Os efeitos renoprotetores de EphrinB2 (EphB2)
Mar 21, 2022
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Zhimin Huang, Simeng Liu, Anna Tang, Laith Al-Rabadi, Mark Henkemeyer, Patrice N. Mimche e Yufeng Huang
Introdução
A doença renal crônica (DRC) é caracterizada por inflamação persistente e aumento gradual da fibrose, incluindo glomeruloesclerose e fibrose tubulointersticial, levando adoença renal em estágio final(ESRD) independentemente do distúrbio subjacente|1]. Isso aponta para um caminho final comum para ESRD. Uma melhor compreensão dos principais mediadores dessa via comum resultará potencialmente no desenho de terapias mais direcionadas para prevenir ou reverter a progressão da DRC.
A eritropoietina produtora de tirosina quinases de receptores hepatocelulares (Eph) e seus ligantes correspondentes de interação com o receptor Eph (Efrina) formam uma grande família de proteínas sinalizadoras ancoradas na membrana altamente conservadas que controlam diversas interações célula-célula ao longo do desenvolvimento e na vida adulta [2]. Após o contato célula-célula, as interações EphB-EphrinB em particular resultam em dímeros, tetrâmeros e agrupamentos de proteínas de ordem superior, levando à ativação de cascatas de sinalização bidirecionais que são propagadas para a célula que expressa o receptor (sinalização direta) e o ligante- célula de expressão (sinalização reversa)[3-5]. Dado que se acredita que a sinalização bidirecional Eph-Ephrin participe de uma ampla gama de interações célula-célula, migração e eventos de adesão durante o desenvolvimento embrionário e durante o reparo fisiológico do tecido 2,6-10], não é surpreendente que a desregulação dessas moléculas tem sido implicada na fibrose tecidual. De fato, os papéis da sinalização EphB-EphrinB na fibrogênese tecidual foram descobertos em vários modelos de camundongos de fibrose vascular [11], cardíaca [12], pele [13], pulmonar [14] e hepática [15,16]. No entanto, as funções potenciais desses receptores e ligantes em relação à fisiopatologia do rim são amplamente desconhecidas.
Nos glomérulos renais adultos, o EphrinB1 está localizado na fenda do diafragma do podócito nos glomérulos [17], o EphrinB2 é expresso principalmente nas células endoteliais glomerulares (ECs) e no músculo liso arterial [18], enquanto o EphrinB3 é pouco detectável19]. A expressão glomerular ou distribuição de receptores Eph ainda não é clara, embora alguns estudos tenham indicado que uma célula rara expressa EphB4 em glomérulos maduros [18]. Nos túbulos renais, EphrinB1 é detectado em todo o néfron e pode afetar a citoarquitetura das células epiteliais tubulares [19]. Além de ser expresso em células musculares lisas arteriais e ECs, EphrinB2 também foi encontrado abundantemente em túbulos de conexão e ductos coletores corticais e medulares de rins em desenvolvimento e adultos [18].Ephrin B2 (EphB2) foi encontrado abundantemente expresso nos túbulos da medula interna e externa, incluindo os túbulos retos distais e o ramo fino da alça de Henle, onde está concentrado no lado basal das células. A expressão de EphB4 é restrita aos capilares na medula. EphB6 é expresso preferencialmente nos corpúsculos e túbulos renais do córtex e da medula externa, incluindo os túbulos proximal e distal. No entanto, o próprio EphB6 não possui atividade catalítica e é improvável que opere como um receptor independente, mas sim sinaliza como parte de um complexo de sinalização hetero-oligomérico com outros receptores de EphB in vivo [20].
Foi relatado anteriormente que a sinalização reversa de EphrinB2 protegeu contra rarefação capilar e fibrose após lesão renal induzida por obstrução ureteral unilateral (UUO) ou lesão de isquemia-reperfusão (IR), uma vez que camundongos sem sinalização dependente de EphrinB2-PDZ tiveram uma lesão vascular e fibrose aumentada após lesão renal [21]. No entanto, também é possível que a proteína EphrinB2 morta em PDZ atue como um ligante mais forte para estimular a sinalização direta de EphB, e isso pode ser a causa da fibrose renal excessiva observada no estudo acima. Além disso, o estudo acima não determinou qual, se algum, receptor EphB participa na patologia renal após lesão. Dado o importante papel profibrótico do EphB2 (EphB2)sinalização observada recentemente na fibrose hepática[15,16] e a expressão mais abundante de EphB2 (EphB2)em células tubulares renais [19], nós hipotetizamos que EphB2 (EphB2)provavelmente está envolvido emrenalfibrose. No presente estudo, investigamos se EphB2 elevado (EphB2)também é observada em diferentes doenças renais e se a expressão e sinalização de EphB2 (EphB2)estão envolvidos no desenvolvimento derenalbarramento EphB2 (EphB2)camundongos knockout(KO) e controle da mesma ninhada para receberrenalLesão IR. Mostramos que EphB2 (EphB2)a expressão e a capacidade de sinalização são significativamente reguladas para cima após lesão de IR em um modelo de camundongo e em rins de modelos de camundongos com DRC hipertensos e diabéticos experimentais e pacientes que sofrem de DRC. Além disso, a perda genética de EphB2 (EphB2)em camundongos KO protegeram fortemente os rins de lesões induzidas por IRrenaldano, disfunção e fibrose, identificando assim um papel crucial para esse receptor na mediação dos eventos celulares adversos que afetam o rim durante a progressão da doença.
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Resultados
EphB2 (EphB2)é regulado e ativado no rim após lesão
As transcrições de todas as moléculas de EphB e Ephrin-B no rim de camundongo adulto normal foram avaliadas por RT-PCR (Figura S1A suplementar), revelando que os produtos de amplificação mais proeminentes foram EphB2 (EphB2), EphB4, EphrinB1 e EphrinB2. Foi demonstrado que o EphB4 é expresso principalmente em ECs vasculares e necessário para a integridade estrutural dos vasos sanguíneos, e não é detectado nas principais células renais envolvidas na fibrose [21,26]. Além disso, nossos dados revelaram que células epiteliais tubulares renais e fibroblastos tubulares expressam o EphB2 (EphB2)receptor e ligantes EphrinB1 e EphrinB2 cognatos (ver Figura Suplementar S1B). Em seguida, investigamos possíveis alterações na expressão após lesão de IR e descobrimos que EphB2 (EphB2)Os níveis de mRNA e proteína foram significativamente regulados positivamente no rim lesado por WT IR em comparação com o rim de controle não lesado (CTL) (Figura 1A-C). Consistente com isso, immunoblots usando um anticorpo fosfo-específico para EphB1/EphB2 (EphB2)que fornece uma leitura para o receptor cataliticamente ativo de tirosina quinase (p-EphB1/2) detectou um aumento significativo no rim de camundongo WT lesionado por IR (Figura 1B, D). Análise de IF de seções de tecido usando anti-EphB2 (EphB2)os anticorpos confirmaram um aumento na expressão da proteína receptora no rim lesado por IR WT, particularmente nas células epiteliais tubulares e células tubulointersticiais (Figura 1E). Importante, nenhum EphB2 (EphB2)sinais foram detectados em immunoblots ou IF em rins de EphB2 (EphB2)camundongos KO(EphB2-/)demonstrando a especificidade dos reagentes de anticorpo. Finalmente, um aumento significativo na expressão da proteína EphrinB2 também foi detectado em rins lesionados por IR de camundongos WT, embora curiosamente esse aumento não tenha sido detectado em rins lesionados de EphB2 (EphB2)camundongos KO (Figura 1B, F).
Figura 1. EphB2 (EphB2)expressão aumenta no rim de camundongos após lesão de IR por 2 semanas
(A) Os níveis de receptor EphB2, EphrinB1, EphrinB2 mRNA foram analisados em rins de camundongos usando RT-PCR em tempo real. Os resultados são mostrados como mudança de dobra em comparação com os rins contralaterais (CTL). As barras de erro representam a média ± SD, n=5 animais.
(B) Western blots de EphB2, fósforo-EphB2 (pEphB21594), EphrinB2 e GAPDH de rins de camundongos EphB2 plus/plus (WT e EphB2-/(KO). O peso molecular foi marcado à direita.
Os gráficos resumem os resultados das medições de densidade de banda para EphB2(C), p-EphB2(D) e EphrinB2 (F).*P<0.05 vs.ephb2+/+="">
(E) Seções renais congeladas de camundongos EphB2 plus/plus e EphB2-/- após lesão por IR foram coradas com EphB2 (vermelho) e DAPI/DNA (azul). Ampliação, × 200. Não há EphB2 detectado em immunoblots ou coloração IF em rins de camundongos EphB2 KO.
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Para verificar se a expressão regulada positivamente de EphB2 (EphB2)e os genes EphrinB também puderam ser observados em outros modelos animais de doenças renais, submetemos rins de camundongos db/db diabéticos tipo 2 [27] e de camundongos hipertensos infundidos com sal de deoxicorticosterona (DOCA) e angiotensina (Ang) II [22] a Análise RT-PCR. Os dados indicam que EphB2 (EphB2), EphrinB1 e EphrinB2 transcritos foram todos significativamente aumentados nos rins em ambos os modelos (Figura S2 suplementar). Em seguida, realizamos a coloração IF para EphB2 (EphB2)em biópsias renais em pacientes com DRC com diagnóstico de nefropatia por lgA (NIgA) com glomeruloesclerose, atrofia tubular e fibrose intersticial determinada pela coloração PAS (Figura 2A). Comparado com indivíduos normais, um padrão impressionante de EphB2 elevado (EphB2)proteína e sinalização direta (coloração com anticorpos p-EphB1/2) foi detectada não apenas nos glomérulos doentes, mas também na área tubular envolvida na doença nos rins desses pacientes com IgAN (Figura 2B, C). A coloração imuno-histoquímica usando o mesmo anticorpo anti-p-EphB2 usado para coloração IF revelou ainda que forte coloração p-EphB2 foi observada principalmente em células tubulares e algumas em células tubulointersticiais nesses pacientes com IgAN (Figura 2D). Em contraste, apenas algumas células tubulares foram coradas fracamente para p-EphB2 no rim normal (Figura 2D). Os níveis de densidade integrados semiquantificados para EphB2 (EphB2)ou coloração p-EphB2 na área tubulointersticial renal determinada por ImageJ foram mostradas à direita, respectivamente. Esses dados indicam que a expressão regulada para cima de EphB2 e a potencial ativação da sinalização de encaminhamento é uma característica proeminente derenalfibrose.
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Figura 2. EphB2 (EphB2)expressão aumenta em tecido de biópsia de rim humanocom DRC em comparação com indivíduos normais Seções de biópsia renal da parte normal do rim (NC, n=3) e dos pacientes lgAN (tipo patológico Oxford T=1 [38]) (n=7) da Nanjing Medical University foram corados com PAS (A), EphB2 (vermelho) (B) e fósforo-EphB2 (p-EphB2) (vermelho) (C). Ampliação, × 200.DAPI-colorado DNA (azul) serviu como controle de coloração de núcleos para coloração IF (a coloração IF foi realizada conforme descrito para tecido de camundongo). O uso do material humano foi aprovado pelo conselho de ética local. Ampliação × 200. As setas indicavam fibrose no glomérulo e área túbulo-intersticial. (D) Coloração imunoquímica para p-EphB2 (corado em marrom) (usando o mesmo anticorpo anti-pEphB2 que o anticorpo primário usado para coloração IF e o IgG anti-coelho conjugado com peroxidase (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) como o secundário anticorpo e coloração positiva foi desenvolvida usando 3,3'-diaminobenzidina) foi ainda realizado em seções de 3-μm de parafina embebidos nesses tecidos de biópsia renal de lgAN e foi contra-corada com hematoxilina. Como controle negativo, o anticorpo primário foi substituído por IgG pré-imune e nenhuma coloração específica foi observada. Ampliação × 400. A densidade de pixels integrada relativa da coloração do EphB2 ou p-EphB2, especialmente na área túbulo-intersticial renal, quantificada por ImageJ, foi mostrada à direita de cada foto de coloração.*P<0.05 vs.="" normal="" kidney=""> | Figura 3.EphB2 (EphB2)Camundongos -KO exibem função renal melhorada e atrofia e lesão tubular reduzida e fibrose tubulointersticial após lesão de IR (AC) BUN sérico (A), níveis de Cr (B) e peso do rim (C) (n=5/grupo).*P<0.05 vs.ephb2+/+="" mice.="" (d,="" e)representative="" microscopic="" images="" showing="" pas="" staining="" (d)="" and="" masson's="" trichrome="" staining="" (e)="" of="" the="" kidney="" sections="" were="" used="" to="" detect="" tubular="" injury,="" inflammation,="" and="" collagen="" deposition="" (stained="" blue).="" magnification,×200.(f,="" g).="" the="" graphs="" summarized="" the="" results="" of="" tubular="" injury="" (f="" and="" collagen="" deposition="" (g)="" quantified="" by="" imagej.(h,="" d)="" mrna="" expression="" of="" tubular="" injury="" markers,="" ngal(h)="" and="" kim-1="" ()="" in="" the="" kidney="" following="" ir=""><0.05 vs.ephb2+/="" contralateral="" kidney=""><0.05 vs.ephb2+/+="" ir-injured=""> |
EphB2 (EphB2)KO protege o rim de lesão e fibrose induzidas por IR
No modelo de IR de lesão renal e fibrose, um protocolo de 35-min isquemia em camundongos WT induziu dano renal unilateral crônico grave típico após 2 semanas, incluindo função renal prejudicada, conforme evidenciado pelo aumento dos níveis séricos de BUN e Cr (Figura 3A, B) (embora os níveis séricos de BUN ou Cr medidos aqui reflitam apenas parcialmente a função prejudicada do rim lesionado por IR, ambos os níveis séricos de BUN e Cr em camundongos WT comlesão de IR renalforam significativamente aumentados em comparação com camundongos normais WT sem qualquer lesão (BUNvs. Normal:26,81±4,25 vs.17,3±0,37 mg/dl; Cr:0,3{{1{{12}) }}}1±00,029 vs.0,158±0,064 mg/dl)) e atrofia renal como evidente pelo índice de peso renal reduzido (proporção do peso do rim lesionado por IR em relação ao controle, peso do rim não lesionado)(Figura 3C ). Histologicamente, o rim lesionado por IR em camundongos WT mostrou infiltração de células mononucleares tubulointersticiais típicas e deposição de colágeno acumulado, conforme determinado por coloração PAS e coloração Trichrome de Masson (Figura 3D-G). Os camundongos EphB2-/- lesionados por IR mostraram uma forte redução nos níveis de BUN e Cr em comparação com camundongos WT lesionados e notavelmente menos atrofia renal, lesão tubular e fibrose tubulointersticial. Transcritos renais para lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos (NGAL) e mRNA da molécula de lesão renal-1(KIM-1) também foram avaliados, pois ambos são validados como marcadores preditivos precoces de lesão tubular renal. Os dados indicaram que, enquanto NGAL e KIM-1 se tornaram altamente expressos no rim lesionado por IR de camundongos WT, sua expressão foi marcadamente reduzida em 77,2 e 88,5 por cento, respectivamente, nos rins lesionados de EphB{{33} }/ camundongos mutantes (Figura 3H-I). Isso indica que o dano tubular após a lesão de IR foi fortemente reduzido em camundongos que não tinham expressão do EphB2 (EphB2)receptor.
Figura 4.EphB2 (EphB2)Camundongos -KO reduziram a coloração tubular -SMA e os níveis de proteína renal de marcadores fibróticos após lesão por IR
(A) Seções renais congeladas de camundongos EphB2 plus / plus te EphB2-/- após lesão por IR foram coradas com -SMA (vermelho) e DAPI/DNA (azul) e analisadas usando microscopia confocal. Ampliação, × 200.
(B) Os gráficos resumiram os resultados da deposição de -SMA quantificada por ImageJ.*P<0.05 vs.ephb2+/t="" contralateral="" kidney="">
(C) Western blots de FN, -SMA, N-caderina e GAPDH de CTL e rins lesionados por IR de camundongos EphB2 plus/plus e EphB2-/7-. O peso molecular foi marcado à direita.n=5 animais/grupo.
(DF) Os gráficos resumiram os resultados das medições de densidade de banda para FN (D), -SMA (E) e N-caderina (F).*P<0.05 vs.="" ephb2+/+=""><0.05 vs.="" ephb2+/+="" ir-injured="">
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-SMA tipicamente aumenta durante a diferenciação de células tubulares em fibroblastos ou ativação de fibroblastos em miofibroblastos ou remodelação vascular. Usando a análise IF de seções renais, detectamos um aumento acentuado na coloração -SMA nas células tubulares em rins lesionados por IR de camundongos WT, uma resposta que foi drasticamente anulada em EphB2 (EphB2)-/- camundongos (Figura 4A, B). Esta observação foi ainda apoiada por análises de immunoblot mostrando uma redução impressionante nos níveis elevados de proteína de -SMA, bem como fenótipo mesenquimal/fibrótico caracterizado pela expressão de N-caderina e FN em rins lesionados por IR de EphB2 (EphB2)-/-ratos comparados com os controles WT (Figura 4C-F). Análises adicionais mostraram níveis aumentados de mRNA dos marcadores fibróticos, incluindo colágeno tipo Iol (Col-Io1), Col-II 1, Col-IVcl e FN no rim lesionado por IR também foram significativamente reduzidos no EphB2 (EphB2)-/-mutantes (Figura 5). Esses dados indicam que EphB2 (EphB2)KO protege os rins de EMT tubular induzida por IR e fibrose.
Figura 5. RT-PCR quantitativo para análise da expressão gênica dos marcadores profibróticos e inflamatórios
O RNA total foi preparado a partir de rins contralaterais (CTL) ou lesionados por IR deEphB2mais mais eEphB2-/- camundongos. Os dados são média± SD, n=5 animais por grupo.*P<0.05>EphB2mais / mais CTL, #P<0.05>EphB2mais / mais rim lesionado por IR.
EphB2 (EphB2)O KO atenua as respostas inflamatórias renais robustas, o estresse oxidativo e as respostas proliferativas após a lesão de IR
Como moduladores chave da fibrose tecidual, o TGF 1, o inibidor do ativador do plasminogênio tipo 1 (PAI-1), o receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR) e o inibidor tecidual da metaloproteinase (TIMP1) desempenham um papel importante narenalfibrose. Conforme esperado, os níveis de mRNA renal de TGF 1, PAI-1, PDGFR- e TIMP1 aumentaram acentuadamente em rins lesados por IR de camundongos WT, em comparação com seus rins não lesados por CTL internos (Figura 5). No entanto, a expressão de mRNA desses moduladores profibróticos foi fortemente embotada em rins lesados por IR de camundongos EphB2-7-. Esses resultados são consistentes com a redução derenalfibroseobservamos em camundongos EphB2-7após lesão de IR.
Para verificar ainda mais o efeito de EphB2 (EphB2)KO em vias de sinalização a jusante celular relacionadas, observamos que os transcritos de RNA renal para NF-kB-p65, proteína quimiotática de monócitos-1(MCP-1), interleucina (IL)-1B e Nox2 estavam todos aumentados em rins lesionados por IR de camundongos WT (Figura 5). Além disso, a produção de proteína renal de NF-KB-p65, Nox2 e seu cofator, p47Phox, foi muito maior em rins lesionados por IR de camundongos WT em comparação com rins CTL, indicando ativação da via inflamatória mediada por NF-kB e Nox2 no IR- rim lesionado. No entanto, os níveis desses mediadores foram melhorados ou revertidos próximos aos níveis normais em camundongos KO sem EphB2 (EphB2)expressão (Figura 6A-D). A fosforilação e sinalização de uma serina/treonina quinase (Akt) e vias MAPK/ERK foram aumentadas em rins com lesão por IR de camundongos WT, que foram drasticamente reduzidos, aproximando-se dos níveis normais, em camundongos EphB2-/-(Figura 6A, E, F). O anticorpo F4/80, conhecido por marcar macrófagos, demonstrou um aumento substancial no número absoluto de células F4/80 plus na área tubulointersticial em rins lesionados por IR de camundongos WT, enquanto as células F4/80 plus eram esparsas em vasos renais em Rins CTL, indicando um acúmulo de macrófagos e inflamação nos rins danificados. No entanto, o número de células F4/80 plus foi amplamente reduzido em camundongos EphB{15}}, aproximando-se dos níveis normais observados em rins não lesionados (Figura 7A, B). Além disso, testamos Ki-67, uma proteína nuclear que serve como marcador celular de proliferação. Consistente com a ativação de Akt e ERK1/2 no rim lesionado por IR de camundongos WT, a coloração IF detectou um aumento dramático no número de células Ki-67-positivas na área tubulointersticial. Em contraste, camundongos EphB2-7-exibiram um número muito menor e menor intensidade de coloração de Ki-67 em rins lesionados por IR que mais se assemelhavam ao rim não lesionado normal (Figura 7C, D). Esses dados indicam que a deleção de EphB2 (EphB2)inibe a inflamação mediada por NF-kB, a geração e ativação de oxidase mediada por NADPH oxidase e a proliferação celular mediada por Akt e ERK1/2- no rim lesionado por IR em camundongos. Assim, EphB2 (EphB2)pode ser necessário para o substancialrenalinflamatórioe respostas proliferativas que contribuem para a fibrose.
Figura 6. Níveis de proteínas renais de marcadores inflamatórios, de estresse oxidativo e proliferativos
(A) Western blots de NF-kBp65, Nox2,p47phox, p-Akt, pERK1/2,t-ERK1/2 e GAPDH de rins contralaterais (CTL) e IR-lesados deEphB2 (EphB2)/ eEphB2-/-ratos. O peso molecular foi marcado à direita. n=5 animais/grupo.
(BF) Os gráficos resumiram os resultados das medições de densidade de banda para NF-kB-p65 (B), Nox2 (C), p47Phox(D), p-Akt (E), pERK1/2/t-ERK1/2 (F ), respectivamente. *P<0.05 vs.="">EphB2mais / mais CTL.#P<0.05 vs.="">EphB2*/ mais rim lesionado por IR.
Redução da apoptose no rim de EphB2 (EphB2)-/-camundongos após lesão por IR
Rins submetidos a lesão de IR também são caracterizados por extensa apoptose de células epiteliais tubulares renais. A coloração de TUNEL exibiu uma elevação significativa na apoptose em seções de rim danificadas por IR de camundongos WT, em comparação com os rins CTL (Figura 8A, B), que foi drasticamente reduzida em camundongos EphB2-7. Estes resultados suportam o papel do EphB2 (EphB2)KO na supressão da apoptose e mecanismos de reparo após lesão renal. Tal efeito adicional de EphB2 (EphB2)também pode explicar a fibrose limitada que ocorre em camundongos EphB2-7-após lesão crônica induzida por IR.
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EphB2 (EphB2)via profibrótica relacionada à sinalização
Entre os 760 genes testados pela expressão gênica NanoString (mostrado na Figura 9A, um mapa de calor de expressão gênica), houve evidência de expressão gênica diferencial (P ajustado<0.05)in the="" ir-injured="" kidney="" of="" wt="" mice="" relative="" to="" the="" wt="" ctl="" kidney="" (wt-ir="" vs.="" wt-ctl)="" for="" 506="" genes(356genes="" were="" up-regulated="" and="" 150="" genes="" were="" down-regulated)with="" an="" estimated="" false="" discovery="" rate="" of="" 5%.="" the="" up-regulated="" 356="" genes="" include="" all="" molecules="" that="" we="" have="" observed="" in="" their="" rna="" expression="" or="" protein="" production="" using="" real-time="" rt-pcr="" or="" western="" blot="" assay="" described="" above="" and="" these="" genes="" encode="" for="" fibrotic="" markers="" such="" as="" col-iol,="" col-iiol,="" col-ivαl,="" and="" fn;="" emt="" markers="" such="" as="" α-sma="" and="" vimentin;="" inflammatory="" factors="" and="" oxidative="" enzymes="" such="" as="" nf-kb,="" mcp-1,="" il-1β,="" and="" nox2;="" growth="" factors="" and="" proliferation="" markers="" such="" as="" tgfβ1,="" pai-1,="" pgdfrβ1,="" timp-1,="" mek="" kinase,="" akt-1="" and="" ki-67,="" and="" caspase-3,="" -4,="" and-12="" that="" regulate="" inflammation="" and="" apoptosis.="" however,="" all="" those="" increased="" markers="" that="" were="" significantly="" attenuated="" in="" the="" ir-injured="" kidney="" of=""> (EphB2)Camundongos KO comparados com camundongos WT (KO-IR vs. WT-IR) determinados por RT-PCR em tempo real ou ensaio de Western blot descrito acima também são confirmados pelo ensaio de expressão gênica NanoString. Os genes regulados para baixo incluem superóxido dismutase 1(SOD1)[28], heme oxigenase 1(Hmox1)[29] e tiorredoxina 1,2(Txn1,2)[30] que parecem estar na família antioxidante. A redução nesses genes está associada ao aumento do estresse oxidativo observado no rim WT lesado por IR. No entanto, tal redução em SOD1 e Txn1, 2 não ocorreu no EphB2 lesado por IR (EphB2)KO renal. Aparentemente, o ensaio de expressão gênica NanoString descobriu simultaneamente vários genes candidatos que estão envolvidos em indução de IR.renalprejuízoe fibrose. Notavelmente, 230 dos 356 genes regulados positivamente foram reduzidos (total de 64,6 por cento, com P ajustado<0.05)and 129="" of="" 150="" down-regulated="" genes="" were="" reversed="" to="" varying="" degrees（total="" 86%个,="" with="" adjusted=""><0.05）in the="" ir-injured="" kidney="" of="" ephb2-/-mice="" compared="" with="" wt="" mice(ko-ir="" vs.="" wt-ir).="" all="" those="" ameliorated="" molecules="" are="" involved="" in="" 50="" ameliorated="" annotated="" pathways="" (shown="" in="" figure="" 9b,="" a="" heatmap="" of="" pathway="" scores).="" among="" those,="" the="" common="" profibrotic="" pathways,="" shown="" in="" figure="" 9c,="" that="" will="" contribute="" to="" the="" development="" of="">renalfibrose, como a EMT e as vias inflamatórias e proliferativas, são marcadamente ativadas ou reguladas positivamente no rim lesado por IR, mas significativamente melhoradas no EphB2 lesado por IR (EphB2)KO renal. Surpreendentemente, esta análise também revelou que o metabolismo energético das células tubulares renais, como a lipogênese de novo, a gliconeogênese, o metabolismo do colesterol, a sinalização do receptor ativado por proliferador de peroxissomo (PPAR) e, particularmente, o metabolismo de ácidos graxos, além da diminuição da expressão de mRNA de antioxidantes (como listada como via de estresse oxidativo no mapa de calor, Figura 9B), amplamente destruída no rim lesionado por IR, foi dramaticamente perseverada no EphB2 lesionado por IR (EphB2)Rim KO (como mostrado na Figura 9D). Estes resultados sugerem ainda que a maioria das moléculas que estão envolvidas narenalprejuízoe fibrose são regulados ou relacionados ao EphB2 (EphB2)sinalização. Notavelmente, o EphB2 (EphB2)A sinalização pode estar envolvida ou mediar o metabolismo energético mitocondrial das células tubulares renais, como a oxidação de ácidos graxos mitocondriais e a lipotoxicidade em doenças renais.
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Figura 7.EphB2 (EphB2)KO reduz a infiltração de macrófagos e proliferação de células tubulares no rim após lesão de IR Seções renais de camundongos EphB2 plus/plus e EphB2-7(n=5/cada) após lesão por IR foram coradas com F4/80 (vermelho)(A), Ki-67 (vermelho) (C) e DAPI/DNA (azul) e analisados por microscopia confocal. Ampliação, × 200. Os gráficos resumiram os resultados das células F4/80 plus (B) e Ki-67 plus (D) quantificadas por ImageJ.*P<0.05 vs.ephb2+/+="" contralateral="" kidney=""><0.05 vs.ephb2+/+="" ir-injured=""> | Figura 8.EphB2 (EphB2)KO reduz apoptose de células tubulares no rim após lesão de isquemia-reperfusão (IR) (A)Seções renais de camundongos EphB2 plus/plus e EphB2-7- ((n=5/cada) após lesão de IR foram coradas com TUNEL (verde) e DAPI/DNA (azul) e analisadas usando microscopia confocal. Ampliação, × 200. (B) Os gráficos resumiram os resultados de TUNEL mais células quantificadas por ImageJ.*P<0.05 vs.ephb2++="" contralateral="" kidney=""><0.05 vs.="" ephb2+="" ir-injured=""> |
