Parte Ⅰ Os efeitos dos níveis de proteína e fibra na dieta sobre o desempenho do crescimento, ocorrência de gota, comunidades microbianas intestinais e imunorregulação no eixo do rim de gansos

Abstrato

O presente estudo avaliou os efeitos dos níveis de proteína e fibra dietética no desempenho do crescimento, ocorrência de gota, comunidades microbianas intestinais e imunorregulação no eixo intestino-rim de gansos. Foi adotado um desenho fatorial 2 £ 3 inteiramente casualizado com 2 níveis de PB (180 [18CP] e 220 [22CP] g/kg) e 3 níveis de fibra bruta (CF) (30 [baixo CF], 50 [meio-CF], e 70 [alto CF] g/kg). As dietas com alto teor de PB ou baixo teor de CF predispuseram os gansinhos à gota. As dietas ricas em proteínas pioraram a função renal; as concentrações séricas de UA e Cr, bem como a atividade de XOD em gansinhos de 9-um dia alimentados com dietas de 22 por cento de PB foram significativamente aumentadas. Embora os níveis de CF de 3 a 7 por cento não afetem diretamente a saúde renal, aumentar os níveis de CF pode acelerar o aumento de probióticos no ceco de gansos e reter bactérias maléficas, aliviando a disbiose intestinal causada por dietas ricas em proteínas. Uma análise da microbiota cecal por meio do sequenciamento do RNA 16Sr revelou que a abundância de Enterococcus no grupo 22CP foi maior do que no grupo 18CP, mas diminuiu com o aumento dos níveis de FC no dia 9. A abundância de Lactobacillus aumentou com o aumento dos níveis de CF. Além disso, maiores concentrações séricas de LPS e citocinas pró-inflamatórias e níveis de expressão de mRNA regulados positivamente nos tecidos cecal, amígdala e renal indicaram que dietas ricas em proteínas podem ativar a via TLR4/MyD88/NFkB e induzir inflamação intestinal e renal em gansos jovens. Verificou-se que as concentrações séricas de LPS no dia 9 diminuíram com o aumento da CF, embora a alteração dos níveis dietéticos de CF não afetasse diretamente os índices imunológicos séricos dos gansos. Em conclusão, a dieta rica em PB exerceu um efeito negativo sobre a ocorrência de gota, comunidades microbianas e imunorregulação no eixo intestino-rim de gansinhos, enquanto o aumento adequado dos níveis de fibra dietética ajudou a manter o equilíbrio intestinal e reduziu a concentração sérica de LPS. Propomos uma dieta de 18 por cento de PB combinada com 5 por cento de FC como a combinação ideal para alimentação de gosling.

Palavras-chave

fibra bruta, proteína, gota de ganso, comunidades microbianas intestinais, eixo intestino-rim,Benefícios do Cistanche.

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Introdução

Os gansos, que são herbívoros, dependem da fibra dietética para realizar suas atividades normais. Níveis moderados de fibra bruta (CF) nas dietas são conhecidos por aumentar a resistência a doenças e promover o crescimento em aves modulando o equilíbrio microecológico intestinal e melhorando as funções imunológicas (Jha e Mishra, 2021) Wils-Plotz et al. (2013). relataram que a inclusão de pectina na dieta aumentou a expressão de IL- 12 na mucosa ileal e aumentou a produção de interferon-g nas amígdalas cecais. Vários estudos indicaram que uma dieta com baixo teor de CF reduz a diversidade microbiana, bem como a abundância relativa da microbiota benéfica em gansos ceca no dia 70, afetando negativamente o desempenho do crescimento, a utilização de nutrientes e a imunidade da mucosa intestinal desses gansos (Li et al., 2017; Li et al., 2018a). O CF dietético pode ajudar a manter a função da barreira intestinal, fortalecendo a estrutura e a função da mucosa, bem como aumentando a população e a diversidade de bactérias comensais no trato gastrointestinal. Mais importante, as aves jovens são supostamente mais sensíveis a mudanças nos nutrientes da dieta e nas comunidades microbianas intestinais do que os adultos (Gao et al., 2017). No entanto, estudos sobre o efeito dos níveis dietéticos de CF na microbiota intestinal e resistência a doenças em gansinhos são escassos.

O desempenho de crescimento em aves é menos sensível a mudanças nos níveis de proteína do que a mudanças na energia da dieta na ração para satisfazer sua natureza volitiva original (Shi et al., 2006). Foi relatado que nenhuma diferença significativa no ganho de peso foi observada em gansos com níveis de proteína na dieta variando de 16 a 22 por cento, o que parece excessivamente geral em escopo (Summers et al., 1986). Por outro lado, as concentrações de proteína dietética exercem um forte efeito no equilíbrio da flora intestinal e na resistência a doenças em aves (Lee et al., 2020). A gota visceral, que ocorre principalmente em aves, é uma doença metabólica causada pelo comprometimento da função renal, seguida de acúmulo de cristais de urato em vários órgãos (Zhang et al., 2018). Um estudo anterior nosso demonstrou que dietas ricas em proteínas foram implicadas em lesão renal e disbiose da microbiota intestinal associada à gota em gansos (Xi et al., 2020a). Os resultados deste estudo mostraram que, em comparação com gansinhos alimentados com dietas de 16 e 18 por cento de proteína bruta (PB), os gansinhos alimentados com dietas de 22 por cento de PB sofreram lesão das células epiteliais intestinais e disbiose da microbiota cecal, levando a lesões renais ou mesmo gota de ganso. A microbiota do trato gastrointestinal e seus metabólitos parecem desempenhar um papel central no fortalecimento da imunidade do eixo intestino-rim em aves (De Cesare et al., 2019; Xi et al., 2020b). Assim, identificar um programa nutricional adequado, que se concentre nos efeitos dos níveis dietéticos de CF e PB, pode ajudar a minimizar a incidência de gota e aumentar a imunidade, mantendo o equilíbrio microecológico intestinal e melhorando a regulação imune relativa em gansos.

O microbioma intestinal exerce um efeito profundo na regulação imune intestinal, que afeta a imunidade sistêmica e contribui para o equilíbrio imunológico. Mudanças na composição da dieta, incluindo os níveis de PB e CF, afetam a composição e as atividades metabólicas da microbiota que se adapta ao ambiente intestinal (Liu et al., 2014). Em aves, qualquer interrupção do microbioma pode induzir um desequilíbrio na imunidade sistêmica, contribuindo para a diminuição da resistência a doenças. Em um estudo anterior nosso, descobrimos que a disbiose da microbiota intestinal aumentou o risco de gota visceral em gansinhos, aumentando a inflamação, bem como a translocação de lipopolissacarídeo (LPS) derivado do intestino no eixo intestino-rim. Nessa cascata complexa, a ligação do LPS ativa o fator nuclear, potencializador da cadeia leve kappa da via das células B ativadas (NF-kB) e a produção de citocinas pró-inflamatórias, como a interleucina 1b (IL1b) e o fator de necrose tumoral a (TNFa), promovendo assim o desenvolvimento de tolerância imunológica tanto no intestino quanto no rim de gansos (Xi et al., 2019). O presente estudo se concentrou na investigação das comunidades microbianas que habitam o ceco de gansinhos alimentados com diferentes níveis de PB e FC na dieta e mediu as mudanças na ocorrência de gota analisando a imunorregulação e as respostas inflamatórias induzidas no eixo intestino-rim.

Cistanche Padronizado

Materiais e métodos

1. Aprovação Ética

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa da Academia de Ciências Agrícolas de Jiangsu e conduzido de acordo com os Regulamentos da Administração de Assuntos Relativos a Animais Experimentais (Ordem nº 63 da Academia de Ciências Agrícolas de Jiangsu em 8 de julho de 2014). Todos os experimentos foram conduzidos pelas diretrizes ARRIVE (Pesquisa Animal: Relato de Experimentos In Vivo).

2. Desenho Experimental

Este estudo foi conduzido de 2 a 17 de novembro de 2020, no Experimental Animal Center da Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China). Um total de 1,620 gansos Taizhou de um dia (Anser domestica, 100 percent ,), fornecidos pela Tianzhijiao Breeding Geese Limited Company (Chuzhou, China), foram distribuídos aleatoriamente para 6 grupos experimentais. Cada tratamento teve 6 repetições, e cada repetição continha 45 aves. Um delineamento fatorial 2 £ 3 inteiramente casualizado foi usado para o experimento. Seis dietas com 2 níveis de PB e três níveis de CF foram preparadas (Tabela 1). Os 2 níveis de CP foram 180 (18CP) e 220 (22CP) g/kg e os três níveis de CF foram 30 (baixo CF), 50 (mid-CF) e 70 (alto CF) g/kg. Todos os gansinhos foram criados em um galpão termostático com gaiolas de aço inoxidável de tamanho idêntico (1,20 £ 1,00 £ 0,50 m3, 9 gansinhos por gaiola, densidade de criação: 7,5 aves/m2), que foram colocadas 0,50 m acima do solo. Os filhotes foram alimentados sob condições de manejo padrão com ração peletizada e água ad libitum. O número de comedouros suspensos e bebedouros em cada gaiola foi suficiente durante todo o estudo. A temperatura ambiente foi mantida a 30 graus de d 0 a 3, 29 graus de d 4 a 6, 28 graus de d 7 a 9 e 26 graus de d 10 até o final do experimento. A umidade relativa durante todo o 21-d período experimental foi de aproximadamente 60 por cento. As fontes de luz (luz branca, 400 −760 nm) foram equalizadas para uma iluminância de 15 § 0,3 lux no nível da cabeça da ave, com uma programação de luz de 22 h de luz de d 0 a 3, 18 h de luz de d 4 a 14 e 16 h de luz de d 15 a 21 em um ciclo de 24- h.

The basal diet was formulated to meet or exceed National Research Council (NRC, 1994) nutrient requirements for growing geese. The composition of experimental diets is presented (Table 1). Dietary samples (>1 por cento de ração fresca) adquiridos aleatoriamente de 5 locais foram misturados para análise. CP e CF foram medidos de acordo com GB/T6432 (Padrão Nacional Chinês: Determinação de proteína bruta em ração) e GB/T6434 (Padrão Nacional Chinês: Determinação de fibra bruta em ração).

O ADFI e o PC (peso vivo) dos filhotes foram registrados usando uma balança eletrônica (YP60001, Hengji, Xangai, China) antes da alimentação durante o teste e o GMD e a taxa de conversão alimentar (FCR) foram calculados ao final do experimento. Além disso, a morbidade cumulativa da gota de todas as repetições (cada repetição continha 45 aves) entre os diferentes tratamentos foi somada após o período experimental. O padrão de seleção para gota foi definido como um ganso exibindo lesões renais macroscópicas e uma concentração sérica de ácido úrico (AU) acima do valor marginal de supersaturação de urato (masculino, 416 mmol/L e fêmea, 357 mmol/L). As lesões macroscópicas predominantes típicas dos rins são pálidas, manchadas e inchadas, e os túbulos renais e ureteres estão distendidos com excesso de uratos (Xi et al., 2020a).

Herba Cistanche

3. Medição de Metabólitos Séricos

Trinta e seis gansinhos (n=6 gansinhos/tratamento) foram escolhidos aleatoriamente para coleta imediata de sangue (5 mL/ ganso), após decapitação, via tubos de coleta de sangue sem anticoagulante nos dias 9 e 18, respectivamente. Todas as amostras de sangue foram incubadas a 37 graus por 2 h após a coleta e centrifugadas a 1,5{{1{19}}}}0 £ g por 15 min. Os soros obtidos foram armazenados em tubos Eppendorf de 0,6 mL a 80 graus até análise posterior. Os níveis séricos de AU foram determinados por colorimetria de ácido fosfotungstico. As concentrações de creatinina (Cr) e nitrogênio da uréia (UN), bem como a atividade da xantina oxidase (XOD) foram determinadas por colorimetria enzimática usando um espectrofotômetro de microplaca (Promega Corporation, Madison, WI). Esses kits foram fornecidos pelo Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China); os códigos eram C012 (UA), C011-2 (Cr), C013-2 (UN) e A002 (XOD). As concentrações séricas de IgM, IgA e IgG nos gansos experimentais foram medidas usando kits ELISA de imunoglobulina de ganso adquiridos da Shanghai J&I Biotechnology Co., Ltd (Shanghai, China). Complexos imunes circulantes séricos (CIC), concentração de IL-1b e TNF-a foram determinados usando um kit ELISA de ganso comercial (Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China). A atividade da diamina oxidase (DAO) foi medida por colorimetria enzimática usando um analisador bioquímico automático (Hitachi, Tóquio, Japão). O LPS sérico foi medido usando o ensaio Limulus tradicional (Limulus Assay Biotechnology Company Ltd., Xiamen, China). As faixas de detecção de LPS no ensaio Limulus variaram de 0,015 a 0,6 EU/mL. Todos os materiais utilizados para coleta de sangue e medição de endotoxinas eram isentos de pirogênios. Todos os ensaios foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de soro foram testadas em triplicado. Os coeficientes de variação intra e interensaio para os ensaios foram<10% and <15%, respectively.

4. Observação Histomorfológica

Os cecos (comprimento {{0}} cm) de 36 filhotes (n=6 filhotes/tratamento) foram coletados após a coleta de sangue nos dias 9 e 18 para análise histológica. Amostras coletadas de gansinhos foram fixadas em paraformaldeído a 4 por cento, embebidas em parafina e seccionadas (espessura do corte: 3 mm; 4 fatias por ganso). Alterações patológicas no ceco (aproximadamente 7 cm distal ao esfíncter pilórico) foram examinadas em microscópio de luz (OLYMPUS, Tóquio, Japão) após coloração com hematoxilina e eosina (HE). A altura do vilo e a profundidade da cripta do ceco foram medidas usando o software ImageJ (versão 1.8.0; National Institutes of Health, Bethesda, MD). Oito medições de diferentes vilosidades intactas por fatia foram registradas (8 medições em 3 campos de visão sucessivos). As análises estatísticas das medições histológicas foram realizadas com base em uma média de 32 medições por ganso (4 fatias por ganso e 8 medições por fatia). A densidade de células caliciformes foi calculada como a contagem de células caliciformes dividida pelo comprimento do vilo correspondente, que foi então calculada a média e expressa como o número de células caliciformes por 100 mm de comprimento do vilo.

cistanche tubulosa

5. Sequenciamento de 16S rRNA do conteúdo do ceco

O conteúdo do ceco de gansinhos (6 gansinhos/ tratamento £ 6 grupos £ amostragem duas vezes=72 gansinhos) foi coletado nos dias 9 e 18 em frascos criogênicos estéreis de 2 mL com rosca interna e imediatamente armazenados em nitrogênio líquido para análise de 16S rDNA . O DNA das amostras do conteúdo do ceco foi extraído usando um Kit MicroElute Genomic DNA (D3096-01, Omega Biotek Inc., Norcross, GA) seguindo as instruções do fabricante. Amostras em branco consistindo de zaragatoas não utilizadas foram processadas por meio de extração de DNA e foram verificadas para não produzir amplicon 16S. O DNA total foi eluído em 50 mL de tampão de eluição usando um procedimento modificado descrito pelo fabricante (QIAGEN, Dusseldorf, Alemanha) e armazenado a 80 graus .

Usando o DNA total das amostras como modelo e primers 16S rDNA (343F - 50 - TACGGRAGGCAGCAG -30; 798R - 50 - AGGGTATCTAATCCT-30 ), amplificamos a região V3-V4 da 16S rRNA. Todas as reações foram realizadas em uma mistura de 25 mL (volume total) contendo 25 ng de extrato de DNA genômico, 12,5 mL de PCR Premix, 2,5 mL de cada iniciador e água grau de PCR para ajustar o volume. Os produtos de PCR foram normalizados usando um AxyPrep Mag PCR Normalizer (Axygen Biosciences, Union City, CA), que permitiu que a etapa de quantificação fosse ignorada, independentemente do volume de PCR enviado para sequenciamento. Os pools de amplicons foram preparados para sequenciamento usando esferas AMPure XT (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA; realizado por OebioTech Co., Ltd, Xangai, China). O tamanho e a quantidade da biblioteca de amplicons foram avaliados usando LabChip GX (Perkin Elmer, Waltham, MA) e um Kapa Library Quantification Kit for Illumina (Kapa Biosciences, Woburn, MA), respectivamente. A biblioteca PhiX Control (v3) (Illumina) foi combinada com a biblioteca amplicon (esperada em 30 por cento). A biblioteca foi agrupada em uma densidade de aproximadamente 570 K/mm2. As bibliotecas foram sequenciadas em execuções 300PE MiSeq, onde uma biblioteca foi sequenciada com ambos os protocolos usando primers de sequenciamento Illumina padrão, eliminando assim a necessidade de uma terceira (ou quarta) leitura de índice. As leituras foram filtradas usando insights quantitativos em ecologia microbiana (QIIME;) filtros de qualidade. O pipeline CDHIT foi usado para selecionar unidades taxonômicas operacionais (OTUs) preparando uma tabela OTU. Sequências com 97 por cento de similaridade foram atribuídas a OTUs. As sequências representativas foram escolhidas para cada OTU e os dados taxonômicos foram então atribuídos a cada sequência representativa usando o classificador Ribosomal Database Project (RDP). O número de acesso do GenBank dessas sequências de nucleotídeos OTU é SAMN21014082. Para estimar a diversidade alfa, a tabela OTU foi rarefeita, e as 4 métricas a seguir foram calculadas: a métrica Chao1 para estimar a riqueza; a métrica de espécies observadas como uma contagem de OTUs únicas encontradas na amostra; o índice de Shannon; e o índice de Simpson.

6. PCR em tempo real

ings (n {{0}} filhotes/tratamento) foram coletados nos dias 9 e 18 para análise de PCR em tempo real (RT-PCR). O RNA total foi extraído dos tecidos, usando reagente TRIzol (Life Technologies, Grand Island, NY), e transcrito reversa usando um kit Reverse Transcription Levels (TaKaRa, Dalian, China), de acordo com o protocolo do fabricante. A b-actina foi usada como um controle invariante. Os primers foram projetados no software Primer Premier 5.0 e suas sequências estão listadas (Tabela 2). RT-PCR foi realizado usando SYBR Premix Ex Taq (Roche, Basel, Suíça). Todos os RT-PCRs foram realizados em triplicata. Os níveis de expressão relativa dos genes alvo foram determinados usando os 2 métodos DDCt.

7. Análise de dados

Dados experimentais derivados de 6 réplicas por tratamento foram analisados ​​usando o programa IBM SPSS Statistics 16 (IBM Corporation, Somers, NY). Cada repetição foi considerada como uma unidade experimental e o procedimento estatístico utilizado foi uma análise multivariada de variância usando o procedimento de modelo linear geral (GLM). Quando diferenças significativas foram determinadas, as médias dos tratamentos foram separadas e comparadas usando o teste de escala múltipla de Duncan. Um teste bicaudal foi considerado estatisticamente significativo a um nível de probabilidade inferior a 5 por cento (P < 0,05).

Yumeng Xi *, Yuanpi Huang,y Yue Li *, Yunmao Huang #, Junshu Yan * e Zhendan Shi *.

* Laboratório Chave para Agricultura Integrada de Culturas e Animais do Ministério da Agricultura e Assuntos Rurais, Animal Husbandry Institute, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;

# Faculdade de Ciência Animal, Universidade Zhongkai de Agricultura e Engenharia, Guangzhou 510000, China.