Os glicosídeos de feniletanol da Herba Cistanche melhoram o microambiente do tumor hipóxico e aumentam os efeitos da oxaliplatina através da via de sinalização HIF-1

Contato: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

LIMEI WEN, JUNPING HU, JIAWEI ZHANG e JIANHUA YANG

Abstrato.

O câncer de fígado é um dos tipos mais comuns de tumor maligno e é caracterizado por alta malignidade, rápida progressão, alta morbidade e mortalidade. A oxaliplatina (OXA) foi relatada como tendo eficácia marcada contra o câncer de fígado avançado com toxicidade tolerável. Em tumores sólidos, o microambiente hipóxico promove a transição epitelial-mesenquimal (EMT), que também pode induzir resistência às drogas do câncer de fígado às drogas de platina. ErvaCistanche (Cistanche tubulosa) tem sido frequentemente usado na medicina tradicional chinesa e os glicosídeos feniletanoides da HerbaCistanche(CPhGs) são os principais componentes ativos. O presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos dos CPhGs na viabilidade, apoptose, migração e invasão de células cancerígenas do fígado. As células de câncer de fígado HepG2 foram divididas nos grupos controle, DMSO, CoCl2, OXA, OXA mais CoCl2 e CPhGs mais OXA mais CoCl2. Subsequentemente, a PCR quantitativa de transcrição reversa e análise de Western blot foram realizados para determinar os níveis de expressão de fator 1 induzível por hipóxia (HIF-1), lisil oxidase-like 2 (LOXL2) e genes e proteínas relacionados a EMT (ou seja, E ‑caderina e Twist), a fim de investigar os efeitos dos CPhGs no câncer de fígado. Os resultados demonstraram que os CPhGs podem aumentar os efeitos da OXA no câncer de fígado e inibir a migração, invasão e taxa de apoptose de células de câncer de fígado. Além disso, o tratamento com CPhGs induziu efetivamente a regulação negativa de HIF-1, LOXL2 e Twist, e regulação positiva de E-caderina. Os presentes achados indicaram que os CPhGs desencadearam um aumento significativo na sensibilidade à OXA e supressão da EMT induzida por hipóxia no fígado

benefício cistache: anti-Câncer de fígado

Introdução

Liver cancer is a malignant tumor that usually involves the digestive system, and consists of primary and secondary types. Primary liver cancer is divided into hepatocellular carcinoma and intrahepatic cholangiocarcinoma (1,2). Notably, liver cancer is associated with a high incidence and mortality rate worldwide (3). According to the World Health Organization, it is predicted that there will be >1,000,000 mortes relacionadas ao câncer de fígado até 2030, e dos casos recém-confirmados, aqueles na China continental serão responsáveis ​​por 46,6 por cento .

Foi relatado que a oxaliplatina (OXA) exerce efeitos inibitórios sobre o crescimento do câncer de fígado com toxicidade tolerável em ambientes clínicos. No entanto, a eficiência geral da terapia medicamentosa à base de platina é prejudicada pela resistência das células tumorais (4). É bem reconhecido que o câncer de fígado apresenta menor sensibilidade à quimioterapia em comparação com outros tipos de câncer. A multirresistência do câncer de fígado tem contribuído para sua resistência a inúmeros agentes terapêuticos (5). Em um estudo anterior, Xie e Zhong (6) relataram que as células HepG2 apresentavam baixa sensibilidade à adriamicina, 5-fluorouracil e cisplatina em condições de hipóxia. Apesar do fato de os agentes quimioterápicos à base de platina serem as principais opções de tratamento para o câncer, existe resistência a esses medicamentos entre os pacientes. Além disso, o prognóstico de pacientes com câncer de fígado permanece ruim (7,8). Até o momento, grandes esforços foram feitos para investigar a resistência aos medicamentos e melhorar a sensibilidade aos medicamentos em pacientes com câncer de fígado.

Em condições de hipóxia, ocorre revascularização nas células cancerígenas, o que pode levar à transição epitelial-mesenquimal (EMT) e mimetismo vascular (MV). EMT e VM podem subsequentemente promover invasão e metástase à distância. Além disso, especulou-se que a EMT desempenha um papel como força motriz para a progressão do câncer (9). Além disso, fatores induzíveis de hipóxia (HIFs) estão envolvidos na formação de neovasos, metabolismo energético, proliferação celular, invasão e metástase (10).

A proteína Lysil oxidase (LOX)-like 2 (LOXL2) é um membro da família LOX e está intimamente relacionada à reticulação covalente de colágeno e elastina, que pode resultar em fibrose e é crucial para a integridade da matriz extracelular. 11). Em um estudo anterior, LOXL2 foi considerado intimamente relacionado à metástase de células cancerígenas (12). Além disso, a LOXL2 demonstrou modular a patogênese e progressão de vários tipos de câncer maligno através de vias extra e intracelulares, que foram índices importantes para a avaliação de mau prognóstico (13,14).Herba Cistancheé uma erva tônica comumente distribuída em regiões desérticas, que tem sido frequentemente utilizada na medicina tradicional chinesa (15,16).Cistanche tubulosa(C. tubulosa)é um fitoterápico natural comumente plantado na Região Autônoma de Xinjiang. Os glicosídeos feniletanoides da Herba Cistanche (CPhGs) servem como um dos principais componentes ativos da Herba Cistanche. Anteriormente, Hu et al (17) indicaram que CPhGs poderiam atenuar a lesão hepática em camundongos portadores de tumor H22 e inibir o crescimento de células cancerígenas. Sugeriu-se que o mecanismo subjacente pode estar relacionado com uma redução da fetoproteína sérica e poderia aumentar a imunidade nos camundongos.

No presente estudo, um modelo hipóxico de células de câncer de fígado HepG2 foi induzido usando CoCl2. Com base nisso, o presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos da OXA na proliferação, apoptose, migração e invasão de células cancerosas na presença de CPhGs sob condições hipóxicas. Além disso, os níveis de expressão de mRNA e proteína de HIF-1, LOXL2, E-caderina e Twist foram detectados. Além disso, os mecanismos exatos subjacentes aos efeitos dos CPhGs na patogênese do câncer de fígado foram investigados.

o benefício do extrato de cistanche: tratamento do câncer de fígado

Materiais e métodos

Linha celular. A linhagem de células de câncer de fígado HepG2, identificada pelo método STR, foi fornecida pela Clinical Research Institution, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University (Urumqi, China). As células foram cultivadas em DMEM com alto teor de glicose (HyClone; Cytiva) contendo 10 por cento de soro fetal bovino (FBS; Hyclone; Cytiva) a 37°C em uma incubadora contendo 5 por cento de CO2.

Preparation of CPhGs. C. tubulosa extraction (CPhGs) was obtained from Hetian Dichen Biotech Co., Ltd.. The content of CPhGs was >80 por cento, entre os quais o teor de echinacoside e verbascose foi de 44,5 e 16,1 por cento, respectivamente. As hastes de C. tubulosa (Schrenk) Wight foram coletadas em outubro de 2016 em Xinjiang, China. A planta foi identificada pelo Dr. Junping Hu. Todos esses espécimes de comprovante (nº 201610) foram depositados no Plant Herbarium, School of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Xinjiang, China.

Design experimental. As células HepG2 (5x104/ml) foram tratadas com várias concentrações de CPhGs (5, 25, 50, 100, 200 e 500 µg/ml) por 48 h a 37˚C (24 h após a semeadura) para triagem da dose de CPhGs‑L/M/H. As células HepG2 (5x104/ml) foram divididas nos seguintes grupos: i) Grupo controle, cultivado em DMEM com alto teor de glicose; ii) grupo DMSO, cultivado em 0,1 por cento de DMSO (v/v); iii) grupo CoCl2 (grupo modelo de hipóxia), cultivado em DMEM isento de soro contendo 100 µM de CoCl2; iv) OXA

grupo (grupo controle positivo), cultivado em OXA 5 µM (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.); v) grupo OXA mais CoCl2, cultivado em OXA 5 µM combinado com CoCl2 100 µM; e vi) grupos CPhGs, tratados com CPhGs‑L/M/H (25, 50 e 100 µg/ml, respectivamente) combinados com 5 µM de OXA e 100 µM de CoCl2.

Ensaio de viabilidade celular. A viabilidade celular foi determinada usando um ensaio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) de acordo com as instruções do fabricante (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) e conforme descrito anteriormente (18). As células (2.0x103 células/poço) foram semeadas em placas de 96 poços. Subsequentemente, ~24 h após a semeadura, as células foram tratadas por 48 h de acordo com as condições de tratamento em cada grupo. O meio foi então substituído por 100 µl de DMEM com alto teor de glicose, seguido da adição de 10 µl de reagente CCK‑8; as células foram incubadas durante 1 h a 37°C. A densidade óptica foi medida usando um leitor de microplacas de detecção múltipla (Thermo Fisher Scientific, Inc.) a 450 nm. Seis réplicas foram preparadas para cada condição.

Determinação da taxa apoptótica. A taxa apoptótica foi determinada usando um Kit de Detecção Apoptótica Anexina V/PI (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.). As células HepG2 (5x105) foram inoculadas em placas de 6 poços a 37˚C em 5 por cento de CO2. Subsequentemente, ~24 h após o tratamento, as células foram cultivadas em DMEM sem soro por 4 h. As células foram então digeridas usando 0,25 por cento de tripsinização (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), seguido por pelo menos três lavagens com PBS pré-resfriado. Após centrifugação a 167,7 xg por 5 min a 4˚C, as células foram ressuspensas com tampão de ligação 1X e a concentração foi ajustada para 1~5x106/ml e, em seguida, corada com 5 µl de anexina V‑FITC e 5 µl de PI por 15 min à temperatura ambiente. As células foram então submetidas a citometria de fluxo usando um citômetro de fluxo BD LSRFortessa (BD Biosciences) e FlowJo

10.6.2 software (Tree Star, Inc.).

Ensaio de cicatrização de feridas. Os efeitos inibitórios de CPhGs na migração celular foram examinados por ensaio de cicatrização de feridas (19). As células foram semeadas em placas de 6 poços até obter uma monocamada confluente de 100 por cento. Subsequentemente, as células foram feridas usando uma ponta de pipeta de 200 µl, lavadas com PBS e incubadas com tratamentos em meio sem soro. Após o tratamento medicamentoso, a velocidade de cicatrização da ferida foi medida em 0, 12, 24 e 48 h, respectivamente. As imagens das feridas foram obtidas usando um microscópio fluorescente (Nikon Ti-S, Japão) sob uma ampliação de x10. O fechamento da ferida foi medido pela distância da ferida em cada período e expresso como porcentagem da distância inicial da ferida em 0 h.

Ensaios Transwell. A invasão celular foi avaliada por ensaios Transwell. As células (1x105 células/ml) foram suspensas em 200 µl de DMEM com alto teor de glicose sem FBS. As células foram então semeadas em poços superiores revestidos com Matrigel cobertos com uma membrana de filtro de polietileno tereftalato (tamanho do poro, 8,0 µm). Um total de 500 µl de DMEM com alto teor de glicose contendo 10 por cento de FBS foi colocado na câmara inferior. Cotonetes foram usados ​​para remover as células na superfície superior do filtro após 48 h a 37°C. As células que invadiram a membrana foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 30 min. Subsequentemente, as células foram coradas com cristal violeta a 0,1 por cento durante 15 min à temperatura ambiente. As células invasoras foram observadas sob um microscópio fluorescente (Nikon Ti-S) com uma ampliação de x100.

PCR quantitativa de transcrição reversa (RT-qPCR). O RNA total foi extraído das células HepG2 usando o reagente TRIzol® (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) e a síntese do cDNA foi realizada usando o kit de reagentes PrimeScript RT (Takara Bio, Inc.) de acordo com o protocolo do fabricante. A qPCR foi realizada em um sistema de PCR em tempo real 7500 (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) usando TB green™ Premix Ex Taq™ (Takara Bio, Inc.) de acordo com o protocolo do fabricante. Os primers usados ​​para qPCR estão listados na Tabela I. As condições de PCR consistiram em desnaturação a 95°C por 30 segundos, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95°C por 5 segundos e hibridização a 60°C por 30 segundos. Por fim, os resultados da amplificação foram analisados ​​pelo método 2‑ΔΔCq (20).

Análise de Western blot. As proteínas foram extraídas de células tratadas por 48 h por homogeneização em tampão de lise RIPA (Thermo Fisher Scientific, Inc.) contendo inibidores de protease e fosfatase. O teor de proteína celular foi determinado usando o método BCA. As proteínas (40 µg) foram então separadas por SDS-PAGE em um gel a 10% e transferidas para uma membrana de PVDF. A membrana foi bloqueada em 5% de leite desnatado por 1 h a 4˚C e incubada com os seguintes anticorpos primários: ‑actina (1:5,000; cat. no. bs‑0061R; BIOSS), HIF ‑1 (1:1,000; cat. n.º ab179483; Abcam), LOXL2 (1:500; cat. n.º ab179810; Abcam), E‑caderina (1:1,000 ; cat. n.º bs‑10009R; BIOSS) e Twist1 (1:500; cat. n.º bs‑2441R; BIOSS) durante a noite a 4˚C. A membrana foi então incubada com anticorpos secundários de cabra anti-coelho IgG H&L (1:2.000; cat. no. ab205718; Abcam) por 4 h à temperatura ambiente. Após lavagem com TBS-0,05 por cento Tween-20, os blots foram visualizados usando o sistema Enhanced Chemiluminescence (Amersham; Cytiva). A intensidade relativa das bandas foi semiquantificada por análise densitométrica usando o software ImageJ2x (versão 2.1.4.7; Rawak Software Inc.), e os gráficos densitométricos dos resultados foram normalizados para a intensidade de ‑actina.

Análise estatística. O software SPSS 19.0 (SPSS, Inc.) foi utilizado para análise dos dados. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão e foram analisados ​​por ANOVA one-way seguido do teste post hoc de Tukey. P<0.05 was="">considerado para indicar uma diferença estatisticamente significativa. Todos os experimentos foram executados pelo menos três vezes.

Resultados

Efeitos de CPhGs na viabilidade celular. As células HepG2 foram tratadas com várias concentrações de CPhGs (5, 25, 50, 100, 200 e 500 µg/ml) por 48 h (24 h após a semeadura). Conforme mostrado na Fig. 1, houve um declínio significativo na viabilidade das células tratadas com CPhGs 200 e 500 µg/ml em comparação com a do grupo controle (P<0.05). these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" could="" modulate="" cell="" viability="" in="" a="" dose‑dependent="">

CPhGs aumentam os efeitos da OXA no câncer de fígado. Os efeitos de CPhGs na viabilidade de células HepG2 moduladas por OXA foram posteriormente avaliados (Fig. 2). Após ~48 h, a combinação de CPhGs e OXA diminuiu significativamente a viabilidade das células HepG2 em comparação com a OXA plusgrupo CoCl2. Especificamente, CPhGs-M mais OXA mais CoCl2 e CPhGs-H mais OXA mais CoCl2 inibiram significativamente a viabilidade de células HepG2 em comparação com o grupo OXA mais CoCl2 (P<0.05 and=""><0.01,>

Os CPhGs inibem a migração e a invasão de células cancerígenas do fígado. Para estudar ainda mais o potencial invasivo e a capacidade migratória das células cancerígenas do fígado após o tratamento com CPhGs e OXA, foram realizados ensaios de cicatrização de feridas e Transwell. O ensaio de cicatrização de feridas indicou que, em comparação com o grupo DMSO, a migração de células HepG2 foi reduzida após o tratamento com CoCl2, OXA e CPhGs (200 ou 500 µg/ml) (P<0.05; fig.="" 3a="" and="" b).="" for="" the="" transwell="" assay,="" the="" invasive="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="" inhibited="" in="" the="" co-treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2)="" compared="" with="" that="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 3c="" and="" d).="" conversely,="" in="" the="" co‑treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2),="" the="" invasive="" potential="" and="" migratory="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="">

Efeitos de CPhGs e OXA na apoptose. Após o tratamento com a combinação de CPhGs e OXA para

48 h, as células HepG2 foram coradas com Anexina V‑FITC e PI, seguida de citometria de fluxo para determinar a apoptose celular. Conforme mostrado na Fig. 4A, os grupos de co-tratamento (CPhGs-L/M/H mais OXA mais CoCl2) exibiram uma elevação gradual na proporção de células apoptóticas com o aumento da concentração de CPhGs. A maioria das células tratadas com CPhGs e OXA estava localizada na região Q4, o que indicou que a combinação de CPhGs e OXA induziu apoptose no estágio inicial. Comparado com o grupo OXA mais CoCl2, uma elevação significativa na taxa de apoptose das células foi detectada nos grupos tratados com OXA, CoCl2 e doses moderadas ou altas de CPhGs (P<0.01; fig.="" 4b).="" these="" findings="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" oxa="" and="" cphgs="" may="" contribute="" to="" the="" apoptosis="" of="" hepg2="">

mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist following CPhGs and OXA co‑incubation. There were no statistical differences in the mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist between the control and DMSO groups (P>0.05; Fig. 5A-D). Por outro lado, CoCl2 induziu um aumento significativo nos níveis de expressão de mRNA de LOXL2, HIF-1 e Twist em comparação com os do DMSOgrupo (P<0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group,="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" loxl2,="" hif‑1α="" and="" twist="" were="" significantly="" enhanced="" in="" the="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups=""><0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" by="" contrast,="" cocl2="" induced="" a="" significant="" downregulation="" in="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" dmso="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" all="" concentrations="" of="" cphgs="" combined="" with="" oxa="" and="" cocl2="" were="" able="" to="" upregulate="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" these="" results="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" cphgs="" and="" oxa="" effectively="" inhibited="" the="" emt="" under="" hypoxic="">

Níveis de expressão proteica de HIF-1 , LOXL2, E-caderina e Twist após co-incubação de CPhGs e OXA. Os resultados do Western blotting revelaram que os níveis de expressão proteica de HIF-1, LOXL2 e Twist foram regulados positivamente sob condições hipóxicas em comparação com os do grupo DMSO. Por contraste,

os níveis de expressão proteica de E-caderina foram regulados negativamente sob condições hipóxicas (P<0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" notably,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" cphgs‑m="" +="" oxa="" +="" cocl2="" or="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" compared="" with="" dmso="" group,="" cocl2="" treatment="" significantly="" decreased="" the="" expression="" level="" of="" e‑cadherin.="" in="" the="" cphgs="" groups,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6b).="" these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" treatment="" could="" effectively="" inhibit="" the="" downregulation="" of="" e‑cadherin,="" and="" the="" upregulation="" of="" hif‑1α,="" loxl2="" and="" twist="" induced="" by="">

Discussão

A hipóxia é uma característica comum no microambiente do câncer; isso está principalmente associado ao fato de que a proliferação decélulas cancerosas é mais rápida em comparação com a formação vascular de neovasos aberrantes. Além disso, outros processos biológicos, incluindo proliferação, metástase e sensibilidade a drogas, são afetados pela hipóxia (21). O microambiente hipóxico do tumor é crucial para a patogênese e progressão do câncer, e também é importante na resistência às drogas e na vascularização do câncer de fígado (22).

No presente estudo, as células HepG2 foram tratadas com várias concentrações de CPhGs, entre as quais CPhGs (200 µg/ml) poderia induzir significativamente uma diminuição na viabilidade celular. Notavelmente, os CPhGs podem modular a viabilidade celular de maneira dose-dependente. Sob condições hipóxicas, a combinação de OXA e CPhGs (50 ou 100 µg/ml) inibiu significativamente a viabilidade de células HepG2 em comparação com o tratamento com OXA sozinho. Uma tendência dependente da dose semelhante foi observada nos ensaios de migração e invasão de células de câncer de fígado. Atualmente, extensos estudos têm sido conduzidos para investigar os papéis da apoptose das células cancerígenas na patogênese da doença hepática (23-26). Diversas estratégias têm sido desenvolvidas para o tratamento do câncer de fígado por meio da promoção da apoptose (27‑29); portanto, a interferência

A apoptose de células HepG2 pode servir como um candidato promissor para a prevenção e tratamento do câncer de fígado. A apoptose das células HepG2 foi significativamente aumentada após o tratamento com a combinação de CPhGs‑M/‑H e OXA em comparação com as células tratadas apenas com OXA. Portanto, foi indicado que os CPhGs poderiam aumentar significativamente os efeitos antitumorais da OXA.

HIF-1 pode regular os níveis de expressão de E-caderina, N-caderina e Vimentina, bem como alguns fatores de transcrição, como Snail1/2, Zeb1 e Twist1. Posteriormente, isso pode levar a uma perda de polaridade celular, afrouxamento das junções célula-célula, alterações na proteína do citoesqueleto e migração e invasão de células cancerígenas, o que poderia resultar na translocação de células cancerosas para o sistema circulatório através da membrana basilar. e metástase subsequente (30). No presente estudo, o CoCl2 foi utilizado para induzir um modelo de hipóxia, que desencadeou um aumento na viabilidade das células HepG2, bem como na migração e invasão celular. Além disso, os níveis de expressão de mRNA e proteína de HIF-1 foram significativamente aumentados, indicando que CoCl2 induziu a geração de um

microambiente hipóxico. O tratamento com a combinação de CPhGs e OXA inibiu acentuadamente os níveis de expressão de mRNA e proteína de HIF-1 induzidos por hipóxia. Esses achados sugeriram que os CPhGs poderiam atenuar o microambiente do câncer de fígado de maneira dose-dependente.

A E-caderina é uma molécula de adesão dependente de Ca2+, que tem um papel fundamental na adesão célula-célula, manutenção da integridade da estrutura tecidual e transmissão de sinalização. Em casos de downregulation ou mesmo perda da função de adesão, as células cancerosas podem apresentar proliferação e desdiferenciação descontroladas, o que pode promover aumento da invasão de células cancerosas e subsequente metástase (31). Além disso, a E‑caderina é crucial para inibir a EMT das células cancerígenas, que está intimamente associada à diferenciação, invasão, metástase e prognóstico de múltiplas malignidades epiteliais. Fatores de transcrição indutores de EMT (EMT-TFs), como Twist, Snail e Zeb, são cruciais para EMT. Foi relatado que a hipóxia ativa vias de sinalização que induzem a expressão de EMT-TF; notavelmente, poderia promover diretamente a EMT através da ativação transcricional desses fatores (32). A torção é uma hélice-anel-hélice altamente conservada

fator de transcrição que foi recentemente identificado nos últimos anos. A expressão de alta torção foi detectada em vários tipos de células cancerígenas (33). Portanto, é essencial investigar a associação entre a expressão de Twist e a migração ou metástase de células cancerígenas, bem como a prevenção clínica e o tratamento de metástases (34). No presente estudo, foi revelado que os níveis de expressão de mRNA e proteína de E‑caderina foram regulados negativamente na presença de hipóxia, enquanto os níveis de expressão de mRNA e proteína de Twist foram elevados. Esses achados foram consistentes com os resultados dos ensaios de invasão e migração, o que implica que a hipóxia pode contribuir para a ocorrência de EMT. Após o tratamento com OXA, os níveis de expressão proteica da E‑caderina foram regulados negativamente; isso indicou que OXA exibiu baixa eficiência na inibição do crescimento de células cancerígenas do fígado, enquanto poderia promover EMT. No entanto, em combinação com CPhGs, a sensibilidade das células HepG2 à OXA apresentou melhora acentuada na presença de hipóxia. Além disso, o co-tratamento com CPhGs e OXA pode inibir a viabilidade celular, migração e invasão de células HepG2. O presente estudo detectou apenas

Expressão de torção e E-caderina; portanto, estudos futuros visam focar em mais marcadores relacionados à EMT, a fim de avaliar o efeito inibitório de CPhGs na EMT induzida por hipóxia em câncer de fígado.

HIF-1 foi relatado para promover a expressão de LOXL2, e para aumentar a migração e invasão de células de câncer hepático, o que pode estar intimamente relacionado ao mau prognóstico do câncer de fígado (30). Em um estudo anterior, os níveis de expressão de LOXL2 em tecidos adjacentes de câncer de fígado foram acentuadamente aumentados em comparação com aqueles nos tecidos de câncer (35). Além disso, estava intimamente relacionado à invasão e metástase do câncer de fígado. O silenciamento do gene LOXL2 por pequeno RNA interferente inibiu a proliferação de células HepG2 e SMCC-7721, o que resultou na parada do ciclo celular de células cancerosas e aumento da apoptose (36). Shao et al (35) investigaram a correlação entre LOXL2 em amostras de câncer de fígado e fatores clínico-patológicos, MV e prognóstico entre 201 casos que receberam cirurgia para tratamento. Foi hipotetizado que LOXL2 desempenhou papéis importantes na patogênese e progressão do câncer de fígado, o que pode servir como alvo para o desenvolvimento de drogas. Além disso, Peng et al (37) demonstraram que LOXL2 poderia ativar as vias de sinalização Snail/E-caderina e Src quinase/Focal adesão quinase, o que pode contribuir para a patogênese e progressão da EMT de células de câncer gástrico. No presente estudo, sob condições hipóxicas, os níveis de expressão de mRNA e proteína de LOXL2 foram aumentados, enquanto sua expressão foi diminuída após o tratamento com OXA. Além disso, o tratamento com uma combinação de CPhGs e OXA resultou em uma redução óbvia da expressão de LOXL2, o que pode efetivamente auxiliar os efeitos antitumorais de OXA no câncer de fígado.

Existem algumas limitações para o presente estudo. O presente estudo deveria ter usado mais duas linhagens de células de câncer de fígado, incluindo a linhagem de células SMCC‑7721, mas elas não puderam ser usadas, pois não foi possível comprar essas linhagens de células porque foram identificadas erroneamente e derivadas de células HeLa. Além disso, o presente estudo não analisou os efeitos antioxidantes de diferentes concentrações de CPhGs nas células.

Em conclusão, os CPhGs podem alternar o microambiente hipóxico do tumor de células cancerígenas do fígado através da modulação da via de sinalização HIF-1. Além disso, a sensibilidade das células cancerígenas do fígado à OXA foi significativamente elevada em resposta ao tratamento com uma combinação de CPhGs e OXA. Esses achados podem fornecer uma nova estratégia de tratamento para melhorar a sensibilidade do câncer de fígado à quimioterapia.

Agradecimentos

Não aplicável.

Financiamento

O presente estudo foi apoiado pelo Laboratório Chave de Xinjiang de Componentes Ativos de Medicamentos Naturais e Tecnologia de Liberação de Medicamentos (concessão nº XJDX1713), o Projeto Reserva Candidato ao Líder de Inovação Científica e Tecnológica na Região Autônoma Uigur de Xinjiang (concessão nº 2019XS14), a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (concessão nº 81860735) e a Bethune Charitable

Fundação «Bethune·Quest‑construção de capacidade de investigação científica farmacêutica» (concessão n.º B‑19‑H‑20200622).

Disponibilidade de dados e materiais

Os conjuntos de dados usados ​​e/ou analisados ​​durante o estudo atual estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação razoável.

Contribuições dos autores

LMW e JWZ realizaram os experimentos, redigiram o manuscrito e confirmaram a autenticidade de todos os dados brutos. JPH e JHY desenharam o presente estudo. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

Aprovação ética e consentimento para participar

Não aplicável.

Consentimento do paciente para publicação

Não aplicável.

Interesses competitivos

Os autores declaram não ter interesses conflitantes.

Referências

1. Carcinoma hepatocelular. Nat Rev Dis Primers 2: 16019, 2016.

2. Gingold JA, Zhu D, Lee DF, Kaseb A e Chen J: Perfil genômico e homeostase metabólica em cânceres primários de fígado. Trends Mol Med 24: 395-411, 2018.

3. McGuire S: Relatório Mundial do Câncer 2014. Genebra, Suíça: Organização Mundial da Saúde, agência internacional para pesquisa sobre o câncer, WHO press, 2015. Adv Nutr 7: 418-419, 2016.

4. Gholamreza K, Jadidi‑Niaragh F, Jahromi AS, Zandi K e Hojjat‑Farsangi M: Mecanismos de resistência das células tumorais aos atuais agentes de terapia-alvo. Tumor Biol 37: 10021-10039, 2016.

5. Dong X e Mumper RJ: Estratégias nanomedicinais para o tratamento de tumores multirresistentes: Progresso atual. Nanomedicina (Londres) 5: 597-615, 2010.

6. Xie Y e Zhong DW: AEG-1 está associado à quimiorresistência do carcinoma hepatocelular induzido por hipóxia através da regulação da via PI3K/AKT/HIF-1alfa/MDR-1. EXCL J 15: 745-757, 2016.

7. Xiong H, Ni Z, He J, Jiang S, Li X, He J, Gong W, Zheng L, Chen S, Li B, et al: LncRNA HULC desencadeia a autofagia através da estabilização de Sirt1 e atenua a quimiossensibilidade das células HCC. Oncogene 36: 3528-3540, 2017.

8. Gade TPF, Tucker E, Nakazawa MS, Hunt SJ, Wong W, Krock B, Weber CN, Nadolski GJ, Clark TWI, Soulen MC, et al: Isquemia induz quiescência e dependência de autofagia no carcinoma hepatocelular. Radiologia 283: 702-710, 2017.

9. Siegel RL, Miller KD e Jemal A: Estatísticas do câncer, 2017. CA Cancer J Clin 67: 7-30, 2017.

10. Dong LQ, Shen BQ e Ma Y: Progresso da pesquisa do microambiente de hipóxia no carcinoma hepatocelular. Zhong Guo Pu Wai Ji Chu Yu Lin Chuang Za Zhi 25: 1254-1258, 2018 (em chinês).

11. Moon HJ, Finney J, Ronnebaum T e Mure M: Human lysyl oxidase-like 2. Bioorg Chem 57: 231-241, 2014.

12. Ferreira S, Saraiva N, Rijo P e Fernandes AS: Inibidores de LOXL2 e progressão do câncer de mama. Antioxidantes (Basileia) 10: 312, 2021.

13. Philp CJ, Siebeke I, Clements D, Miller S, Habgood A, John AE, Navaratnam V, Hubbard RB, Jenkins G e Johnson SR: A reticulação da matriz extracelular aumenta o crescimento de fibroblastos e protege contra a proteólise da matriz na fibrose pulmonar. Am J Respir Cell Mol Biol 58: 594-603, 2018.

14. Galván JA, Zlobec I, Wartenberg M, Lugli A, Gloor B, Perren A e Karamitopoulou E: A expressão de repressores de E-caderina SNAIL, ZEB1 e ZEB2 por células tumorais e estromais influencia o fenótipo de brotamento tumoral e sugere heterogeneidade do estroma células no câncer de pâncreas. Br J Câncer 112: 1944-1950, 2015.

15. Gu C, Yang X e Huang L: Cistanches herba: Uma revisão de neurofarmacologia. Front Pharmacol 7: 289, 2016.

16. Fu Z, Fan X, Wang X e Gao X: Cistanches Herba: Uma visão geral de sua propriedade química, farmacológica e farmacocinética. J Etnofarmacol 219: 233-247, 2018.

17. Hu Q, You SP, Liu T, Wang B, Liu X e Jiang Y: Uma investigação sobre o efeito do cistanche contra o câncer de fígado. Carcinog Teratog Mutagen 30: 194-199, 2018.

18. Mao J, Tian Y, Wang C, Jiang K, Li R, Yao Y, Zhang R, Sun D, ​​Liang R, Gao Z, et al: CBX2 regula a proliferação e a apoptose através da fosforilação de YAP no carcinoma hepatocelular. J Câncer 10: 2706-2719, 2019.

19. Qin Y, Liu HJ, Li M, Zhai DH, Tang YH, Yang L, Qiao KL, Yang JH, Zhong WL, Zhang Q, et al: Salidroside melhora o microambiente do tumor hipóxico e reverte a resistência aos medicamentos de platina via Via de sinalização HIF-1. EBioMedicine 38: 25-36, 2018.

20. Livak KJ e Schmittgen TD: Análise de dados de expressão gênica relativa usando PCR quantitativo em tempo real e o método 2(‑Delta Delta C(T)). Métodos 25: 402-408, 2001.

21. Vaupel P: Fisiologia microambiental tumoral e suas implicações para a oncologia de radiação. Semin Radiat Oncol 14: 198-206, 2004.

22. Chen C e Lou T: Fatores induzíveis por hipóxia no carcinoma hepatocelular. Oncotarget 8: 46691-46703, 2017.

23. Schwabe RF e Luedde T: Apoptose e necroptose no fígado: uma questão de vida ou morte. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 15: 738-752, 2018.

24. Kanda T, Matsuoka S, Yamazaki M, Shibata T, Nirei K, Takahashi H, Kaneko T, Fujisawa M, Higuchi T, Nakamura H, et al: Apoptose e doenças hepáticas gordurosas não alcoólicas. World J Gastroenterol 24: 2661-2672, 2018.

25. Pittala S, Kremlin Y e Shoshan‑Barmatz V: Visando o câncer de fígado e patologias associadas em camundongos com um peptídeo mitocondrial baseado em VDAC1. Neoplasia 20: 594-609, 2018.

26. Jing ZT, Liu W, Xue CR, Wu SX, Chen WN, Lin XJ e Lin X: o ativador de AKT SC79 protege os hepatócitos da apoptose mediada por TNF e alivia a lesão hepática induzida por d-Gal/LPS. Am J Physiol Gastrointest Fígado Physiol 316: G387-G396, 2019.