A AKT ativada por pré-condicionamento controla a tolerância neuronal à isquemia através da via MDM2–p53Ⅰ

Abstrato

Um dos mecanismos mais importantes da neuroproteção mediada pelo pré-condicionamento é a atenuação da apoptose celular, induzindo tolerância cerebral após subsequente isquemia lesiva. Nesse contexto, a via de sinalização antiapoptótica PI3K/AKT desempenha um papel fundamental na regulação da diferenciação e sobrevivência celular.

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Sabe-se que o AKT ativo aumenta a expressão de murino double minute-2 (MDM2), uma E3-ubiquitina ligase que desestabiliza p53 para promover a sobrevivência de células cancerígenas. Em neurônios, mostramos recentemente que a interação MDM2–p53 é potencializada pelo pré-condicionamento farmacológico, baseado na estimulação subtóxica do receptor de glutamato NMDA, que previne a apoptose neuronal induzida por isquemia.

No entanto, não se sabe se esse mecanismo contribui para a tolerância neuronal durante o pré-condicionamento isquêmico (PCI). Aqui, mostramos que a fosforilação de AKT mediada por PI3K induzida por IPC em Ser473, que por sua vez fosforilou MDM2 em Ser166. Essa fosforilação desencadeou a estabilização nuclear do MDM2, levando à desestabilização do p53, evitando assim a apoptose neuronal após um insulto isquêmico. A inibição da via PI3K/AKT com wortmannin ou por silenciamento de AKT induziu o acúmulo de MDM2 citosólico, anulando a neuroproteção induzida por IPC.

Assim, o IPC aumenta a ativação da via de sinalização PI3K/AKT e promove a tolerância neuronal ao controlar a interação MDM2-p53. Nossos achados fornecem uma nova via mecanística envolvida na neuroproteção induzida por IPC via modulação da sinalização AKT, sugerindo que AKT é um potencial alvo terapêutico contra lesão isquêmica. Palavras-chave: AKT; MDM2; p53; PI3K; tolerância isquêmica; pré-condicionamento

1. Introdução

Em humanos, a existência de ataque isquêmico transitório (AIT) foi revelada como um estado pré-condicionado endógeno com os benefícios de resultados funcionais em pacientes com AVC [1-3]. A neuroproteção endógena induzida por um estímulo isquêmico curto e subtóxico, conhecido como pré-condicionamento isquêmico (IPC), é considerada uma estratégia no campo emergente da neuroproteção contra lesões isquêmicas [4-6].

Evidências mostram que a neuroproteção promovida pelo IPC depende da transcrição, tradução e mecanismos pós-traducionais, o que altera a função de proteínas-chave após a isquemia [6-11]. No entanto, o mecanismo envolvido na tolerância isquêmica (IT) induzida por IPC não foi totalmente esclarecido no cérebro humano [12,13].

O desenvolvimento de novas abordagens experimentais para entender a neuroproteção mediada por IPC representa uma ferramenta poderosa para decifrar os mecanismos endógenos subjacentes à TI cerebral [6], que têm o potencial de revelar novos alvos terapêuticos destinados a minimizar os danos cerebrais em pacientes com AVC. Nas últimas duas décadas, a morte celular neuronal apoptótica posicionou-se como um mecanismo essencial envolvido na lesão isquêmica cerebral [14-16]. Nesse sentido, a proteína quinase B ou AKT, uma serina/treonina quinase que requer uma fosfoinositídeo quinase funcional (PI3K) para ser ativada, tem sido considerada um alvo essencial para terapias neuroprotetoras após isquemia [17,18].

Recentemente, demonstramos que a inibição da via de sinalização PI3K/AKT aumenta a suscetibilidade neuronal à excitotoxicidade [19]. A AKT está envolvida em uma complexa rede de sinalização anti-apoptótica [20], cujos componentes podem estar presentes em diferentes localizações subcelulares, dependendo do tipo de tecido [21,22]. No coração, o AKT está envolvido na cardioproteção promovida pelo pré-condicionamento [23].

Evidências também mostram que o AKT fosforilado promove a sobrevivência neuronal no início da isquemia cerebral [24]. Embora a ativação de AKT possa contribuir para a indução de IT no cérebro [25], o mecanismo exato envolvendo sua ativação mediada por IPC permanece indefinido. Em células tumorais, a ativação da via de sinalização PI3K/AKT leva à fosforilação de MDM2 em Ser166/186, que promove a translocação nuclear de MDM2 [26,27] e aumenta sua atividade de ubiquitinação [28].

No núcleo, o MDM2 se liga ao p53 e promove sua ubiquitinação e subsequente degradação proteassômica, o que inibe a função do p53 [29]. Sob condições de estresse, o p53 também pode desencadear a superexpressão de MDM2, que inversamente suprime a ativação do p53 em um ciclo de feedback negativo [30]. A inibição de PI3K impede a ativação de AKT [31] e a fosforilação de MDM2 no coração pré-condicionado [32].

Nesse contexto, descobrimos anteriormente que o pré-condicionamento cerebral in vivo reduziu o volume do infarto após a oclusão transitória da artéria cerebral média (tMCAO), aumentando a expressão do nível da proteína MDM2. Consequentemente, o complexo MDM2-p53 atenuou a ativação induzida por isquemia da via de sinalização p53/PUMA/caspase-3 em neurônios corticais primários [33].

Aqui, nos aprofundamos no papel da via de sinalização PI3K/AKT na tolerância neuronal mediada por IPC contra uma lesão isquêmica subsequente, bem como no mecanismo subjacente, e nos concentramos principalmente na ligação potencial entre a ativação de AKT e o complexo MDM2-p53 .

2. Resultados

2.1. Neuroproteção promovida por IPC

É mediado pela fosforilação de AKT em Ser473, fosforilação de MDM2 em Ser166 e desestabilização de p53 Descrevemos anteriormente o impacto da interação MDM2-p53 na suscetibilidade neuronal à isquemia [34] e IT [33]. Aqui, exploramos o papel potencial do AKT na neuroproteção mediada pelo IPC como candidato a estar envolvido na via MDM2-p53.

Primeiro, confirmamos que a isquemia promoveu a ativação de AKT em neurônios, conforme evidenciado pela fosforilação de AKT em Ser473. Conforme mostrado na Figura 1A, OGD curto (20 min) induziu significativamente a expressão de p(Ser473)AKT e MDM2, enquanto os níveis de proteína AKT permaneceram inalterados (Figura S1A). No entanto, a fosforilação de AKT não foi observada quando os neurônios foram submetidos a OGD prolongado (90 min). Além disso, os níveis de proteína MDM2 foram menores, o que é consistente com a maior expressão da proteína p53 conforme mostrado na Figura 1A.

A regulação positiva dependente do tempo da expressão de Mdm2 após OGD (Figura 1B) confirma que a isquemia subaguda pode ser importante para induzir mecanismos que impedem a estabilização do p53 após OGD, conforme descrito anteriormente [33]. Usamos OGD curto (20 min) seguido de 2 h de reoxigenação como modelo de IPC (Figura S1B) [33]; assim, analisamos extratos neuronais coletados em 4 h de reoxigenação após OGD (OGD/R) ou após OGD precedido pelo protocolo IPC (IPC mais OGD/R). Em paralelo, os neurônios foram incubados em configurações de normóxia (Nx) ou pré-condicionamento (IPC) (Figura S1B).

Conforme mostrado na Figura 1C e na Figura S1C, o IPC induziu a ativação precoce de AKT, conforme revelado pela fosforilação em Ser473 [35], seguida pela estabilização e fosforilação da proteína MDM2 em Ser166. O IPC também impediu a estabilização de p53 induzida por OGD/R (Figura 1C). Curiosamente, as imagens de imunofluorescência mostradas na Figura 1D revelaram que o IPC promoveu a fosforilação de AKT em Ser473 em neurônios, que se acumularam predominantemente no núcleo, e diminuiu a estabilização de p53 após OGD/R (IPC mais OGD/R) quando comparado com neurônios não pré-condicionados (OGD /R).

Consequentemente, o IPC impediu a apoptose neuronal e a ativação da caspase-3 causada por OGD/R, conforme medido por citometria de fluxo (Figura S1D) e ensaios de fluorimetria (Figura S1E), respectivamente. Para confirmar o papel da p53 na neuroproteção mediada por IPC, usamos neurônios que expressam (tipo selvagem; wt) ou não (knockout; ko) a proteína p53. Nossos resultados mostram que os neurônios sem p53 (Figura S1F) foram mais resistentes à apoptose induzida por OGD do que os neurônios p53 wt.

Além disso, os níveis de apoptose em neurônios p53KO foram semelhantes aos observados em neurônios wt pré-condicionados (IPC mais OGD/R) (Figura S1G), confirmando assim o papel fundamental da desestabilização de p53 na neuroproteção mediada por IPC [33]. Nossos resultados mostram que IPC induziu neuroproteção contra um insulto isquêmico através de um mecanismo que envolve fosforilação de AKT em Ser473, estabilização de MDM2 e fosforilação em Ser166 e desestabilização de p53.

2.2. O IPC desencadeia a fosforilação de MDM2 em Ser166 através da via PI3K/AKT

A via de sinalização PI3K/AKT está envolvida na IT neuronal tanto in vitro [36] quanto in vivo [37]. No entanto, o papel da ativação mediada por IPC da via PI3K/AKT na regulação do complexo MDM2-p53 permanece inexplorado. Para esclarecer isso, os neurônios foram incubados com o inibidor irreversível e específico da via PI3K/AKT, wortmannin [19].

Conforme mostrado na Figura 2A, a wortmanina anulou a fosforilação de AKT (Ser473) AKT intensificada por IPC e a desestabilização de p53, conforme mostrado na Figura 1D. Esses resultados sugerem uma ligação direta entre a ativação de AKT e a inibição da apoptose neuronal mediada por p53-(Figura S1D) e a ativação da caspase-3 (Figura S1E) induzida após OGD/R. O principal regulador da estabilização do p53, MDM2, é um alvo do AKT [26], que fosforila o MDM2 em Ser166 e Ser186 [26]. A inibição de PI3K com wortmanin impediu a fosforilação de (Ser473)AKT e (Ser166)MDM2 induzida por IPC (Figura 2B).

A fosforilação específica mediada por Akt de MDM2 em Ser166 induzida por IPC foi confirmada usando um pequeno RNA interferente (siRNA) projetado especificamente contra a proteína AKT1 (siAkt), altamente expressa em neurônios corticais, e cuja atividade é essencial para a sobrevivência neuronal após isquemia [ 38]. Conforme mostrado na Figura 3, siAkt reduziu os níveis totais de AKT e p(Ser473)AKT no dia 3 após a transfecção, tanto em células HEK-293T (Figura 3A) quanto em neurônios corticais (Figura 3B).

Além disso, o knockdown de AKT (siAkt) impediu a fosforilação de (Ser166)MDM2 (Figura 3B). Esses resultados demonstram que a via de sinalização de PI3K/AKT ativada por IPC promove a fosforilação de MDM2 em Ser166, o que pode ser responsável pela estabilização de MDM2 e consequente desestabilização de p53 após lesão isquêmica.

2.3. AKT ativada por IPC desencadeia a estabilização nuclear da proteína MDM2 após isquemia

A ativação de AKT tem sido envolvida na translocação nuclear de MDM2 em células tumorais [26]. Considerando a relevância da estabilização nuclear de MDM2 para a sobrevivência neuronal após isquemia [34] e, mais especificamente, seu papel neuroprotetor no IPC [33], decidimos investigar mais a fundo a relevância da via de sinalização PI3K/AKT na regulação da localização subcelular de MDM2 proteína.

Assim, neurônios ou células HEK-293T foram transfectadas com proteína humana marcada com MDM2-(MDM2-GFP). Manchas representativas de células HEK-293T transfectadas e imagens de neurônios que expressam ectopicamente a proteína MDM2 humana após quatro condições experimentais diferentes (Nx, IPC, OGD/R e IPC mais OGD/R) são mostrados na Figura 4A e na Figura S1H , respectivamente.

A expressão ectópica de MDM2- GFP confirmou que o IPC promove o acúmulo nuclear de MDM2 em comparação com neurônios isquêmicos (OGD/R) ou normóxicos (Nx) não pré-condicionados (Figura 4A, B), conforme revelado pela quantificação da proporção de fluorescência nuclear/citosólica (Figura S2B) e intensidade de fluorescência nuclear de MDM2-GFP (Figura S2C).

2.4. O IPC promove a interação p(Ser473)AKT e MDM2, o que aumenta a estabilização do MDM2 no núcleo e reduz a apoptose neuronal induzida na isquemia

Após a demonstração do papel da ativação intensificada por IPC da via PI3K/AKT na estabilização nuclear de MDM2, investigamos ainda mais se p(Ser473)AKT e MDM2 interagiram dentro do núcleo (Figura 6A). A imunoprecipitação de MDM2 a partir de extratos de proteínas nucleares, seguida de imunotransferência contra MDM2 e p(Ser473)AKT, revelou que o IPC promoveu a interação entre p(Ser473)AKT e MDM2, após OGD/R, evitando assim a estabilização nuclear p53 induzida por OGD/R, como mostrado na entrada do núcleo (Figura 6A).

Por fim, estudamos o efeito prejudicial da interrupção da via PI3K/AKT na apoptose neuronal (Figura 6B). A inibição de AKT neutralizou o efeito protetor de IPC antes de OGD, o que confirma o papel neuroprotetor de AKT-MDM2 no contexto de IT. Nossos resultados, portanto, demonstram que IPC induz fosforilação e ativação de AKT, que promove fosforilação de MDM2 em Ser166 e translocação nuclear, onde interage com p(Ser473)AKT. Esse mecanismo pode contribuir para a estabilização nuclear aprimorada do MDM2, que desempenha um papel essencial na tolerância isquêmica induzida pelo IPC.

Como Cistanche protege os neurônios?

Existem algumas evidências que sugerem que o Cistanche pode proteger os neurônios reduzindo a apoptose (morte celular programada) e promovendo a sobrevivência neuronal. A apoptose é um processo natural que ocorre no corpo para remover células danificadas ou indesejadas, mas pode ser prejudicial quando ocorre de forma excessiva ou inadequada. Descobriu-se que Cistanche inibe a apoptose em estudos de laboratório, e esse efeito pode ajudar a proteger os neurônios de danos.

Além disso, Cistanche contém vários compostos bioativos que demonstraram ter efeitos neuroprotetores. Por exemplo, contém equinacosídeo, que demonstrou proteger os neurônios do estresse oxidativo e da inflamação. Ele também contém acteoside, que tem propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes.

Continua...

Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1 , Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1 , Juan P. Bolaños 1,2,3,4, Angeles Almeida 1, 2,3 e Maria Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Instituto de Biologia Funcional e Genômica, Universidade de Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Espanha; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); irene_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Instituto de Investigação Biomédica de Salamanca, Hospital Universitário de Salamanca, Universidade de Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Espanha

3 Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade de Salamanca, 37007 Salamanca, Espanha 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Saúde Carlos III, 28029 Madrid, Espanha * Correspondência: mdesteban@usal.es ; Tel.: mais 34-923-29-4908