Preveja o papel do LncRNA no envelhecimento renal com base no sequenciamento de RNA Ⅱ

Correlação de lncRNA Gm43360 e seus potenciais mRNAs alvo

O LncRNA Gm43360 foi selecionado para estudo porque conectou duas redes de coexpressão lncRNA-mRNA. O nível de expressão de Adra1a foi positivamente correlacionado (rho=0.8650, p=0.026) com o de Gm43360, Csnk1a1 (caseína quinase 1A1) foi negativamente correlacionado (rho{{12 }}.8084, p=0.0084) (Fig. 5a). Para verificar ainda mais a correlação de lncRNA Gm43360 e seus potenciais mRNAs alvo Adra1a e Csnk1a1, um plasmídeo de superexpressão de lncRNA Gm43360 foi projetado neste estudo. A expressão de Csnk1a1 diminuiu conforme esperado e a expressão de Adra1a também diminuiu, mas não significativamente. Em seguida, derrubamos o lncRNA Gm43360 pelo siRNA para detectar se a expressão de seus mRNAs alvo foi afetada. Como esperado, Csnk1a1 foi aumentado em células knockdown de lncRNA Gm43360 em relação ao grupo de controle negativo de siRNA (Fig. 5b). Dez, detectamos o papel do lncRNA Gm43360 no ciclo celular. Os resultados do kit de contagem de células -8 (CCK -8) mostraram que o lncRNA Gm43360 promoveu a viabilidade celular (Fig. 5c). Os resultados mostraram que o lncRNA Gm43360 aumentou a percentagem de células da fase S e diminuiu a percentagem de células da fase G1 em comparação com o controlo negativo (Fig. 5d). As proteínas p53 e p21 estavam envolvidas na regulação do ciclo celular e, portanto, eram marcas do envelhecimento celular. Os níveis de expressão de p53 e p21 diminuíram significativamente no grupo de superexpressão em relação ao grupo controle. Os níveis de expressão de p53 e p21 foram significativamente aumentados no grupo siRNA em relação ao grupo controle de siRNA (Fig. 5e). A superexpressão de lncRNA Gm43360 diminuiu o número de células positivas para SA- -gal, e as células positivas para -gal aumentaram no grupo de transfectados Gm43360 (Fig. 5f). Tomados em conjunto, estes resultados indicaram que o lncRNA Gm43360 inibiu a senescência das células epiteliais tubulares renais porinibindo a expressão de Csnk1a1.

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Discussão

Neste estudo, avaliamos os dados de expressão de mRNA de rins de camundongos jovens e velhos e conduzimos análises de bioinformação que revelaram as funções dos mRNAs expressos de forma aberrante. Observamos 347 mRNAs regulados positivamente e 355 mRNAs regulados negativamente, bem como 130 lncRNAs regulados positivamente e 91 lncRNAs regulados negativamente emrins de camundongos velhos em comparação com rins de camundongos jovens. Além disso, foi demonstrado que estes mRNAs estão envolvidos em vias relacionadas ao envelhecimento, comofosforilação oxidativa, a via de sinalização AMPK, a via de sinalização Wnt, a via de sinalização Rap1 e doenças relacionadas à idade, que demonstraram as funções de mRNAs expressos diferencialmente na patogênese do envelhecimento renal.

O longo RNA não codificante NEAT1 é um fator protetor na progressão da fibrose renal nas células epiteliais tubulares renais [21]. Coincidentemente, em nossos resultados de sequenciamento, o lncRNA NEAT1 foi expresso em níveis mais baixos nos rins de camundongos idosos do que em camundongos jovens, o que é consistente com descobertas anteriores. LincRNA-Gm4419 acelera a inflamação e a fibrose por mecanismos mediados pelo inflamassoma NF-kB / NLRP3 na nefropatia diabética [22]. Em nossos resultados de sequenciamento, também descobrimos que a expressão de Gm4419 foi maior nos rins de camundongos idosos do que em camundongos jovens, mas não houve diferença significativa. LncRNA Gm43360 está localizado no cromossomo 5 (Chr5: 122494022–122.494.908, 2.887 pb). De acordo com o UCSC Genome Browser, o Gm43360 está localizado no íntron do gene codificador da proteína Atp2a2. No entanto, até o momento não houve relatos sobre o envolvimento do lncRNA Gm43360 em doenças. Neste estudo, o knockdown do lncRNA Gm43360 promoveu a senescência das células epiteliais tubulares renais. Além disso, identificamos muitos lncRNAs expressos diferencialmente nos resultados de sequenciamento e os investigamos.

Os LncRNAs foram classificados em regulação cis ou regulação trans com base nos mecanismos reguladores do lncRNA. Os lncRNAs de ação cis podem influenciar a expressão de genes vizinhos dependendo de elementos de ação cis, como promotores, intensificadores e sequências reguladoras, que são distâncias entre lncRNAs e mRNAs inferiores a 100 kb. Os lncRNAs de ação trans referem-se aos lncRNAs que saem do local de transfecção e operam em locais distantes (ou seja, a distância entre lncRNAs e mRNAs é superior a 100 kb) [23]. O lncRNA MAAT aumenta a expressão do gene vizinho Mbnl1 através de um módulo regulador cis [24]. O lncRNA Pnky desempenha um papel como regulador de ação trans no desenvolvimento cortical [25]. Neste estudo, houve uma relação transregulatória entre lncRNA Gm43360 e Csnk1a1. Csnk1a1 é um gene supressor de tumor [26] que codifica uma proteína que participa do ciclo celular e do processo de divisão celular [27]. A regulação negativa de Csnk1a1 induzinflamação associada à senescênciaresposta com parada de crescimento em tumores colorretais [26]. Csnk1a1 foi regulado negativamente quando Gm43360 foi regulado positivamente; assim, é provável que o lncRNA Gm43360 participe deenvelhecimento renalporregulando a expressão Csnk1a1.

Conclusões

Nossa investigação da rede de coexpressão lncRNA-mRNA emenvelhecimento renalrevelou um lncRNA, lncRNA Gm43360, pode desempenhar um papel protetor no envelhecimento renal e expandiu nossa compreensão dos mecanismos envolvidos noenvelhecimento renal

Materiais e métodos

Amostras Camundongos C57BL/6J machos jovens (3-meses de idade) e velhos (24-meses de idade) foram adquiridos no Centro de Animais Experimentais da Universidade de Xiamen e foram criados em um ambiente padrão. Todos os ratos tiveram livre acesso a comida e água. Os ratos foram aclimatados às novas instalações durante um mês antes de serem sacrificados. Os camundongos foram anestesiados com uretano por injeção intraperitoneal na dose de 750 mg/kg antes da coleta da amostra. Camundongos jovens e velhos foram sacrificados no mesmo dia.Rim residual de ratotecido foi usado para sequenciamento em cada ensaio. RNA-seq e histopatologia foram realizados emrins separadosdo mesmo mouse. Tecido renal foi coletado de camundongos. Um rim foi imediatamente imerso em formalina tamponada neutra a 10% para posterior inclusão na seção, e o outro rim foi dividido em vários tecidos e imediatamente colocado em nitrogênio líquido e depois armazenado a -80 grau. O estudo foi apoiado pelo Comitê de Ética do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Xi'an Jiaotong (Shaanxi, China) (nº 2018-G-164). Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos de ética animal. Este estudo foi realizado em conformidade com as diretrizes da ARRIVE.

Histopatologia renal

Amostras de tecido renal de camundongos jovens e velhos foram fixadas em solução de paraformaldeído a 10% durante a noite. Dez das seções foram desidratadas, embebidas em parafina e seccionadas com espessura de 4-µm. A coloração tricromática de PAS e Masson foi realizada utilizando protocolos padrão. As imagens foram capturadas pela câmera e a área positiva para coloração foi medida. A área das imagens da câmera histopatológica foi calculada com Image-Pro Plus 6.0.

Coloração SA-gal

A atividade SA{0}}gal foi analisada usando um kit de coloração SA- -gal (Cell Signaling Technology #9860) de acordo com o protocolo do fabricante. A área de coloração positiva foi medida e as células positivas para SA- -gal foram calculadas usando o Image-Pro Plus 6.0.

Construção e sequenciamento de biblioteca de extração de RNA

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.0 foram usados ​​para construir uma biblioteca de sequenciamento. Após extração do RNA total, o RNAm foi purificado a partir do RNA total (5ug) usando Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, CA, EUA) com duas rodadas de purificação. Após a purificação, o mRNA foi dividido em fragmentos curtos usando cátions divalentes em altas temperaturas (Módulo de Fragmentação de RNA de Magnésio (NEB, cat. e6150, EUA) abaixo de 94 graus 5-7 min). Em seguida, os fragmentos de RNA clivados foram transcritos reversamente para obter o cDNA pela SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen, cat. 1.896.649, EUA), que foram em seguida usados ​​para sintetizar DNAs de segunda fita marcados com U com DNA polimerase I de E. coli ( NEB, cat.m0209, EUA), RNase H (NEB, cat.m0297, EUA) e solução dUTP (Termo Fisher, cat.R0133, EUA). Uma base A foi então adicionada às extremidades rombas de cada fio, preparando-os para ligação aos adaptadores indexados. Cada adaptador continha uma saliência de base T para ligar o adaptador ao ADN fragmentado com cauda A. Adaptadores de índice duplo foram ligados aos fragmentos e a seleção do tamanho foi realizada com esferas AMPureXP. Após o tratamento com enzima UDG termolábil (NEB, cat.m0280, EUA) dos DNAs de segunda fita marcados com U, os produtos ligados foram amplificados com PCR pelas seguintes condições: desnaturação inicial a 95 graus por 3 min; 8 ciclos de desnaturação a 98 graus por 15 s, recozimento a 60 graus por 15 s e extensão a 72 graus por 30 s; e então extensão final a 72 graus por 5 min. O comprimento médio da inserção para as bibliotecas finais de cDNA foi de 300±50 pb. Finalmente, realizamos o sequenciamento de extremidade emparelhada de 2 × 150 pb (PE150) em um Illumina Novaseq ™ 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, China) de acordo com o protocolo do fabricante [28].

Sequência de análise bioinformática e filtragem de leituras limpas

Uma biblioteca de cDNA construída por tecnologia a partir do RNA reunido deamostras de rimde camundongos foi sequenciado e executado com a plataforma de sequência Illumina NovaseqTM 6000. Usando a abordagem RNA-seq de extremidade emparelhada da Illumina, sequenciamos o transcriptoma, gerando um total de milhões de leituras de extremidade emparelhada de 2 × 150 pb. As leituras obtidas nas máquinas de sequenciamento incluem leituras brutas contendo adaptadores ou bases de baixa qualidade que afetarão a seguinte montagem e análise. Assim, para obter leituras limpas de alta qualidade, as leituras foram filtradas posteriormente pelo Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, version:cutadapt-1.9). Os parâmetros foram os seguintes:

1) remoção de leituras contendo adaptadores;

2) remoção de leituras contendo poliA e poli;

3) remoção de leituras contendo mais de 5% de nucleotídeos desconhecidos (N);

4) remoção de leituras de baixa qualidade contendo mais de 20% de bases de baixa qualidade (valor Q menor ou igual a 20).

A qualidade de dez sequências foi verificada usando FastQC [30] (//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/, 0.11.9). incluindo o conteúdo Q20, Q30 e GC dos dados limpos. Depois disso, foi produzido um total de G pb de leituras limpas e emparelhadas. Os dados brutos da sequência foram submetidos aos conjuntos de dados NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) com número de acesso GSE154223.

O genoma/anotação de referência foi Mus_musculus.GRCm38. A fonte e a versão da anotação genética usada para análises foi Ensembl_v88.

Montagem de transcrições

Primeiramente, Cutadapt [29] foi utilizado para remover as leituras que continham contaminação do adaptador, bases de baixa qualidade e bases indeterminadas. A qualidade de dez sequências foi muito alimentada usando FastQC (//www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/). Usamos Bowtie2 [31] e Hisat2 [32] para mapear leituras no genoma do camundongo. As leituras mapeadas de cada amostra foram montadas usando StringTie [33]. Dez, todas as transcrições deamostras de rimforam mesclados para reconstruir um transcriptoma abrangente usando scripts Perl. Após a geração do transcriptoma final, StringTie [33] e edgeR [34] foram usados ​​para estimar os níveis de expressão de todas as transcrições.

Identificação de LncRNA

Em primeiro lugar, os transcritos que se sobrepunham a mRNAs conhecidos e transcritos com menos de 200 pb foram descartados. Em seguida, utilizamos CPC [35] e CNCI [36] para prever transcrições com potencial de codificação. Todas as transcrições com pontuação de CPC<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

Análise de genes de análise diferencialmente expressos (DGEs)

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2 foram considerados genes diferencialmente expressos.

Predição do gene alvo e análise funcional de lncRNAs

Para explorar a função dos lncRNAs, previmos os genes alvo cis dos lncRNAs. Os LncRNAs podem desempenhar um papel cis na atuação em genes alvo vizinhos. Neste estudo, genes codificadores em 100,000 upstream e downstream foram selecionados por script Perl. Em seguida, mostramos uma análise funcional dos genes alvo para lncRNAs usando os scripts BLAST2GO [39]. O link completo dos comandos para o domínio público era Jie-Li/README.md em main · dandan-li/Jie-Li (github.com).

Categorias de ontologia genética (GO) e análise da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG)

A análise de bioinformática para sequenciamento de RNA foi realizada utilizando ferramentas OmicStudio (//www.omicsudio.cn/tool). A análise de enriquecimento funcional da Gene Ontology (GO) e a análise de enriquecimento da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) [37–39] foram usadas para analisar as funções biológicas dos genes alvo previstos. A análise GO esclarece os principais processos biológicos através de três aspectos: composição celular, funções moleculares e processos biológicos (//www.geneontology.org/). A análise primeiro coloca todos os genes expressos diferencialmente e genes de fundo no banco de dados GO. Cada item é mapeado, o número de genes em cada item é calculado e a distribuição hipergeométrica é usada para realizar testes de hipóteses para obter o valor P do resultado do enriquecimento. Quanto menor o valor P, mais significativo será o resultado do enriquecimento. KEGG é um recurso de banco de dados que analisa os mRNAs expressos diferencialmente pela biologia genética para explorar caminhos importantes relacionados aos genes alvo (//www.genome.jp/kegg/). Os resultados são expressos por valores de p; quanto menor o valor p, mais significativo é o resultado do enriquecimento.

qRT-PCR

GAPDH foi utilizado como controle endógeno. Em seguida, foram calculados os níveis relativos de expressão de genes desconhecidos. Todos os primers foram projetados e sintetizados especificamente para este experimento. Primers para GAPDH foram comercializados. A especificidade dos primers Adra1a e Csnk1a1 foi identificada pelo pico único da curva de fusão.

Construir rede de coexpressão mRNA-lncRNA

A transregulação foi baseada em pesquisas e então a energia trans foi calculada. Quanto menor for a energia trans, maior será a possibilidade de ligação. Em seguida, também foi calculado o coeficiente de correlação de mRNA-lncRNA. A rede mRNA-lncRNA foi construída escolhendo um coeficiente de correlação de Spearman superior a 0,9. A rede de coexpressão mRNA-lncRNA foi construída usando o software Cytoscape (v3.7.1).

Cultura de células

Células epiteliais tubulares proximais renais de camundongo (MRPT-EpiCs) foram cultivadas em meio animal de células epiteliais (EpiCM-a, Cat. #4131) contendo 2% de soro fetal bovino (FBS, Cat. #0010) e Suplemento de Crescimento de Células Epiteliais-animal (EpiCGS-a, Cat. #4182) sem antibióticos em uma incubadora umidificada a 37 graus e 5% de CO2. O meio de cultura foi trocado a cada 2–3 dias. As células na fase de crescimento logarítmico foram subcultivadas quando o crescimento atingiu 90%. A suspensão de células digerida pela tripsina foi semeada em placas de 6-poços com 2*104 -5*104 células em cada poço. As células utilizadas para transfecção foram todas entre as gerações 2 e 5.

Construção de plasmídeos e transfecção celular

O plasmídeo de superexpressão lncRNA Gm43360 foi construído pela GeneChem (Xangai, China). A estrutura do plasmídeo era GV658, e o promotor de CMV impulsionou a expressão de lncRNA. A sequência de nucleotídeos clonada é fornecida no material suplementar. Para knockdown de lncRNA Gm43360, três lncRNA ENS DEVEM00000197656-siRNAs direcionados (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm43360-siRNA2, 5'-CCCUGUCACUCA UGAAGUUTT-3'; e lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAACUCAAUGGGTT-3') foram projetados e sintetizados na GenePharma (Xangai, China). De acordo com o protocolo do fabricante, as células foram transfectadas com 2.500 ng de plasmídeo ou 100 pmol de siRNA com 6 µl de Reagente de Transfecção Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, EUA) por poço. Os níveis de expressão de RNA e proteína foram detectados 48 horas após a transfecção, e cada experiência foi repetida pelo menos três vezes. A PCR quantitativa em tempo real foi utilizada para validar a eficiência da superexpressão e knockdown do lncRNA Gm43360.

Análise de Western Blot

As células cultivadas foram lavadas com PBS gelado, foram adicionados 120 µl de tampão RIPA (Heart, China) e inibidor de protease e PMSF (Heart, China) foram adicionados durante 30 min em gelo. Após a coleta das células em diferentes tubos de microcentrífuga, a concentração proteica foi quantificada. O tampão de carga foi adicionado a cada amostra e depois fervido por 7 min. Trinta microgramas da amostra foram separados por SDS-PAGE a 12% (Beyotime, China) e eletrotransferidos para membranas de PVDF (Thermo Fisher, EUA). Em seguida, as membranas foram bloqueadas com leite 5%. As membranas foram incubadas com anticorpos primários específicos: anti-p21 (1:1000, Abcam, ab109199), anti-p53 (1:1000, Proteintech, 10442-1-AP) e anti-GAPDH (1:3000, Profintech , 60004-1-Ig) durante a noite a 4 graus. Após lavagem com TBST, as membranas foram incubadas com um anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente. Bandas proteicas foram observadas utilizando um kit de quimioluminescência (Millipore, EUA). A expressão de GAPDH foi utilizada para normalizar os níveis proteicos.

Ensaio de proliferação celular

A capacidade de proliferação celular foi determinada pelo ensaio do kit de contagem celular-8 (CCK-8). Quarenta e oito horas após a transfecção, 90 µl de novo meio e 10 µl de solução CCK-8 foram adicionados a cada poço (Beyotime, C0042). As células foram incubadas durante 1-4 h a 37 graus em 5% de CO2 e medidas a 450 nm por um leitor universal de microplacas (Bio-Tek, EUA).

Análise citométrica de fluxo

As células foram plaqueadas em placas de 6-poços no dia anterior à transfecção. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram tripsinizadas e centrifugadas a 1000 rpm durante 5 min. Em seguida, as células foram fixadas em etanol 70% a 4 graus por pelo menos 4 horas. Após centrifugação, adicionou-se às células uma solução corante de RNase A e iodeto de propídio (PI), e as células foram então incubadas durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. As células coradas com Te foram analisadas utilizando um ACEA NovoCyte (Biosciences, EUA).

Análise estatística

Os dados de medição pela distribuição normal são apresentados como média±DP. A diferença entre os dois grupos diferentes foi determinada usando testes t de Student não pareados bicaudais, e um valor p <{3}},05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os cálculos foram realizados utilizando o GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., EUA).

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