Análise Fitoquímica, Antiproliferativo In Vitro, Antioxidante Parte 2

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Ensaio inibidor de a-glicosidase

Uma série de diluições de frações foi feita, para produzir concentrações de 100,200,300.400 e 500mg/ml. As misturas reaccionais continham 0,1 ml de solução de 1 U/ml de -glucosidase misturada com 0,2 ml de uma diluição de extracto e 0,5 ml de tampão fosfato 100 mM, pH 6,8. As misturas foram incubadas a 37 graus durante 15 min. Em seguida, 0,2 ml de p-nitrofenil 5 mM-D-galactopiranosídeoO PNPG foi adicionado à mistura de reação e a incubação foi estendida por mais 20 min a 37 graus. A reação foi terminada pela adição de NazCO3 0,1 M. A absorbância foi registrada em um comprimento de onda de 405 nm para todas as amostras. Acarbose foi usada como controle positivo nas mesmas concentrações dos extratos vegetais. Os resultados foram expressos como porcentagem de inibição de acordo com a seguinte equação:

onde Ag é a absorbância sem um inibidor enzimático e As é a absorbância na presença do inibidor enzimático [26].

Linhas celulares e ensaio MTS

As linhas celulares de câncer HeLa e MCF7 foram obtidas da ATCC, as células foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10 por cento de soro fetal bovino, 1 por cento de antibióticos de penicilina/estreptomicina e 1 por cento de L-glutamina. As células foram cultivadas em uma atmosfera umidificada com 5 por cento de CO2 a 37 graus. As células foram semeadas a 2,6 × 10* células/poço em uma placa de 96-poço. Após 48h, as células estavam confluentes, o meio foi trocado. As células foram então incubadas com diferentes concentrações de frações foliares variando de 0,{15}} mg/ml de R. rothschildianus por 24h. A viabilidade celular foi avaliada

com o Ensaio de Proliferação de Células de Uma Solução Aquosa (MTS) de 96 graus CellTilter de acordo com as instruções do fabricante (Promega Corporation, Madison, WI). Resumidamente, no final do tratamento, 20 ul de solução MTS por 100 ul de meio foram adicionados a cada poço e incubados a 37 graus por 2h. As absorbâncias foram medidas a 490 nm [27,28].

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Análise estatística

Todos os resultados obtidos das quatro frações de plantas estudadas (antioxidante, anti-lipase,anti-amilase, anti-glicosidase, ecitotoxicidadeatividades) foram expressos em média±desvio padrão; o resultado foi considerado significativo quando o valor de p foi<0.05. data="" were="" compared="" using="" unpaired="">

Resultados

Triagem fitoquímica

Os resultados dos testes fitoquímicos preliminares nas frações aquosas de R. rothschildianus mostraram a presença de saponina, fenóis, proteína, amido e flavonóides. O extrato metanólico mostrou a presença de polissacarídeos complexos, fenóis, proteínas e flavonóides, enquanto fenóis, taninos e flavonóides foram observados na fração acetona e na fração hexânica foram identificados fenóis, taninos e flavonóides, glicosídeos, terpenóides e esteróides. como mostrado na Tabela 1. No entanto, para o processo de extração, o metanol apresentou o maior rendimento percentual em 29,4 por cento, seguido pela fração acetona em 16,5 por cento. A extração aquosa rendeu 10,6 por cento, enquanto o menor rendimento (7,3 por cento) foi na fração hexânica (Tabela 2).

Análise quantitativa de TPC, TFC e TTC Para a avaliação de TPC, TFC e TTC, foram obtidos os valores de absorção (Abs) de várias concentrações dos padrões de ácido gálico, ácido rutina e catequina (STDs), e em relação a esses pontos , três equações foram obtidas para cada DST versus suas concentrações para calcular os teores totais de fenol, flavonóide e tanino do hexano, acetona, metanol e R aquoso. As frações de diagnóstico de Rothschild são apresentadas na Tabela 3.

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Atividade antioxidante

Os resultados da avaliação da atividade de eliminação de radicais livres de quatro frações de folhas de R. rothschildianus, usando Trolox como uma referência padrão antioxidante potente, foram expressos como porcentagem de inibição de DPPH (Fig. 1 e Tabela 4). Portanto, as folhas de R. rothschildianus podem ser consideradas uma fonte fitoterápica para antioxidantes e para a fração acetona, que apresentou um valor de ICso de 6,3±0,4 ug/ml. Resultados semelhantes também foram obtidos para a fração hexano, que teve um valor de ICso de 7,9±1,3ug/ml (Tabela 4). Os resultados foram comparados ao Trolox, um potente composto antioxidante, também igual a 3,1±0,9 ug/ml. Por outro lado, a fração aquosa apresentou apenas atividade antioxidante moderada, com um valor de ICso maior de 19,9±0,7ug/ml, enquanto o extrato metanólico foi inativo neste ensaio.

Atividade de inibição de lipase

Neste ensaio, a atividade anti-obesidade de frações do extrato de folhas de R. rothschildianus foi comparada com a de

orlistat, um potente agente inibidor de lipase (Fig. 2 e Tabela 4).R. rothschildianus foram uma excelente fonte natural alternativa de agentes inibidores de lipase. A fração de acetona apresentou um valor de ICso de 26,3±0,6ug/ml, muito próximo ao do composto de referência orlistat （12,3±0,3ug/ml）. As frações de hexano e metanol registraram apenas valores moderados de ICso, iguais a 39,8±0,3ug/ml e 60,3±0,4ug/ml, respectivamente; enquanto a fração aquosa estava inativa.

Atividade de inibição de a-amilase

Neste ensaio, a atividade anti-amilase das frações do extrato de folhas de R. rothschildianus foi comparada com a da acarbose, um potente agente inibidor da a-amilase (Fig. 3). A fração acetona foi o inibidor mais potente da -amilase, com um ICso de 19.0±0,7ug/ml, comparado a 28,8±1,2 ug/ml para acarbose, o composto de referência. Isso sugeriu que R. rothschildianus pode ser um poderoso remédio herbal para diabetes. A fração aquosa mostrou apenas atividade moderada neste ensaio com um valor de ICso de 45,7±0,3 ug/ml, enquanto o hexano teve um valor de ICso de 354,8±1,2ug/ml. A fração de metanol foi inativa contra a enzima -amilase. também foram calculados valores para as quatro frações (Tabela 4).

Atividade de inibição de a-glicosidase

Os resultados para a-glicosidase foram comparados com os da acarbose, um forte agente inibidor enzimático, e também foram calculados os valores para as quatro frações (Tabela 4 e Fig. 4). A fração acetona exerceu a maior ação inibitória sobre a -glicosidase com um ICso de 54,9±0,3 ug/ml, comparado com o da acarbose, o composto de referência, em 37,1±{{10} },3 ug/ml. Em contraste, a fração do extrato metanólico apresentou apenas inibição moderada da -glicosidase, com um ICso de 251,2±0,4ug/ml, enquanto as frações hexânica e aquosa foram inativas neste ensaio.

Atividade antiproliferativa

Os resultados do tratamento de células cancerígenas HeLa e MCF7 com cinco concentrações diferentes em mg/ml para diferentes extratos mostraram que a atividade contra a linha celular de câncer HeLa foi melhor do que contra a linha celular de câncer MCF7. No entanto, o extrato hexânico foi o mais potente

extrato na concentração de 4mg/ml com porcentagens de inibição de 98,9 e 97,4 por cento contra as linhagens de células de câncer HeLa e MCF7, respectivamente, enquanto o extrato de metanol na mesma concentração mostrou atividade potente contra as linhagens de células de câncer HeLa e MCF7 com porcentagem de inibição de 97,2 e 95,6 por cento. A inibição percentual de células HeLa na exposição a frações de folhas de R. rothschildianus foi documentada, em comparação com o controle positivo doxorrubicina (Fig. 5a). A porcentagem de inibição de células MCF7 foi determinada de forma semelhante para as quatro frações de folhas de R. rothschildianus, em comparação com o controle (Fig. 5b).

Discussão

O ensaio de eliminação de radicais DPPH é bem conhecido como um método simples para detectar a capacidade antioxidante em compostos. O DPPH é um radical livre estável que confere uma cor púrpura em soluções alcoólicas e, quando reduzido na presença de antioxidantes doadores de hidrogênio, torna a solução incolor. Portanto, as folhas de R. rothschildianus podem ser consideradas uma fonte natural de antioxidantes, principalmente para a fração acetona, que apresentou valor de ICso de 6,3±0,4ug/ml. Resultados semelhantes também foram obtidos para a fração hexânica, que apresentou um valor de ICso de 7,9±1,3 ug/ml (Tabela 4). Os resultados foram comparados ao Trolox, um potente composto antioxidante, também igual a 3,1±0,9 ug/ml. Por outro lado, a fração aquosa apresentou apenas atividade antioxidante moderada, com um valor de ICso superior de 19,9±0,7 ug/ml, enquanto o extrato metanólico foi inativo neste ensaio. Esses resultados foram consistentes com a presença de fenóis e flavonóides na planta, uma poderosa fonte de eliminação de radicais livres, como mostrado com DPPH neste estudo. Esses resultados estavam de acordo com a diversidade de compostos fenólicos em plantas, fenóis simples como o ácido gálico e ácidos fenólicos mais sofisticados como antocianinas, derivados do ácido hidroxil cinâmico e flavonóides. Todas essas classes de compostos têm recebido muita atenção devido às suas múltiplas funções fisiológicas, especialmente seqüestradoras de radicais livres, atividades antimutagênicas, anti-inflamatórias e anticancerígenas [30]. Conforme listado na Tabela 3, o extrato acetona registrou o maior teor de compostos fenólicos e flavonóides, 28,2±0,8mg de GAE/ge 107,3±4,6mg de RU/g, respectivamente. Um relatório anterior sobre algumas espécies de Rumex encontrou compostos fenólicos em um extrato etanólico de folhas de Rumex vicario L., que possivelmente estavam envolvidos em reações de radicais livres, reduzindo o radical DPPH usado estável a um derivado de difenil picrilhidrazina de cor amarelada de seu violeta original cor [31].

R. rothschildianus leaves were an excellent alternative natural source of lipase inhibitory agents. The acetone fraction showed an ICso value of 26.3±0.6μg/ml, which was very close to that of the reference compound orlistat （12.3±0.3μg/ml）. Hexane and methanol fractions only re-corded moderate ICso values, equal to 39.8±0.3 μg/ml and 60.3±0.4μg/ml, respectively; while the aqueous fraction was inactive. Pancreatic lipase is a major enzyme involved in enterocyte triglyceride absorption. Therefore, its inhibition represents an important strategy in the management of obesity [32]. Plants rich in phenolic compounds have been screened in several reports for anti-lipase activity. Lipase inhibitory activity ranging from 40 to >70 por cento foi encontrado por testes in vitro em muitas famílias diferentes, incluindo Solanaceae (Solanum tuberosum), Brassicaceae (Brassica nigra e Raphanus sativus), Rosaceae (Malus Domestica Borkh. e Filipendula ulmaria (L.) Maxim.),

(Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. e Ericaceae Vaccinium myrtillus L.) e Fabaceae (Pisum sativum L. e Phaseolus vulgaris L.)[33].

A fração acetona foi o inibidor mais potente da -amilase, com um ICso de 19.0±0,7ug/ml, comparado a 28,8±1,2 ug/ml para acarbose, o composto de referência. Isso sugeriu que R. rothschildianus pode ser um poderoso remédio herbal para diabetes. A fração aquosa mostrou apenas atividade moderada neste ensaio com um valor de ICso de 45,7±0,3 ug/ml, enquanto o hexano teve um valor de ICso de 354,8±1,2 ug/ml. A fração de metanol foi inativa contra -amilase. Uma possível explicação para a fração aquosa ser um bom inibidor enzimático foi a presença de saponinas. Investigações científicas anteriores descobriram que as saponinas eram bioativas contra o diabetes [34]. O potente efeito da fração de extrato de acetona contra a amilase pode ser devido ao alto teor de compostos fenólicos e flavonóides. Especialistas em Corchorus olitorius -amilase e -glicosidase efeitos inibitórios devido aos constituintes, especialmente compostos fenólicos como o ácido cafeico [35].

A fração acetona exerceu a maior ação inibitória na a-glicosidase com um ICso de 54,9±0,3ug/ml, comparado com o da acarbose, o composto de referência, em 37,1±0,3ug/ml . Em contraste, a fração de extrato de metanol apresentou apenas inibição moderada da a-glicosidase, com um ICso de 251,2±0,4ug/ml, enquanto as frações hexânica e aquosa foram inativas neste ensaio. A terceira categoria de agentes hipoglicemiantes orais inclui inibidores de -glicosidase. Há uma variedade de inibidores de -glicosidase, como acarbose e voglibose, que geralmente são encontrados em fontes vegetais. Eles mostram uma valiosa estabilização dos níveis de glicose no sangue após uma refeição e têm sido usados ​​clinicamente no manejo do diabetes mellitus [36, 37].

Os resultados do tratamento de ambas as células cancerosas (HeLa e MCF7) com várias concentrações em mg/ml para diferentes extratos mostraram que a atividade geral contra a linhagem celular de câncer HeLa foi melhor do que a linha celular de câncer MCF7. O extrato de hexano mostrou potente atividade anticancerígena a uma concentração de 4mg/ml com porcentagens de inibição de 98,9 e 97,4 por cento contra as linhagens de células de câncer HeLa e MCF7, respectivamente, enquanto o extrato de metanol na mesma concentração mostrou atividade potente contra as linhagens de células de câncer HeLa e MCF7 com 97,2 e 95,6 por cento de percentagem de inibição. A partir dos resultados anteriores, a fração hexânica exerceu um efeito citotóxico significativo nas células HeLa e MCF7, com percentuais de inibição atingindo 99 e 92,4 por cento na concentração de 4mg/ml da fração hexânica, respectivamente. Isso foi consistente com os efeitos citotóxicos de terpenóides e esteróides, que foram encontrados na fração hexânica. Diosgenina, um esteróide e triterpenóide natural encontrado em algumas plantas, demonstrou inibir o câncer de mama [38, 39].

Conclusão

Os resultados deste estudo em folhas de R. rothschildianus indicaram que a fração de extrato de acetona tinha potencial significativo em fornecer fitoterapia para diabetes e obesidade, com base em sua potente inibição de lipase, a-amilase e a-glicosidase. Além disso, a fração de acetona também mostrou uma significativa atividade sequestrante de radicais livres. Por outro lado, a fração hexânica apresentou inibição significativa das linhagens celulares HeLa e MCF7, o que pode estar relacionado ao seu alto teor de terpenos e esteróides. Essas observações neste estudo podem levar a mais estudos in vivo para desenvolver novas formulações farmacêuticas naturais eficazes no tratamento da obesidade, diabetes mellitus e alguns tipos de câncer.

Este artigo é extraído de Jaradat et al. BMC Medicina Complementar e Terapias (2021) 21:107