientais, os macrófagos adquirem funções especializadas e se polarizam em diferentes fenótipos. Numerosos estudos sugerem que subtipos específicos de macrófagos (macrófagos ativados alternativamente) estão envolvidos na remodelação tecidual por indução de reparo tecidual ou fibrose. Sabe-se que a polarização em direção a um fenótipo de remodelação tecidual (às vezes pró-fibrótica) depende de uma ampla gama de estímulos ambientais, entre outros fornecidos por subtipos de linfócitos T auxiliares [9-11]. A avaliação das populações de células T-helper no enxerto no momento da DGF revelou um subtipo T-helper 1 prevalente, mas as correlações com o resultado do enxerto ou progressão para IFTA não foram investigadas até agora [12]. Uma avaliação abrangente do microambiente inflamatório especificamente focado em macrófagos e subconjuntos de células T auxiliares em coortes de pacientes cuidadosamente selecionadas pode fornecer informações sobre por que alguns, mas nem todos os pacientes com DGF progridem para o desenvolvimento de IFTA.

No entanto, uma investigação abrangente de infiltrados inflamatórios é dificultada por várias limitações (técnicas). As técnicas tradicionais de imuno-histoquímica (IHC) e imunofluorescência suportam a visualização de apenas um número limitado de marcadores celulares em uma seção de tecido. O corte em série de fragmentos de tecido pequenos e valiosos, como biópsias de rim, não é desejado e a interpretação das relações entre células em diferentes seções é difícil. Além disso, a avaliação quantitativa dos infiltrados inflamatórios por estimativa visual vem com um nível significativo de variabilidade interobservador [13]. As técnicas tradicionais de processamento de imagem, como limiar de pixel, divisor de águas e segmentação baseada em morfologia, dependem do conhecimento prévio de todas as representações morfológicas das células e da intensidade da coloração do tecido ao longo de um conjunto de dados [14-16]. Portanto, esses métodos geralmente carecem de robustez para variações de imagens biológicas e técnicas e traduzem mal para conjuntos de dados novos ou externos. O surgimento da patologia digital acelerou o desenvolvimento de métodos alternativos para a avaliação de imagens de lâmina inteira (WSI) [17, 18]. Modelos de aprendizado profundo, especificamente, redes neurais convolucionais (CNNs) provaram ser capazes de segmentar e detectar estruturas biológicas relevantes em lâminas histopatológicas [19-23]. Essas técnicas têm o potencial de passar da estimativa visual subjetiva e do processamento de imagem tradicional para a detecção de células precisa, objetiva e reprodutível.

O objetivo deste estudo é desenvolver um método para avaliação objetiva e quantitativa de múltiplos marcadores de células inflamatórias, contornando a necessidade de cortes seriados em lâminas extensas. Para isso, combinamos IHC multiplex, imagens multiespectrais e modelos de aprendizado profundo. Para demonstrar a aplicabilidade dessas técnicas, estudamos as correlações do microambiente inflamatório, quantificado por modelos de aprendizado profundo, com o desenvolvimento da IFTA em biópsias de enxerto de vigilância de pacientes com DGF.

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Materiais e métodos

Para avaliar o microambiente inflamatório em biópsias renais de pacientes com DGF, realizamos IHQ multiplex em biópsias de vigilância realizadas 6 semanas após o transplante. Os pacientes foram estratificados para o desenvolvimento de IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

Amostras de tecido

Usamos biópsias de vigilância de receptores de transplante renal na Hannover Medical School (Hannover, Alemanha), adquiridas no contexto de um programa prospectivo de biópsia de vigilância. Os critérios de inclusão foram: ocorrência de DGF (definida como<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

Avaliação IFTA

A extensão da fibrose intersticial (ci) e atrofia tubular (ct) (IFTA) em 6 semanas e 6 meses, expressa usando o sistema de classificação de lesão de Banff [24] foi adquirida a partir do relatório de patologia. Para avaliar a relação entre os infiltrados inflamatórios precoces e o desenvolvimento da IFTA com mais detalhes, todas as lâminas coradas com PAS foram digitalizadas para reexame usando um scanner digital de lâminas Pannoramic 250 Flash II (3DHistech, Hungria) com 20 × objetiva com resolução de 0,24 μm/ pixel. O PAS WSI de ambos os pontos de tempo (6 semanas e 6 meses) foram pontuados para a extensão da IFTA (porcentagem da área de superfície, com intervalos de 10%) por três patologistas renais. Os escores médios da IFTA dos patologistas foram usados ​​como pontuação final para calcular a mudança na IFTA entre 6 semanas e 6 meses após o transplante. Os pacientes foram estratificados por aumento absoluto na pontuação IFTA de 10 por cento ou mais (n=13) e nenhum ou<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

Além disso, os escores da lesão de Banff foram comparados entre os pontos de tempo usando o teste de postos sinalizados de Wilcoxon. Isso revelou diferenças significativas entre biópsias de 6 semanas e 6 meses para as categorias de Banff ti (p=0.017), ci (p=0.004) e ct (p=0.011) .

Coloração Multiplex TSA

Realizamos multiplex IHC usando mTSA para visualizar vários marcadores celulares nas biópsias de 6 semanas. Após a incubação com um anticorpo primário e secundário, o tecido foi tratado com tiramida marcada com fluorescência. A peroxidase de rábano do anticorpo secundário catalisa a formação de radicais tiramida ativos. Os radicais tiramida ligam-se covalentemente aos resíduos de tirosina no antígeno. Esta ligação permanente permitiu a remoção induzida pelo calor do complexo anticorpo primário-secundário, preservando o depósito de tiraamida fluorescente [25]. Isso permitiu a incubação sucessiva subsequente com mais anticorpos da mesma espécie contra os antígenos alvo.

O mTSA foi realizado em duas lâminas consecutivas das biópsias de vigilância de 6 semanas. Desenvolvemos dois painéis de mTSA para avaliar o infiltrado inflamatório e a extensão capilar peritubular em nossos grupos de pacientes. O painel I existia de anticorpos anti-CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 e CD34. O painel II foi usado para investigar a polarização de células T auxiliares e macrófagos usando anticorpos anti-CD4, Tbet, GATA3, CD68 e CD163. As especificações de anticorpos, diluições e ordens de coloração estão listadas na Tabela Suplementar 1. Todas as lâminas foram desparafinizadas em xileno, desidratadas em etanol a 95%, lavadas em água da torneira e fervidas para recuperação do epítopo em trisborato-EDTA diluído 10x (TBE 10x , 0658, VWR Life Sciences, EUA). Após o resfriamento, as lâminas foram lavadas em solução de peroxidase de hidrogênio a 3 por cento para bloqueio de peroxidase endógena e lavadas com tampão salino tris tamponado com Tween 20 a 0,05 por cento (822184, Merck KGaA, Alemanha) (TBS-T). O bloqueio de proteínas foi realizado usando TBS-T com 1 por cento de albumina de soro bovino (BSA) (mTSA etapa 1). Os anticorpos primários foram incubados durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius (mTSA etapa 2). Após a lavagem em TBS-T, as lâminas foram incubadas com um anticorpo secundário conjugado com HRP (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, Holanda) por 30 min à temperatura ambiente (mTSA etapa 3). Em seguida, a TSA foi realizada usando os fluoróforos Opal TSA de um kit Opal 7-color Manual IHC (NEL811001KT, Akoya Biosciences, EUA) (mTSA etapa 4) (os fluoróforos e seus anticorpos correspondentes estão listados na Tabela Suplementar 1). O complexo anticorpo-TSA foi removido com um ciclo de ebulição em tampão TBE (mTSA etapa 5). As etapas 1 a 5 do mTSA foram repetidas até que as lâminas fossem coradas com todos os anticorpos do painel em questão. As lâminas foram cobertas com fluoromount-G com DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, EUA).

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Validação Multiplex TSA

Ciclos de ebulição repetidos podem afetar a afinidade do epítopo alvo. Alguns anticorpos mostram um padrão de coloração mais fraco depois que o tecido é fervido várias vezes, outros anticorpos precisam de mais ciclos de ebulição para atingir a intensidade de coloração ideal e outros não são afetados. Avaliamos esse efeito para todos os anticorpos usando IHC cromogênico no tecido da amígdala de controle FFPE. Para cada anticorpo testado (n=9), seis seções foram cortadas (4 μm de espessura). Todas as lâminas foram desparafinizadas em xileno, desidratadas em etanol 95%, lavadas em água corrente e fervidas para recuperação do epítopo em TBE diluído 10x (ciclo de ebulição um). Após o resfriamento, uma lâmina por anticorpo testado foi armazenada em solução salina tamponada com fosfato (PBS). As lâminas restantes foram novamente fervidas. Este ciclo foi repetido cinco vezes. Todas as lâminas foram subsequentemente lavadas em solução de peroxidase de hidrogênio a 3% e seguidas de lavagem em PBS. Os anticorpos primários (tabela complementar 1) foram incubados por 1 h à temperatura ambiente. Após a incubação, as lâminas foram lavadas em PBS. As lâminas coradas com anticorpos anti-CD68, Tibet e GATA3 necessitaram de uma incubação adicional com bloqueio pós-anticorpo (PAB) por 15 min (bloqueio VWRKDPVB, Immunologic, Holanda). Após a incubação, as lâminas foram lavadas em PBS e incubadas com um anticorpo secundário conjugado com HRP (seguindo PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, Holanda, para outros, consulte a Tabela Suplementar de anticorpos secundários 1). A visualização foi realizada usando 3,3'-diaminobenzidina (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, Holanda). Os resultados são visualizados na Fig. 1 Complementar. Com base nesses resultados, determinamos a ordem de anticorpos ideal para os experimentos de mTSA, conforme listado na Tabela Complementar 1.

Se os epítopos de interesse forem co-localizados, os depósitos de tiramida podem interferir uns com os outros. Para testar essa inibição estérica, usamos lâminas de tecido de controle de amígdalas e as coramos com nossos painéis de mTSA. A expressão de anticorpos no mTSA foi comparada com a das lâminas coradas individualmente, que passaram pelo mesmo número de ciclos de ebulição. Não observamos diferenças nos padrões de coloração entre as lâminas coradas simples e multiplex (exemplos incluídos no painel I, Figs. 2 e 3 complementares). Todos os anticorpos primários no mTSA foram usados ​​na mesma diluição que foi usada para IHQ cromogênica. A intensidade do sinal fluorescente foi otimizada ajustando as diluições da solução TSA.

Imagens multiplex TSA

A imagem multiespectral foi realizada usando um Vectra Polaris Imaging System (CLS143455, Akoya Biosciences, EUA) com uma objetiva de 20x, com resolução de 0,49 μm por pixel e usando DAPI, FITC, CY3, Texas Red e Cubos espectrais Cy5. O sistema Vectra permite a seleção manual de regiões para aquisição multiespectral, que são posteriormente divididas pelo sistema em tiles (Fig. 1.1). Os espectros de autofluorescência e todos os fluoróforos Opal TSA foram pré-gravados em uma "biblioteca" espectral usando o Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6. (Akoya Biosciences, EUA). A biblioteca espectral permitiu decompor o bloco multiplex em vários blocos únicos representando a contribuição de cada fluoróforo ("desmisturar"). Isso resultou em telhas monocromáticas e multicanal, cada canal correspondendo a um único fluoróforo e, portanto, anticorpo (Fig. 1.2).

Conversão para IHC de campo claro artificial

Com base nas coordenadas armazenadas, os blocos foram costurados para criar um WSI multicanal usando um script python personalizado (Fig. 1.3). Os canais que representam o sinal DAPI (IDAPI) e os canais que representam um dos anticorpos (IIHC) foram convertidos para coloração artificial de hematoxilina e DAB, respectivamente (Figs. 1.4 e 1.5). Com base na hematoxilina cromática conhecida e coordenadas DAB Cx, Cy após a transformação matiz-saturação-densidade (HSD), os vetores de coloração foram adquiridos em estudos anteriores [26, 27]. Esses vetores de coloração foram usados ​​para calcular os valores vermelho-verde-azul para o IHC de campo claro artificial (Fig. 1.5), como:

com CR, st a absorção de luz do corante st na parte vermelha do espectro. Os valores para B e G foram calculados de forma semelhante.

Análise de imagem

Regiões de interesse (ROIs)

As regiões de interesse (ROIs) foram anotadas para cada caso na coorte usando o software automatizado da plataforma de análise de slides (ASAP; versão 1.9, disponível como software de código aberto no GitHub). Essas ROIs são compostas por tubulointerstício cortical, excluindo assim a cápsula, glomérulos e artérias. Como a inflamação em regiões subcapsulares renais é considerada inespecífica em patologia de transplante, as biópsias deste estudo foram analisadas principalmente excluindo a região subcapsular (definida como 400 µm abaixo da cápsula). Secundariamente, repetimos as análises incluindo a região subcapsular. Exemplos visuais das ROIs estão incluídos na Fig. 4 Complementar.

Detecção de linfócitos CNN I

As imagens artificiais de IHC de campo claro representando CD3, CD4, CD8 e CD20 foram analisadas usando uma CNN existente com uma arquitetura U-Net [22, 28]. Essa rede foi projetada especificamente para a detecção de marcadores de linfócitos citoplasmáticos em IHQ. O desempenho da CNN pode ser expresso em precisão, recall e pontuação F1-, onde:

A CNN alcançou uma precisão de {{0}},76, um recall de 0,79 e um F1-score de 0,78 no conjunto de teste que foi usado no artigo original, composto pelo tradicional IHC WSI. A detecção de células positivas individuais requer o limiar da saída CNN, seguido de pós-processamento. Como a coloração de CD3 no painel mTSA era mais forte em comparação com CD4, CD8 e CD20, um limite de detecção de objeto mais baixo foi usado para os três últimos (0,4) e o limite de detecção de objeto original para CD3 (0,7). Para avaliar o desempenho da CNN nos IHC WSI de campo claro artificial neste estudo, quatro WSI IHC de campo claro artificial (CD8 e CD20 de dois pacientes) foram usados ​​como um conjunto de teste neste estudo. As anotações de ponto (n=1115) foram geradas usando o software ASAP. Após a aplicação da rede, precisão, recall e F{19}} score foram calculados para avaliar o desempenho da CNN. As detecções foram consideradas verdadeiras positivas se fossem encontradas dentro de 4 µm (diâmetro médio dos linfócitos) a partir de uma anotação de verdade. Quando duas detecções foram encontradas dentro de uma faixa de 4 µm, apenas a detecção que estava mais próxima da anotação foi considerada como verdadeiro positivo. Subsequentemente, a CNN I de detecção de linfócitos foi usada para a análise de todos os IHC WSI artificiais de campo claro representando marcadores de linfócitos citoplasmáticos (CD3, CD4, CD8 e CD20).

Detecção de linfócitos CNN II

A análise de IHC de campo claro artificial WSI com padrões de coloração nuclear (como apresentado por T-bet e GATA3) canais representando DAPI e CD4 foram selecionados para serem combinados em um WSI (4). Os vetores de coloração adquiridos em estudos anteriores foram usados ​​para colorir artificialmente o sinal DAPI azul (hematoxilina) e o sinal CD4 marrom (DAB), resultando em um IHC WSI de campo claro artificial (5).

necessário treinamento, validação e teste de uma nova CNN. Para este propósito, nove lâminas foram cortadas de rim, amígdala e tecido de controle FFPE do apêndice. Essas lâminas foram coradas por IHC com anti-Tibet (clone 4B1{{10}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, US) e anti-GATA3 (clone L50-823, CM -405B, Biocare Medical, Holanda). Os slides foram digitalizados usando um scanner digital de slides Pannoramic 250 Flash II com resolução de 0,12 μm/pixel. Dois observadores produziram anotações de 5726 pontos em diferentes regiões usando o software ASAP. Anotações de cinco slides foram usadas para treinar uma arquitetura U-Net CNN usando patches de 256 × 256 pixels com tamanho de pixel de 0,49 μm/pixel. Dois WSI foram usados ​​para validação da CNN e para determinação do limiar de detecção de objetos (0,4). O desempenho da CNN no IHC WSI tradicional foi avaliado em um conjunto de teste retido de dois IHC WSI. O desempenho da CNN em IHC WSI de campo claro artificial foi avaliado em um conjunto de teste secundário composto por quatro IHC WSI de campo claro artificial (Tibet e GATA3 de dois pacientes) com anotações de 1082 pontos. Precisão, recordação e pontuação F1-foram calculados para avaliar o desempenho em ambos os conjuntos de teste. As detecções foram consideradas verdadeiras positivas se fossem encontradas dentro de 4 µm de uma anotação de verdade do terreno. Quando duas detecções foram encontradas dentro de uma faixa de 4 µm, apenas a detecção que estava mais próxima da anotação foi considerada como verdadeiro positivo. Subsequentemente, a detecção de linfócitos CNN II foi utilizada para a análise de todos os IHC IHC artificiais de campo claro representando marcadores nucleares (linfócitos) (Tibet e GATA3).

CNN de detecção de macrófagos

Em contraste com a detecção de linfócitos, a identificação de macrófagos individuais não é inequívoca. Especialmente em cenas agrupadas, pode-se esperar um nível significativo de variabilidade do observador. Portanto, um número muito maior de casos e anotações humanas foram usados ​​para treinar uma terceira CNN dedicada para a detecção de macrófagos CD68 plus e CD163 plus. Lâminas coradas por IHC (n=111) de tecido renal nativo e transplantado foram coletadas. As colorações de IHC foram realizadas usando anti-CD68 (clone PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Dinamarca ou clone KP1, M0876, Dako, Dinamarca) ou anti-CD163 (clone MRQ -26, ou 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, Reino Unido). As lâminas IHC foram digitalizadas usando um scanner de slides panorâmico 250 Flash II ou um Aperio AT2 Slide Scanner (Leica Biosystems, Wetzlar, Alemanha) com resolução de 0.24 ou 0 .25 μm/pixel, respectivamente. Quatro observadores produziram 37.709 anotações de pontos em vários ROIs nos WSIs, usando um protocolo para anotação de macrófagos, que foi acordado após experimentos piloto iniciais. As anotações de 101 slides foram usadas para treinar uma arquitetura YoloV2 CNN [29]. Yolo é especificamente adequado para tarefas destinadas a tarefas de detecção. A rede, composta por sete camadas convolucionais, foi treinada em patches de 256×256 pixels extraídos a uma resolução de 0,98 μm/pixel com caixas delimitadoras de 21 μm (com base no tamanho médio dos macrófagos). Dez WSI foram utilizados para validação da CNN e para determinação do limiar de detecção de objetos (0,45) e parâmetros de supressão não máxima (0,05). O desempenho da CNN no IHC WSI tradicional foi avaliado em um conjunto de teste retido de dez IHC WSI. O desempenho da CNN em IHC WSI de campo claro artificial foi avaliado em um conjunto de teste secundário composto por quatro IHC WSI de campo claro artificial (CD68 e CD163 de dois pacientes) com anotações de 1033 pontos. Os escores de precisão, recordação e F1 foram calculados para avaliar o desempenho em ambos os conjuntos de teste. As detecções foram consideradas verdadeiras positivas se fossem encontradas dentro de 21 µm (diâmetro médio dos macrófagos) de uma anotação de verdade do solo. Quando mais detecções foram encontradas dentro de uma faixa de 21µm, apenas a detecção que estava mais próxima da anotação foi considerada como verdadeiro positivo. Subsequentemente, a CNN de detecção de macrófagos foi usada para a análise de todos os IHC WSI artificiais de campo claro representando marcadores de macrófagos (CD68 e CD163).

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Dupla positividade

A positividade das células para dois marcadores (positividade dupla) foi avaliada pela determinação do número de pixels entre as detecções de células nos diferentes canais. Se a distância entre duas detecções de linfócitos foi<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

Os números de células foram calculados dentro das ROIs e as densidades das células foram baseadas na contagem de células e na área da ROI anotada.

Relações espaciais

A detecção automatizada de células no WSI permite a investigação das relações espaciais entre as células. A distância média mais curta foi determinada (em regiões excluindo a região subcapsular) para células CD68 plus e células CD3 plus , CD3 plus CD8 plus e CD20 plus no WSI do painel I para ambos os grupos de pacientes e entre células CD163 plus e CD4 plus , CD4 plus Tbet plus e CD4 plus GATA3 plus no WSI para ambos os grupos de pacientes.

Extensão capilar peritubular

Para avaliar a extensão capilar peritubular, WSIs não misturados representando o canal CD34 foram analisados ​​em Fiji (ImageJ versão 2.0.0, US, macros e plugins: "Open and Duplicate", "ASAP Leitor de ROI") [30]. Os pixels positivos foram determinados por meio de limiar automático e posteriormente expressos como a porcentagem do número total de pixels dentro da ROI.

Análise estatística

As densidades das seguintes populações de células foram calculadas nas biópsias de 6 semanas: linfócitos T (CD3 plus ), linfócitos T citotóxicos (CD3 mais CD8 plus ), linfócitos B (CD20 plus ), macrófagos (CD68 plus , painéis I e II), macrófagos polarizados (CD68 mais CD163 mais , CD163 mais ), linfócitos T-auxiliares 1 (CD4 mais Tbet mais ), e linfócitos T-auxiliares 2 (CD4 mais GATA3 mais ). Os coeficientes de correlação de Spearman foram calculados para avaliar se uma correlação estava presente entre a densidade de linfócitos T-helper 1 e T-helper 2 (CD4 mais Tbet mais, CD4 mais GATA3 mais) e densidade de macrófagos polarizados (CD68 mais CD163 mais ou CD163 mais). Observamos o sinal CD68 (fluoróforo 540 nm) nas IHCs artificiais de CD4 (fluoróforo 520 nm) de um painel I. Portanto, relatamos adicionalmente as densidades celulares para células CD3 mais CD8−. Para avaliar as diferenças entre os grupos de pacientes com diferentes resultados da IFTA, relatamos os valores de densidade celular mediana, mínima e máxima por grupo. Diferenças significativas na densidade celular e extensão capilar peritubular (definida como a porcentagem de pixels positivos para CD34-) entre os grupos foram avaliadas usando o teste U de Mann-Whitney para amostras independentes. Se os pacientes com resultados de IFTA diferentes mostram proporções de células CD3 mais CD8−/CD3 mais CD8 mais significativamente diferentes, foi avaliado usando um teste t para amostras independentes. As diferenças entre os grupos de pacientes nas relações espaciais de células CD68 plus e CD163 plus com outras células imunes foram avaliadas quanto à significância usando o teste U de Mann-Whitney para amostras independentes.

Resultados

Detecção baseada em CNN de células positivas para IHC

Para aplicar as CNNs existentes, originalmente desenvolvidas para microscopia de campo claro, as imagens de fluorescência mTSA foram transformadas em imagens artificiais de campo claro. Exemplos de regiões coradas com mTSA com suas imagens IHC de campo claro artificiais correspondentes estão incluídos na Fig. 2. Um exemplo de um WSI IHC de campo claro artificial é demonstrado na Fig. 4 suplementar. Os WSIs de multi-resolução podem ser abertos e visualizados na visualização de slides digitais softwares como ASAP e Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. Conforme visualizado na Fig. 2, o IHC WSI artificial de campo claro foi adequado para análise automatizada por CNNs que foram originalmente desenvolvidas para o IHC WSI tradicional.

Três CNNs foram usadas para a avaliação quantitativa de células inflamatórias nas biópsias de transplante coradas com mTSA de 6 semanas: para detecção de linfócitos com coloração IHC citoplasmática (CNN I) e nuclear (CNN II) e para detecção de macrófagos. A Tabela 2 mostra o desempenho da CNN (precisão, rechamada e pontuações F1-) para conjuntos de espera de WSIs IHC manchados com DAB e WSIs IHC de campo claro artificial. O desempenho da CNN foi normalmente tão bom ou melhor do que a CNN de linha de base descrita anteriormente (com um F1-score de 0.78), que demonstrou possuir desempenho comparável a observadores manuais experientes [22] . Enquanto a CNN II de detecção de linfócitos mostrou um desempenho um pouco reduzido em imagens virtuais de campo claro em comparação com as imagens DAB reais (nas quais a CNN foi treinada), o oposto foi observado para a CNN para detecção de macrófagos.

Um exemplo de uma avaliação automática de dupla positividade bem-sucedida está incluído na Fig. 3.

Correlação de diferentes tipos de células

A correlação mais forte foi observada entre CD4 mais GATA3 mais densidade celular e CD163 mais densidade celular (coeficiente de Spearman 0.75, p < 0.001)="" no="" 6="" semanas="" de="" biópsia="" (fig.="" 5a="" suplementar).="" esta="" correlação="" foi="" mais="" fraca="" entre="" cd4="" mais="" tbet="" mais="" densidade="" celular="" e="" cd163="" mais="" densidade="" celular="" (coeficiente="" de="" spearman="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (fig.="" 5b="" complementar)="" .="" ao="" limitar="" a="" população="" celular="" a="" macrófagos="" duplamente="" positivos="" (cd68="" mais="" cd163="" mais="" ),="" o="" coeficiente="" de="" correlação="" de="" spearman="" foi="" 0,65="" (p="">< 0,01)="" com="" células="" cd4="" mais="" gata3="" plus="" e="" 0,66="" (p="">< 0,01)="" com="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" células="" (fig.="" suplementar="" 5c,="" d).="" a="" inclusão="" da="" região="" subcapsular="" nas="" análises="" não="" alterou="" os="">

Comparação de infiltrados inflamatórios entrepacientes que progridem para IFTA versus não IFTA

Pacientes que progrediram para IFTA em 6 meses apresentaram densidades celulares significativamente mais altas de CD163 mais nas biópsias realizadas 6 semanas após o transplante (mediana de 505 células/mm2) versus pacientes que não progrediram para IFTA (mediana de 370 células/mm2; p=0 0,043) (Tabela 3). A inclusão da região subcapsular resultou em uma ligeira redução desse efeito (p=0.051). CD68 e CD4 foram usados ​​em ambos os painéis. As lâminas coradas com mTSA painel I mostraram mais positividade para CD68 do que as lâminas coradas com mTSA painel II. A densidade de células CD4 é maior no painel II de mTSA em comparação com o painel I de mTSA (Tabela 3).

A extensão capilar peritubular foi semelhante em biópsias de 6 semanas de pacientes com DGF com diferentes resultados de IFTA (Tabela 3), tanto ao excluir (p=0.74) quanto ao incluir (p=0.90) a região subcapsular de/na análise.

A avaliação das proporções de células CD3 mais CD8−/CD3 mais CD8 mais mostrou uma proporção significativamente maior em pacientes com<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

A distância média mais curta das células CD68 plus para as células CD3 plus , CD3 plus CD8 plus e CD20 plus (painel I) e das células CD163 plus para as células CD4 plus , CD4 mais Tbet plus e CD4 plus GATA3 plus (painel II) não diferiram significativamente entre os grupos de pacientes. Os resultados são visualizados na Fig. 4.

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Discussão

Neste estudo, desenvolvemos um método para a quantificação precisa e objetiva de infiltrados de células inflamatórias em biópsias de enxerto de pacientes transplantados renais com DGF que contorna o corte seriado extenso de material de biópsia renal. Para este propósito, combinamos IHC multiplex, amplificação de sinal de tiramida, imagem multiespectral e quantificação por CNNs. Fomos os primeiros a converter dados multiespectrais lado a lado em uma única imagem cromogênica artificial por marcador de célula, facilitando a análise WSI e a aplicação de CNNs projetadas para IHC de campo claro. Projetamos duas novas CNNs para a detecção de linfócitos e macrófagos com coloração nuclear e demonstramos a generalização das CNNs desenvolvidas em IHC WSI tradicional para IHC WSI de campo claro artificial. A aplicabilidade do nosso método foi demonstrada usando os resultados quantitativos obtidos pelas CNNs para estudar as correlações do microambiente inflamatório em biópsias de 6 semanas de pacientes com DGF com o desenvolvimento de IFTA 6 meses após o transplante.

Usamos um kit de coloração manual disponível comercialmente para IHC multiplex para visualizar células imunes e capilares peritubulares em biópsias de vigilância obtidas 6 semanas após o transplante. O procedimento de coloração multiplex consistiu em várias etapas de lavagem, incubação e ebulição do tecido e envolveu várias soluções reagentes. Extensas validações de métodos e controles de qualidade são, portanto, de grande importância, e o uso de anticorpos específicos que produzam uma intensidade de coloração consistente é recomendado. Apesar das etapas de validação realizadas, padrões de coloração semelhantes a macrófagos foram vistos nos canais CD4 das lâminas dos painéis mTSA I e II. Os ciclos de coloração de CD4 e CD68 não foram realizados consecutivamente, portanto, esse fenômeno não pode ser causado por remoção incompleta do anticorpo CD68 (Tabela Suplementar 1). Embora raras ocorrências de positividade dupla de macrófagos com CD4 tenham sido descritas [31], uma explicação mais plausível está na proximidade dos espectros de emissão de fluoróforos que foram usados ​​para visualização de CD4 (520 nm) e CD68 (540 nm), ambos cobertos pelo cubo do filtro FITC do microscópio de fluorescência. Isso pode causar "sangramento" do forte sinal CD68 no canal CD4. Grande parte deste sinal foi excluído da análise no painel I porque apenas as células CD4 plus que eram duplamente positivas com CD3 foram usadas para análise geral de células T auxiliares. No entanto, decidimos avaliar indiretamente também as células T auxiliares gerais, usando CD3 mais CD8− como substituto. No painel II, o CD4 foi usado apenas em combinação com Tibet e GATA3, limitando o risco do uso de detecções de falso-positivo.

A positividade mais baixa de CD68 foi observada no painel II em comparação com o painel I. Nossa hipótese é que este seja o resultado da inibição estérica pelo depósito de tiramida pertencente ao CD163 ("efeito guarda-chuva") [32]. Observamos significativamente mais células CD163-positivas na coorte estudada do que no tecido da amígdala que foi usado para verificar a inibição estérica, possivelmente explicando por que esse efeito não foi descoberto durante a validação.

Multiplex IHC foi combinado com imagens multiespectrais para o exame do microambiente tumoral em vários estudos oncológicos e, recentemente, também para a análise de rejeição de aloenxertos renais [33-35]. Para extrair a contribuição de todos os marcadores em slides mTSA, as seções são fotografadas com um sistema Vectra ou um microscópio de fluorescência semelhante com uma configuração multiespectral. Depois de gravar uma imagem de visão geral de baixa ampliação, o sistema Vectra divide o tecido em ladrilhos e varre automaticamente os ladrilhos multiespectralmente. Isso resulta em blocos de imagem com vários espectros de contribuição. Como os espectros dos fluoróforos únicos são conhecidos da “biblioteca” espectral pré-gravada, é possível decompor os ladrilhos multiplex em vários ladrilhos únicos representando a contribuição de cada fluoróforo (“desmisturar”). Na maioria dos estudos, as imagens não misturadas são posteriormente analisadas com software comercial. Em muitos casos, esses programas não suportam a análise WSI, têm dificuldade em analisar células agrupadas e muitas vezes não são resilientes a artefatos e variações de coloração. A conversão dos ladrilhos não misturados em IHC WSIs de campo claro artificial nos permitiu aplicar uma CNN existente especificamente projetada para detecção de linfócitos em IHC [22] (referida como detecção de linfócitos CNN I). Essa rede pode detectar linfócitos individuais e agrupados com alta precisão enquanto é resiliente à coloração de fundo (Fig. 2, CD3). Além disso, treinamos duas novas CNNs para a detecção de células com padrões de coloração nuclear (Tibet, GATA3) (detecção de linfócitos CNN II) e para a detecção de macrófagos. Os macrófagos são notoriamente difíceis de detectar devido ao seu padrão de coloração disperso. A CNN de detecção de macrófagos foi, portanto, treinada usando as anotações de quatro especialistas diferentes. Antes de fazer as anotações, várias reuniões foram planejadas onde os critérios para anotação de macrófagos foram discutidos e avaliados. Isso resultou em uma rede que pode detectar macrófagos de forma reprodutível enquanto é robusta para coloração não específica (Tabela 2, Fig. 2 e Fig. 6 Complementar). Até onde sabemos, este é o primeiro algoritmo para detecção de macrófagos em cortes histopatológicos escaneados. Testamos o desempenho de todas as três redes em um conjunto de teste composto por IHC WSI tradicional (semelhante aos usados ​​durante o treinamento) e em um conjunto de teste secundário que consistia em IHC WSI de campo claro artificial, gerado a partir das imagens gravadas multiespectralmente. Todas as CNNs mostram um desempenho muito bom nos conjuntos de testes primários e pontuações F{11}}semelhantes nos conjuntos de testes secundários. As métricas de desempenho da detecção de linfócitos CNN I foram calculadas em tecido normal, artefatos e aglomerados de células. A IHC artificial de campo claro do segundo conjunto de teste não continha artefatos de tecido e menos aglomerados de células. Isso pode explicar o melhor desempenho geral dessa rede no segundo conjunto de teste. A CNN de detecção de macrófagos foi treinada e testada em anotações de quatro anotadores diferentes. Embora os critérios de anotação tenham sido particularmente discutidos, mesmo assim foram observadas variações no estilo de anotação. A sensibilidade da CNN está, portanto, provavelmente em algum lugar no meio dos extremos do estilo de anotação. As anotações para o segundo conjunto de teste foram geradas por um anotador, aparentemente combinando com a sensibilidade da CNN.

O uso das CNNs descritas nos permitiu investigar o infiltrado inflamatório com precisão sem precedentes em uma série única de biópsias de vigilância precoce rigorosamente selecionadas de pacientes transplantados com DGF.

Infelizmente, várias amostras tiveram que ser excluídas da análise, principalmente devido a tecido residual insuficiente após a investigação diagnóstica. Mesmo com o tamanho limitado do conjunto de dados, encontramos densidades de células CD163 plus significativamente mais altas em biópsias de pacientes com DGF que evoluíram para o desenvolvimento de IFTA, o que está de acordo com o papel potencialmente pró-fibrótico dessas células [11]. Embora a tendência observada tenha sido consistente com os dados publicados, não pudemos confirmar o efeito prejudicial da presença precoce de CD68 mais macrófagos que foram relatados anteriormente para outros grupos de pacientes de transplante renal [7, 36, 37]. Encontramos uma correlação positiva entre as densidades de células CD4 plus GATA3 plus e células CD163 plus, o que pode confirmar a contribuição dos linfócitos T-helper 2 para um microambiente pró-fibrótico. Embora nenhum novo biomarcador preditivo para o desenvolvimento de IFTA em pacientes com DGF tenha sido descoberto neste estudo, desenvolvemos com sucesso métodos para a avaliação precisa, reprodutível e escalável de infiltrado inflamatório em tecido esparso, como biópsias de transplante. Esses métodos são valiosos para futuros estudos quantitativos sobre inflamação em tecidos histopatológicos.

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Disponibilidade de dados

Solicitações de colaboração envolvendo o uso dos dados apresentados neste estudo podem ser endereçadas ao autor correspondente (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) ou FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).

Agradecimentos

Agradecemos a Mark Gorris e Kiek Verrijp por seus conselhos sobre coloração e imagem de mTSA, Merijn van Erp por desenvolver a funcionalidade ImageJ personalizada e Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg e Martijn Otten por gerar a verdade do terreno para a rede de detecção de macrófagos. Além disso, agradecemos a Irina Scheffner por sua ajuda na coleta de dados clínicos.

Contribuições do autorMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH e JAWML

desenhou o estudo. O material do paciente e os dados clínicos foram coletados e fornecidos por JS, WG e FF. FF coordenou os esforços realizados no MHH. JHB, EJS e JK pontuaram o slide PAS para porcentagem de IFTA. MH realizou as colorações de mTSA, validações dos painéis I e II, e a imagem e não mistura do painel I. VV imaged e painel II não misturado. DJG desenvolveu os métodos para converter blocos mTSA em WSI de campo claro artificial. MH realizou as conversões. ZS-C desenvolveu as CNNs de detecção de linfócitos e escreveu os scripts para quantificação de linfócitos. JL desenvolveu as CNNs de detecção de macrófagos e escreveu os scripts para quantificações de macrófagos. MH realizou as quantificações celulares e capilares. O NSS calculou as distâncias das células. MH, BS, LBH e JAWML analisaram os dados. MH fez os números e redigiu o artigo. A versão final do manuscrito foi revisada e aprovada por todos os autores.

FinanciamentoEste trabalho foi apoiado pela iniciativa ERACoSysMed (projeto SysMIFTA) como parte do Programa-Quadro Horizonte 2020 da União Europeia oferecido pela ZonMw (bolsa nº 9003035004), com co-financiamento do Ministério Alemão de Pesquisa e Educação (BMBF), bolsa não . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) e FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). A JAWML recebeu honorários de consultoria da Philips (Holanda) e subsídios da

ContextVision, Philips (Holanda) e Sectra (Suécia), fora do trabalho enviado. JK recebeu apoio financeiro da Dutch Kidney Foundation (projeto DEEPGRAFT, Grant No. 17OKG23).

Conformidade com os padrões éticos

Conflito de interesseOs autores declaram não haver interesses conflitantes.

Aprovação ética e consentimento para participarA coleta e análise de dados foram realizadas com consentimento informado do paciente e aprovação do conselho de ética (nº 2765) da Hannover Medical School.

Nota do editorA Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.

Acesso livreEste artigo está licenciado sob uma Licença Creative Commons Atribuição 4.0 Licença Internacional, que permite o uso, compartilhamento, adaptação, distribuição e reprodução em qualquer meio ou formato, desde que você dê os devidos créditos ao(s) autor(es) original(is). ) e a fonte, forneça um link para a licença Creative Commons e indique se foram feitas alterações. As imagens ou outros materiais de terceiros neste artigo estão incluídos na licença Creative Commons do artigo, salvo indicação em contrário em uma linha de crédito para o material. Se o material não estiver incluído na licença Creative Commons do artigo e seu uso pretendido não for permitido por regulamentação legal ou exceder o uso permitido, você precisará obter permissão diretamente do detentor dos direitos autorais.

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