Parte 1: Geraniol melhora a lesão renal mediada por doxorrubicina através da alteração do status antioxidante, inflamação e apoptose: papéis potenciais de NF-kB e Nrf2/Ho-1

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Abstrato: Mediado por doxorrubicinainsuficiência renalé um problema sério no tratamento do câncer. Assim, este trabalho investigou a capacidade do geraniol de modular a doxorrubicina induzidadanos nos rinsusando um modelo de rato. Os ratos foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos: controle, doxorrubicina (20 mg/kg, intraperitoneal, ip), doxorrubicina mais 100 mg/kg de geraniol e doxorrubicina mais 200 mg/kg de geraniol. Uma única injeção de doxorrubicina desencadeou insuficiência renal, como evidenciado pelos valores alterados de creatinina sérica, nitrogênio ureico no sangue e valores de albumina; também causou alterações histológicas na arquitetura do rim. Além disso, a doxorrubicina aumentou a peroxidação lipídica enquanto reduz a glutationa reduzida, a atividade da catalase e a expressão da glutationa peroxidase e superóxido dismutase. Curiosamente, o pré-tratamento com geraniol resgatou alterações induzidas por doxorrubicina nos parâmetros antioxidantes renais, atividade enzimática e expressão de genes e proteínas inflamatórios e mediadores de apoptose. Além disso, o tratamento profilático com geraniol preservou a maioria das características histológicas renais de maneira dose-dependente. Essas descobertas suportam que o geraniol pode proteger contra doenças mediadas por doxorrubicina.disfunção renal. No entanto, mais pesquisas são necessárias para esclarecer os mecanismos dos efeitos protetores do geraniol contra a disfunção renal mediada pela doxorrubicina.

Palavras-chave: doxorrubicina; inflamação; estresse oxidativo; apoptose; lesão renal; geraniol

1. Introdução

Desde a sua descoberta, o medicamento antraciclina doxorrubicina (Dox) tem sido amplamente utilizado contra tumores sólidos e malignidades hematológicas. Entre seus efeitos colaterais mais comuns está a nefrotoxicidade, descrita como disfunção renal com redução da filtração, reabsorção e excreção, que está associada a um risco significativo de morbidade e mortalidade. Cerca de 60% dos pacientes com câncer que recebem quimioterapia desenvolvem nefrotoxicidade, restringindo a eficácia terapêutica da Dox[5,6]. Embora os processos fundamentais que causam nefrotoxicidade mediada por Dox permaneçam desconhecidos, a literatura sugere que os prováveis ​​contribuintes incluemestresse oxidativo, inflamação, eapoptose. Em particular, as evidências indicam que a redução associada à Doxestresse oxidativo, inflamação, e eventos apoptóticos podem ajudar a reduzir a toxicidade renal da droga.

O fator nuclear (derivado de eritróide 2)-like 2 (Nrf2) é um fator de transcrição sensível a redox com habilidades antioxidantes, anti-inflamatórias e citoprotetoras que sustentam os sistemas de defesa celular. No estresse oxidativo, o Nrf2 libera sua proteína inibidora citoplasmática, que entra no núcleo e ativa vários genes envolvidos na defesa antioxidante, como heme oxigenase-1(Ho-1), glutationa peroxidase (GPx), catalase( CAT) e superóxido dismutase (SOD) [14-19]. O tratamento com Dox demonstrou reduzir tanto a expressão de mRNA quanto de proteína de Nrf2 e, portanto, de genes e proteínas antioxidantes a jusante, levando à toxicidade renal.

O fator nuclear-kB (NF-kB) é um fator de transcrição que regula a expressão de muitos genes inflamatórios; como figura central da via NF-kB, que é ativada por espécies reativas de oxigênio (ROS), pode desencadear uma resposta inflamatória e conseqüente lesão tecidual [8,22,23]. Numerosos estudos relataram que a Dox causa inflamação e aumenta a produção de citocinas pró-inflamatórias, como interleucina-6(IL-6), interleucina-1 beta (L-1), e fator de necrose tumoral alfa (TNF-)[11,13]. Além disso, o aumento da produção de ROS após lesão renal mediada por Dox demonstrou desempenhar um papel fundamental na ativação da via apoptótica intrínseca através da instabilidade mitocondrial. Os principais determinantes desta via são as proteínas associadas às mitocôndrias Bax e Bcl-2; uma proporção equilibrada de Bcl-2 para Bax previne a apoptose, enquanto o desequilíbrio leva ao aumento da permeabilidade da membrana e vazamento de citocromo c para o citosol, que ativa caspase-9(Casp-9) e caspase{ {21}} (Casp-3). Tal ativação geralmente leva à fragmentação do DNA e morte celular.

É de grande interesse maximizar o uso clínico de quimioterápicos, minimizando seus efeitos negativos. Assim, esforços de pesquisa foram realizados para investigar o uso de vários agentes em conjunto com Dox para melhorar seus efeitos adversos [13,30,31]. Extratos de ervas e seus ingredientes bioativos são reconhecidos há muito tempo por sua capacidade de reduzir a toxicidade mediada por drogas. Geraniol é um álcool monoterpeno acíclico encontrado em quase todos os óleos essenciais, como os de gengibre, rosa, laranja, lavanda e limão [32,33]. Numerosos estudos relataram que o geraniol possui várias propriedades benéficas, como antiúlcera, anticancerígena [35], antidepressiva [36], anti-inflamatória [33] e, além disso, pode aliviar a nefropatia diabética [37] .

Até onde sabemos, atualmente não há informações específicas sobre os efeitos preventivos do geraniol contra a nefrotoxicidade mediada por Dox. Assim, estudamos os efeitos e prováveis ​​mecanismos da ação do geraniol na lesão causada pela Dox através das vias de sinalização NF-kB e Nrf2/Ho-1 nos rins de ratos Wistar.

2. Materiais e Métodos

2.1. Animais

Ratos Wistar machos foram adquiridos no centro de cuidados com animais da King Saud University (KSU) em Riad, Arábia Saudita. Os animais foram mantidos em condições controladas, como foram mantidos em temperatura ambiente (25 ± 1 grau) com um ciclo claro/escuro de 12 h e tiveram acesso irrestrito à água e uma dieta padrão, conforme autorizado pelo Comitê de Ética em Estudos Institucionais da KSU. (REC) sob o número de autorização KSU-SE-19-122.

2.2. Design experimental

Esta investigação examinou um total de 32 ratos machos Wistar pesando 190-210 g, distribuídos em quatro grupos. Os ratos receberam uma semana para se adaptarem ao ambiente antes do estudo. O grupo veículo, também conhecido como grupo controle, foi composto por ratos que receberam uma formulação oral de solução salina normal. O Grupo II consistiu em ratos que receberam Dox (20 mg/kg ip dose única) no dia 17 [11]. Ratos dos grupos ⅢI e IV receberam doses profiláticas de geraniol (oralmente) a 100 e 200 mg/kg, respectivamente, por 18 dias, e no dia 17 foram, igualmente, submetidos a Dox (20 mg/kg, ip). No dia 18, os ratos foram eutanasiados usando uma combinação de cetamina/xilazina em ambiente controlado. O sangue foi coletado e o soro isolado, e ambos os rins foram removidos e imediatamente congelados em nitrogênio líquido. Ensaios bioquímicos, de expressão gênica e proteica foram realizados nos tecidos congelados. Para o exame histológico, as amostras de tecido renal foram lavadas em PBS e depois preservadas em solução de formaldeído a 4 por cento. Ao longo da investigação, não houve indicação de sofrimento ou morte em um animal experimental.

2.3. Determinação dos marcadores da função renal

Para isolar o soro do sangue coletado no momento do sacrifício, as amostras de sangue foram centrifugadas por 10 min a 2000×g em uma centrífuga pré-resfriada. O soro obtido foi então analisado para quantificar albumina, nitrogênio ureico no sangue (BUN) e creatinina. Valores defunção renalos marcadores foram calculados usando o Siemens Autoanalyzer Dimension RXL MAXTM, Siemens, Washington, DC, EUA.

2.4.Eoaluação da Peroxidação Lipídica

A peroxidação lipídica foi avaliada em tecidos renais como descrito anteriormente por Ohkawa et al., com pequenas modificações.

2.5. Quantificação de Glutationa Reduzida

Os níveis de glutationa reduzida (GSH) no sobrenadante pós-mitocondrial renal (SPM) foram medidos de acordo com o método descrito por Sedlak e Lindsay, com pequenas modificações.

2.6. Quantificação da Atividade da Catalase

A atividade da CAT na SPM renal foi determinada de acordo com o método descrito por Claiborne, com pequenas modificações.

2.7. Análise de expressão gênica (RT-qPCR)

O reagente TRIzolTM (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) foi utilizado para extrair o RNA total dos tecidos renais de acordo com as orientações do fabricante. A pureza e a quantidade de amostras de RNA extraídas foram determinadas usando um espectrofotômetro NanoDropTM 8000 (Thermo Scientific, EUA). O RNA isolado foi então transcrito reverso em cDNA usando cDNA Synthesis SuperMix (Bimake, Houston, TX, EUA), e a expressão gênica foi quantificada com SYBR Green Master Mix (Bimake, Houston, TX, EUA) no Applied Biosystems 7500 Fast Real- Sistema de PCR de tempo. A abordagem AACt foi então usada para determinar a expressão relativa de vários genes entre os grupos, com GAPDH empregado como o gene de manutenção. A Tabela 1 lista as sequências de primers utilizadas neste estudo (IDT, Leuven, Bélgica).

2.8. Análise de Immunoblot

A análise de Western blot foi realizada como descrito por Alasmari et al. [41]. Resumidamente, proteínas isoladas (30-50 ug) foram submetidas a eletroforese em géis de SDS-PAGE e depois transferidas para membranas de PVDF. Após o bloqueio com 5 por cento de leite em pó desnatado por 60 min, os blots foram sondados durante a noite a 4 graus com anticorpos primários seletivos (contra Ho-1, Nrf2, TNF-, I6, NF-kB-p65, caspase clivada{{ 14}}, Bcl-2, Bax e GAPDH, diluição 1:1000). As membranas foram subsequentemente lavadas e depois incubadas durante 60 min à temperatura ambiente com anticorpos secundários conjugados com HRP adequados (diluição: 1:5000). O kit de reagentes ECL e o equipamento de imagem em gel (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) foram usados ​​para detectar a presença de proteínas na membrana.

2.9. Estudos de Histopatologia

Os tecidos renais foram pós-fixados em formaldeído a 4% e, em seguida, processados ​​para seccionamento e coloração em parafina. Um micrótomo foi usado para cortar seções de parafina com uma espessura de 3 μm. As seções cortadas foram então tratadas para remover a cera e coradas com corante hematoxilina mais eosina (H&E) para exame histopatológico. As imagens de histologia renal foram adquiridas usando uma câmera DP72 acoplada a um microscópio Olympus BX.

2.10. Análise de Dados

Os dados foram analisados ​​com o programa computacional Graph Pad Prism 5 (San Diego, CA, EUA), e os resultados são apresentados como média e desvio padrão (média± DP). As diferenças entre os grupos foram avaliadas usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparação de Tukey, com um valor de p menor que 0,05 indicando significância estatística (p<>