Efeitos protetores da quercetina no dano epitelial tubular induzido por estresse oxidativo no modelo experimental de hiperoxalúria em ratos

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Abstrato: Antecedentes e Objetivos: Os mais comunspedras nos rinssão as pedras de cálcio e as pedras de oxalato de cálcio (CaOx) são o tipo mais comum de pedras de cálcio. A hiperoxalúria é um fator de risco essencial para a formação desses cálculos.Quercetinaé um polifenol com efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e muitos outros efeitos fisiológicos. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito protetor da quercetina na nefrolitíase induzida por hiperoxalúria. Materiais e Métodos: Ratos machos Wistar-Albino pesando 250-300 g (n=24) foram randomizados em três grupos: Controle (n=8), etilenoglicol (EG)(n{{6) }}) e EG mais quercetina (n=8). Uma solução de EG-água a um por cento foi dada a todos os ratos, exceto ao grupo controle, como água potável por cinco semanas. A solução de quercetina-água foi administrada ao grupo EG mais quercetina por gavagem oral na dose de 10 mg/kg/dia. Os níveis de malondialdeído (MDA), catalase (CAT), uréia, cálcio e oxalato foram analisados ​​em amostras de sangue e urina. Exames histopatológicos e análises imuno-histoquímicas paraestresse oxidativoeinflamaçãoindicadores p38 proteína quinase ativada por mitógeno (p38-MAPK) e fator nuclear kappa B (NF-kB) foram realizados em tecidos renais. Resultados: Os níveis de MDA foram significativamente mais baixos no grupo tratado com quercetina do que no grupo tratado com EG (p=0.001). Embora os níveis de CAT fossem maiores no grupo tratado com quercetina do que no grupo administrado com EG, eles não foram significativamente diferentes entre esses grupos. A expressão de p38 MAPK foi significativamente menor no grupo tratado com quercetina do que no grupo EG (p<0.004). there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" quercetin="" and="" eg="" groups="" in="" terms="" of="" nf-kb="" expression.="" conclusions:="" we="" conclude="" that="" hyperoxaluria="" activated="" the="" signaling="" pathways,="" which="" facilitate="" the="" oxidative="" processes="" leading="" to="" oxalate="" stone="" formation="" in="" the="" kidneys.="" our="" findings="" indicated="" that="" quercetin="" reduced="" damage="" due="" to="" hyperoxaluria.="" these="" results="" imply="" that="" quercetin="" can="" be="" considered="" a="" therapeutic="" agent="" for="" decreasing="" oxalate="" stone="" formation,="" especially="" in="" patients="" with="" recurrent="" stones="" due="" to="">

Palavras-chave: oxalato de cálcio; hiperoxalúria; estresse oxidativo; quercetina

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1. Introdução

A formação de cálculos urinários envolve vários fatores, incluindo a concentração de íons que causam a formação de cálculos, pH urinário, taxas de fluxo urinário e anatomia do trato urinário[l]. Aproximadamente 75 por cento dos cálculos renais são cálculos de cálcio, e os cálculos de oxalato de cálcio (CaOx) são os cálculos de cálcio mais comumente encontrados [2,3]. Sabe-se que a hiperoxalúria é um fator de risco essencial para a formação desses cálculos. O aumento resultante na concentração urinária de oxalato induz a formação de cálculos via íons cálcio e oxalato para formar cristais de CaOx em pH fisiológico. Foi demonstrado que a concentração excessiva de oxalato danifica as células tubulares renais via radicais livres de oxigênio e aumento da peroxidação lipídica e este processo facilita tanto a formação de cristais de CaOx quanto sua fixação ao epitélio tubular renal [4,5].

Apesar das melhorias no tratamento de cálculos renais, as taxas de recorrência de 10% em um ano, 35% em cinco anos e 50% em dez anos foram relatadas para cálculos de oxalato de cálcio [6,7]. Essas altas taxas de recorrência levaram os pesquisadores a explorar possíveis métodos preventivos para a recorrência de cálculos de CaOx [6-8].

Quercetinaé um flavanol encontrado em vários alimentos, incluindo nozes, vinho, sementes e algumas frutas e vegetais [8]. Além de suas potentes atividades antioxidantes, de eliminação de radicais e anti-inflamatórias, também possui atividades antibacterianas, antivirais, gastroprotetoras e imunomoduladoras [8-10].

Um aumento no estresse oxidativo foi mostrado em pacientes com cálculos renais [11]. Como tal, um menor risco de nefrolitíase foi relatado em pacientes com altos níveis de antioxidantes do que aqueles com baixos níveis de antioxidantes [12]. Foi demonstrado que as placas de Randall, que se acredita serem formadas devido ao estresse oxidativo, têm um papel essencial na recorrência de cálculos de CaOx [13]. Portanto, a inibição da formação da placa de Randall e do estresse oxidativo pode ser benéfica para prevenir a recorrência de cálculos.

Este estudo investigou o possível efeito protetor da quercetina na nefrolitíase e nefrocalcinose, determinando seu impacto no estresse oxidativo e na inflamação em um modelo de hiperoxalúria em ratos.

2. Materiais e métodos

2.1. Animais

Ratos Wistar-Albino machos pesando 250-300 g (n =24) foram usados ​​neste estudo experimental, conduzido no Laboratório de Animais Experimentais da Universidade Süleyman Demirel. Os ratos foram alojados em uma sala mantida a 25±1 graus com 55 por cento de umidade relativa. Eles receberam comida e água ad libitum. O estudo foi conduzido após aprovação do Comitê de Revisão Ética de Experimentos Animais da Universidade Süleyman Demirel (número de aprovação: 33/01). Todos os experimentos foram realizados com base nos princípios éticos relatados na Diretiva da União Europeia 2010/63/EU para experimentos com animais.

2.2. Produtos químicos

O etilenoglicol (EG) foi adquirido da Merck Chemicals (Darmstadt, Alemanha), enquanto a quercetina foi adquirida da Sigma Chemicals (St. Louis, MO, EUA).

2.3. Modelo de nefrolitíase induzida por hiperoxalúria e administração de quercetina

Os ratos foram divididos aleatoriamente em três grupos; controle (n{{{{10}}}}), EG(n =8) e EG mais quercetina (n =8) grupos. Todos os ratos, exceto o grupo controle, receberam 1% de solução de EG-água como água potável por cinco semanas[14]. Uma dose de 10 mg/kg/dia da solução de quercetina-água foi administrada aos ratos do grupo EG mais quercetina por gavagem oral. Amostras de urina de 24 horas foram coletadas dos animais no dia 0 antes da administração de EG ou quercetina e nos dias 15 e 30. Os ratos foram anestesiados ao final do período de cinco semanas do experimento e amostras de sangue foram coletadas da cava inferior veia. Em seguida, os ratos foram sacrificados e ambos os rins foram rapidamente excisados. Os rins direitos foram embebidos em formaldeído tamponado a 10 por cento. Os rins esquerdos foram lavados com solução fria de cloreto de sódio a 0,9 por cento e armazenados a -80 grau até a homogeneização.

2.4. Análises Bioquímicas

A análise dos níveis plasmáticos de oxalato foi realizada pela técnica previamente descrita por Ladwig et al. [15]. O nível de oxalato urinário foi determinado pelo kit enzimático Trinity Biotech Oxalate (Trinity Biotech pic, St. Louis, MO, EUA). Catalase (CAT) é uma enzima antioxidante [10,16]. A atividade da catalase foi medida pelo método Aebi [16]. Os níveis de proteína sobrenadante foram analisados ​​por albumina sérica bovina usando o método Lowry conforme descrito no protocolo padrão[17]. Os níveis de malondialdeído (MDA) também foram analisados, uma vez que o MDA é considerado um biomarcador de estresse oxidativo [9]. Os níveis de malondialdeído foram medidos espectrofotometricamente de acordo com o método proposto por Ohkawa et al. [18]A detecção de proteínas foi realizada usando o método descrito por Lowry et al. [17]. Os níveis de creatinina no plasma e na urina foram medidos por colorimetria pelo método de Jaffe; as concentrações plasmáticas de uréia foram analisadas por métodos cinético-colorimétricos e reações de urease e glutamato desidrogenase. Em contraste, os níveis de cálcio na urina foram medidos por um autoanalisador via Schwarzenbach e o método do complexo o-cresolftalina. Amostras cronometradas de urina e sangue foram coletadas para cálculo do clearance de creatinina. O volume urinário (V) foi expresso em mL, enquanto os níveis séricos e urinários de creatinina foram expressos em mg/dl. O clearance de creatinina foi calculado de acordo com a fórmula:

Depuração de creatinina (mL/min)=U(mg/dL)× V(mL/min)/S (mg/dL)[V:volume de urina (mL/min), U:creatinina de urina (mg/ dL), S: Creatinina sérica (mg/dL)]

2.5. Análises Histopatológicas

Os rins direitos foram incorporados em formaldeído tamponado a 10 por cento (Merck-KGaA, Darmstadt, Alemanha). O processamento do tecido foi iniciado após um período de fixação de 24-48 h.Rimos tecidos foram corados com hematoxilina e eosina (H&E) e examinados ao microscópio de luz. Os exames histopatológicos foram realizados com aumentos de 10x, 20x e 40x, principalmente para avaliar a congestão vascular na medula e nos glomérulos corticais, a intensidade da infiltração de células mononucleares e os tamanhos e formas do lúmen tubular.

2.6. Análises imunohistoquímicas

O fator de transcrição nuclear-kB(NF-kB) e a proteína quinase ativada por mitógeno p38 (p38-MAPK) são as duas principais vias de sinalização em nível de proteína na biossíntese de citocinas pró-inflamatórias [19]. Além disso, o oxalato ativa seletivamente a via de sinalização p38-MAPK [20]. As lâminas foram levadas para o recipiente de incubação após o bloqueio. O anticorpo NF-kB/p65 (Santa Cruz, sc-109) foi adicionado à primeira seção, o anticorpo MAPK/p38 (Santa Cruz, sc-7149) à segunda seção e um anticorpo secundário ( Anti-polivalente de cabra, Thermo) foi adicionado às seções subsequentes para fins de controle e mantido a mais 4 graus durante a noite. O kit de coloração ABC (Santa Cruz, sc-2018) foi usado para o restante do protocolo de coloração. O tecido coberto com lamela usando Entella foi armazenado e seco para exame com um microscópio de luz. Os cortes foram graduados da seguinte forma, dependendo da intensidade da coloração em microscopia de luz, como no estudo de Liu HS et al. [19]:（一）pontuação (pontuação negativa)∶ sem coloração;

(mais) pontuação (1 pontuação positiva): leve;

(mais mais) escore (2 pontuações positivas): moderado;

(mais mais mais) pontuação (3 pontuações positivas): a coloração completa está presente.

2.7.Estatísticas

A análise estatística foi realizada usando o software Statistical Package for Social Sciences 11.0 (SPSS 11.0). Os valores foram dados como média ± desvio padrão. A distribuição normal das variáveis ​​foi testada por um teste de Kolmogorov-Smirnov de amostra única. Realizou-se uma ANOVA de uma via e, se significativa, utilizou-se o teste post hoc de Duncan para avaliar e determinar as diferenças entre os grupos. O valor de p foi considerado significativo quando estava abaixo<>

3. Resultados

3.1. Resultados bioquímicos

Os dados do grupo de estudo são mostrados na Tabela 1. O nível médio de MDA do grupo EG foi maior do que o grupo controle, enquanto o nível médio de MDA do grupo quercetina foi significativamente menor do que o grupo EG (p= 0.001) . Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos quanto à atividade do CAT. Em nosso estudo, os níveis de MDA foram reduzidos pela quercetina, enquanto a atividade da CAT não foi afetada pela quercetina. Os níveis de oxalato urinário foram significativamente maiores no grupo GE do que nos outros grupos (p<0.001). however,="" the="" urinary="" oxalate="" levels="" of="" the="" quercetin="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" the="" eg="" group=""><0.001). these="" results="" indicated="" that="" quercetin="" reduced="" the="" urinary="" oxalate="" levels,="" which="" were="" increased="" by="" eg="" administration.="" while="" the="" plasma="" urea="" concentration="" increased="" significantly="" in="" the="" eg="" group="" compared="" to="" in="" the="" control="" group,="" a="" statistically="" significant="" decrease="" was="" observed="" in="" the="" quercetin="" group="" compared="" to="" the="" eg="" group=""><0.05). there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" groups="" in="" terms="" of="" creatinine="" clearance="" and="" plasma="" oxalate="" levels="" (p="">0.05). Embora a quercetina tenha diminuído o nível de oxalato no plasma, isso não foi estatisticamente significativo. A concentração urinária de cálcio foi significativamente menor nos outros grupos do que no grupo controle (p<0.05). however,="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" eg="" and="" quercetin="" groups="" in="" terms="" of="" mean="" urinary="" calcium="" concentrations.="" altogether="" these="" findings="" indicate="" that="" eg="" increased="" urinary="" oxalate="" excretion="" and="" plasma="" urea="" concentration="" and="" decreased="" urinary="" calcium="">

3.2. Resultados histopatológicos

Os exames histopatológicos dos rins de ratos do grupo controle sob microscopia de luz revelaram achados normais (Figura 1-Controle). Achados, incluindo congestão nos vasos glomerulares, infiltração de células mononucleares e estreitamento dos lúmens tubulares, especialmente nos túbulos proximais, foram detectados no grupo EG (Figura 1-EG). Achados histopatológicos semelhantes foram observados no grupo da quercetina, mas todos foram mais leves (Figura 1-EG mais quercetina). No entanto, nenhum sistema de pontuação foi usado para avaliar se essa diferença era estatisticamente significativa.

3.3. Resultados imunohistoquímicos

O impacto da quercetina na proteína quinase ativada por mitógeno p38 (p38-MAPK) e fator nuclear kappa B(NF-kB) foi investigado por coloração imuno-histoquímica dos tecidos renais (Figura 2). A comparação dos grupos em termos de p38-MAPK elucidou que os tecidos renais dos ratos do grupo EG foram significativamente mais corados do que os do grupo controle (p<0.001). on="" the="" other="" hand,="" p38-mapkstaining="" was="" significantly="" less="" intense="" in="" the="" quercetin="" group="" than="" in="" the="" eg="" group.="" the="" statistical="" analysis="" revealed="" that="" quercetin="" reduced="" p38-mapk="" activity="" significantly="" compared="" to="" the="" eg="" group=""><>

Uma comparação dos grupos quanto à imunocoloração de NF-kB revelou que os tecidos renais dos ratos do grupo EG foram significativamente mais corados do que os dos ratos do grupo controle (p<0.001). there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" other="" groups="" in="" terms="" of="" the="" intensity="" of="" nf-kb="" staining.="" altogether,="" these="" findings="" pointed="" out="" that="" eginduced="" the="" p38-mapk="" and="" nf-kb="" activities="" in="" renal="" tissues.="" additionally,="" quercetin="" significantly="" reduced="" p38-mapk="" activity="" while="" it="" had="" no="" significant="" effect="" on="" nf-kb="" activity.="" the="" relevant="" data="" are="" displayed="" in="" table="">

4. Discussão

Apesar dos avanços nos métodos minimamente invasivos para o tratamento da nefrolitíase, as altas taxas de cálculo residual e de recorrência ainda constituem problemas graves para os pacientes e urologistas [21]. Portanto, estratégias eficazes de tratamento médico são necessárias.

Os mecanismos exatos de formação de cálculos não foram identificados; no entanto, sabe-se que aproximadamente 80 por cento dos cálculos renais contêm CaOx e uma das causas mais comuns de cálculos de CaOx é a hiperoxalúria [1,22]. O oxalato é um subproduto do metabolismo normal, eliminado do corpo em condições normais [20]. Na hiperoxalúria. o oxalato urinário em excesso combina-se com o cálcio no pH fisiológico e forma cristais de CaOx, que se acumulam nos rins. Os cristais de CaOx demonstraram danificar as células epiteliais tubulares renais e levar à doença de cálculos renais [14,20]. Portanto, modelos de ratos com hiperoxalúria foram amplamente utilizados para imitar a formação de cálculos renais em humanos. Nesses estudos, o EG foi usado como agente indutor de hiperoxalúria, como foi o caso em nosso estudo [14,20].

Foi relatado que a concentração de oxalato na urina aumentou em dois dias, a hiperoxalúria se desenvolveu em três dias, a cristalúria por CaOx se desenvolveu em duas semanas e a nefrolitíase por CaOx foi observada em {{0}} semanas quando 0.{{2} } por cento de EG foi administrado para induzir hiperoxalúria [14,22]. Ao final desse processo, outros fatores urinários e depuração de creatinina permaneceram dentro dos limites normais, enquanto o pH urinário e a excreção de citrato foram significativamente reduzidos [14,22]. Em nosso estudo, induzimos hiperoxalúria administrando 1% de EG, que posteriormente levou a danos celulares nas células tubulares.

Na hiperoxalúria, o acúmulo de cristais de CaOx no lúmen do ducto coletor da papila renal e os depósitos semelhantes a cálculos resultantes levam à obstrução, o que abre caminho para a deterioração renal. Como resultado desse processo, os níveis sanguíneos de resíduos nitrogenados, como ácido úrico, nitrogênio ureico no sangue e creatinina, podem aumentar [22,23]. Em nosso estudo, a disfunção renal foi demonstrada por um aumento acentuado dos níveis séricos de uréia nos animais tratados com EG. No entanto, o tratamento com quercetina reduziu significativamente os níveis séricos de uréia.

A quercetina é uma molécula com potentes efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios [24]. É encontrado em vegetais, frutas, chá e vários tipos de alimentos. Além de ser o forte eliminador de espécies reativas de oxigênio (ROS), a quercetina aumenta a capacidade antioxidante total do plasma [25,26]. Foi relatado em alguns estudos que os flavonóides reduzem o estresse oxidativo nas células tubulares renais, previnem o acúmulo de cristais de CaOx e reduzem a peroxidação lipídica induzida pelo oxalato em culturas celulares [27,28].

É amplamente aceito que o estresse oxidativo desempenha um papel significativo na formação de cálculos renais [12,22]. Os cristais de CaOx se acumulam no tecido renal levando à síntese de várias macromoléculas que iniciam processos inflamatórios e fibrogênicos. Espécies reativas de oxigênio estão provavelmente envolvidas em vários eventos de sinalização durante este período [14]. Em estudos de cultura de células epiteliais em animais e rins, a formação de radicais livres foi mostrada em resposta à hiperoxalúria e formação de cristais de CaOx [20,22]. Uma vez que os lipídios são as biomoléculas mais sensíveis na membrana celular contra os radicais livres, a peroxidação lipídica ocorre nas membranas celulares [27,28]. A peroxidação lipídica é o principal evento de dano celular, uma vez que rompe a estrutura da membrana e, posteriormente, causa dano celular. O MDA é um indicador de peroxidação lipídica; também indica que ROS são superproduzidos [22,29]. Portanto, é usado na avaliação da peroxidação lipídica. Sabe-se que os danos causados ​​pela deposição de cristais de CaOx e a formação de EROs podem ser prevenidos ou reduzidos por antioxidantes endógenos como superóxido dismutase (SOD), CAT e glutationa peroxidase (GSH-Px) [20,22,29]. No presente estudo, os níveis de MDA aumentaram em um modelo animal experimental de nefrolitíase hiperoxalúrica, que foi criado com sucesso pela administração de etilenoglicol. Nosso estudo também mostrou que a quercetina reduziu o efeito de aumento do estresse oxidativo da hiperoxalúria, conforme demonstrado por parâmetros bioquímicos e histopatológicos.

Sabe-se que as EROs ativam moléculas sinalizadoras como a proteína quinase C (PKC), c-Jun N-terminal quinase (JNK) e p38-MAPK [21]. A ativação dessas moléculas de sinal leva à indução de fatores de transcrição NF-kB e proteína ativa-1(AP-1). Como resultado desses eventos, a expressão de proteínas como proteína quimioatraente de monócitos-1 (MCP-1), osteopontina (OPN), fibronectina e fator de crescimento transformador beta 1 (TGF{{11} }) aumentar [20]. Essas proteínas facilitam a adesão dos cristais de CaOx e os processos inflamatórios relevantes [20]. Peerapen et ai. relataram que as vias de sinalização de p38-MAPK mediaram a interrupção das conexões estreitas entre as células epiteliais [30]. Eles também mostraram que a expressão das proteínas envolvidas na via de sinalização p38-MAPK aumentou durante a formação de cálculos de oxalato de cálcio. Também foi demonstrado que o oxalato ativou seletivamente a via de sinalização p38-MAPK, que teve um papel essencial na nefrotoxicidade do oxalato em células epiteliais do rim humano [31]. Shiyong Qi et ai. provou que os cristais de CaOx induzem o aumento de moléculas de adesão em células epiteliais tubulares proximais, e este processo foi mediado pela via de sinalização p38-MAPK [31]. Nosso estudo mostrou que o oxalato induziu a ativação de p38-MAPK e NF-kB. Além disso, mostramos que a quercetina reduziu significativamente a atividade da p38-MAPK. Com base nessas informações, pode-se sugerir que a quercetina pode prevenir a recorrência de cálculos de CaOx.

O estudo tem algumas limitações. A primeira é que não houve grupo controle administrado com quercetina isolada, portanto, o efeito da quercetina administrada por via oral na produção e absorção intestinal de oxalato não foi claramente avaliado. Em segundo lugar, o efeito da quercetina na absorção de etilenoglicol também não foi avaliado. Consequentemente, mais pesquisas são necessárias para esclarecer o mecanismo de ação da quercetina na hiperoxalúria.

5. Conclusões

Concluímos que a quercetina inibiu os processos inflamatórios e oxidativos desencadeados pela hiperoxalúria nos tecidos renais. Como esses processos levam à formação de cálculos de CaOx, a quercetina pode ser considerada no tratamento médico preventivo de cálculos recorrentes de CaOx. No entanto, mais pesquisas experimentais e clínicas são necessárias para validar nossos achados.

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