Parte Ⅰ Desenvolvimento de um imunoensaio de fluxo lateral de nanopartículas de európio para detecção de NGAL na urina e diagnóstico de lesão renal aguda

Abstrato

1. Fundo

A IRA está relacionada a resultados adversos graves e mortalidade em pacientes com a doença de coronavírus 2019 (COVID-19), portanto, o diagnóstico e a intervenção precoces são essenciais. A lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos (NGAL) é um dos biomarcadores mais promissores para a detecção de lesão renal aguda (LRA), mas os métodos de detecção atuais são inadequados, portanto, métodos mais rápidos, convenientes e precisos são necessários para detectar NGAL para diagnóstico precoce de AKI. Aqui, estabelecemos um imunoensaio de fluxo lateral rápido, confiável e preciso (LFIA) baseado em nanopartículas de európio (EU-NPS) para a detecção de NGAL em amostras de urina humana.

2. Métodos

Um ensaio de imunofluorescência sanduíche de duplo anticorpo usando nanopartículas dopadas com európio foi empregado e os anticorpos monoclonais NGAL (MAbs) conjugados como marcadores foram gerados otimizando os parâmetros de fusão elétrica. Oitenta e três amostras de urina foram usadas para avaliar a eficiência da aplicação clínica desse método.

3. Resultados

O intervalo de detecção quantitativa de NGAL em AKI foi {{0}} ng/mL, e a sensibilização de detecção foi 0,36 ng/mL. O coeficiente de variação (CV) intra-ensaio e inter-ensaio foi de 2,57-4,98 por cento e 4,11-7,83 por cento, respectivamente. Enquanto isso, o coeficiente de correlação entre os imunoensaios de fluorescência lateral baseados em nanopartículas de európio (EU-NPS-LFIA) e o analisador ARCHITECT foi significativo (R2=0.9829, n=83, p < 0,01).

4. Conclusões

Assim, foi estabelecido um ensaio quantitativo de operação mais rápida e fácil de NGAL para IRA, o que é muito importante e significativo para o diagnóstico precoce de IRA, sugerindo que o ensaio pode fornecer um alerta precoce do desfecho da doença.

Palavras-chave

lipocalina associada à gelatinase neutrofílica (NGAL), anticorpo monoclonal, imunoensaio de fluxo lateral, lesão renal aguda (LRA),Efeitos de Cistanche.

Clique aqui para saberquais são os benefícios do Cistanche

Introdução

A doença de coronavírus 2019 (COVID-19) se espalhou amplamente em escala mundial com sérios desastres [1]. A lesão renal aguda (LRA) tem uma taxa mais alta de morbidade e mortalidade em complicações comuns para doenças críticas e representa cerca de 5-7 por cento dos pacientes hospitalizados no mundo[2].- Vários estudos avaliaram o desenvolvimento de IRA como mais fortemente relacionado a piores resultados e taxas de mortalidade de COVID-19, descrevendo a incidência de LRA que varia amplamente de 0,5 a 36,6 por cento em pacientes com COVID-19[3]. A detecção precoce e o tratamento preciso da LRA podem implementar melhores estratégias preventivas e prevenir a deterioração da função renal e a insuficiência renal, contendo efetivamente a progressão de pacientes hospitalizados com COVID-19[4]. Entre eles, a lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos (NGAL) tem sido reconhecida como um dos candidatos a biomarcadores promissores para a detecção de LRA. NGAL é uma glicoproteína de 25 kDa associada à gelatinase de neutrófilos e geralmente existe em um nível mais baixo em tecidos humanos, como estômago, cólon e rim, mas sua expressão é dramaticamente aumentada no soro e na urina quando o rim está com lesão isquêmica ou nefrotóxica [5].

Os imunoensaios de fluxo lateral (LFIA) foram considerados como ensaios de triagem desejados devido à sua simplicidade, análise in situ e facilidade de trabalho [6]. O LFIA com micropartículas fluorescentes já foi utilizado para a detecção de vários patógenos microbianos e vários marcadores de inflamação [7, 8]. Várias novas nanopartículas têm sido geralmente aplicadas para melhorar a sensibilidade do LFIA, incluindo nanopartículas de carbono, pontos quânticos, corantes fluorescentes, nano rótulos magnéticos e nanopartículas de európio (EU-NPS) [9]. EU-NPS como portadores podem melhorar 100-contraste de sensibilidade de dobra com nanopartículas de ouro coloidal rotuladas em LFIA[10]. O EU-NPS tem uma longa vida útil de fluorescência e também está disponível com um tamanho médio de partícula de 75 a 100 nm, o grande deslocamento de Stokes, que geralmente é superior a 200 nm, é propício para evitar a interferência da luz espalhada causada pela medição da luz de excitação. O EU-NPS tem uma ampla banda de excitação, por isso é benéfico aumentar a energia de excitação, o pico de emissão nítido, fundo baixo e alta resolução, usado recentemente em imunoensaios do tipo sanduíche de diagnósticos médicos [11].

Aqui, estabelecemos um novo método com EU-NPS como rótulos de LFIA para a medição rápida, sensível e precoce de NGAL na urina com base em dois anticorpos monoclonais (MAbs) 1G1 e 2F4 que são descobertos por nosso laboratório. O método é um ensaio de imunofluorescência em sanduíche de anticorpo duplo usando conjugado EU-NPS e MAbs como rótulos. O mAb 1G1 foi conjugado com EU-NPS e o mAb 2F4 foi usado para capturar o complexo antígeno EU-NPS-1G1-na linha T. Nossos resultados mostraram que o EU-NPS-LFIA pode ser usado para detecção precoce de NGAL na urina e permitir melhorias no tratamento de pacientes com LRA.

cistanche tubulosa

Métodos

1. Expressão e purificação de NGAL

A sequência do gene NGAL humano do Genbank (NP{{0}}.2) foi sintetizada pelo Instituto de Genômica de Pequim (BGI) e adicionou as enzimas de restrição HindIII e XhoI em ambas as extremidades. Os plasmídeos foram digeridos com HindIII e XhoI e então clonados no vetor pSecTag2A. Os plasmídeos construídos foram sequenciados para confirmação sem mutação e então transformados em células de ovário de hamster chinês (CHO) pelo LipofectamineTM2000. Após 8 dias, o sobrenadante celular foi coletado após filtração em filtro de 0,45 μm. A proteína NGAL-6×His expressa foi purificada com a coluna de Ácido Nitrilotriacético de Níquel (Ni-NTA), e as diferentes frações foram coletadas e avaliadas por eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). O kit de quantificação de proteína de ácido bicinconínico (BCA) mediu a concentração de proteína.

A proteína recombinante purificada foi submetida a 12% de SDS-PAGE, depois adsorvida em uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF). Após a membrana ser bloqueada em tampão tris com solução de Tween-20 (TBST) a 1 por cento contendo 5 por cento de leite desnatado em temperatura ambiente (RT) por 2 h, incubada com anti-6×His tag conjugado com HRP anticorpo (1:5000) no escuro por 1 h à temperatura ambiente, visualizado com Benzidina após lavagem com TBST e visualizado pelo sistema de detecção de Western blotting Bio-Rad (DNR Bio-Imaging Systems Ltd., Israel).

2. Geração e purificação de MAbs

Na primeira imunização, os camundongos BALB/c fêmeas (idade de 6 semanas, um total de 10) foram imunizados com 50 µg de NGAL-6×His proteína recombinante emulsificada em igual dosagem de adjuvante completo de Freund e imunizados acessórios foram realizados com proteína emulsificada em adjuvante incompleto de Freund. Duas injeções hipodérmicas no dorso de camundongos e subsequentes injeções intraperitoneais espaçadas de 21 dias. As amostras de soro foram coletadas uma semana após a terceira injeção, e o título do anti-soro foi determinado com um ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) [12]. Três dias antes da fusão, os camundongos realizaram imunização de reforço com 50 µg de NGAL-6×His diluído com 0,9 por cento de NaCl.

As células de baço de camundongos imunes isoladas e as células de mieloma SP2/0 misturadas em uma proporção de 3:1 para fundir em uma câmara de fusão de eletrodo de platina LF498-3 (BEX Co., Ltd, Japão) conforme descrito na literatura[13]. Resumidamente, a célula mista foi lavada duas vezes com 10 mL de tampão de eletrofusão (0.3 M manitol, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, pH 7.2) e ressuspenso na concentração de 2 × 107 células/mL. A fusão foi concluída usando uma tensão de corrente alternada de 50 V a 0,8 MHz por 20 s, uma tensão de pulso de corrente contínua de 450 V de 2 repetições por 0,5 s e pós-fusão de 50 V a 0,8 MHz para 7 seg. Finalmente, a suspensão de células tratadas eletricamente foi movida da câmara de fusão para 4,5 mL de RPMI 1640 pré-aquecido (20 por cento de soro bovino fetal) por 30 min a 37 graus, depois cultivada em 96-placas de poços e incubada com 5 por cento CO2 a 37 graus. Após 24 h, hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) foi suplementada em cada poço. Os sobrenadantes da cultura celular foram rastreados por ELISA após 9 dias de fusão, e o número calculado de clones de hibridoma foi. Os camundongos BALB/c que foram previamente injetados com óleo de parafina foram inoculados com 1 × 106 de células de hibridoma NGAL, as ascites foram purificadas por coluna de Proteína A.

3. Identificação de MAbs

As subclasses de imunoglobulinas de anticorpos foram analisadas usando o kit de identificação de subclasses de anticorpos. O ELISA indireto rastreou os MAbs específicos usando proteína NGAL{{0}}×His recombinante purificada e proteína PCT- 6×His. A interação entre o antígeno e os anticorpos foi determinada com o sistema BIAcore T200 (GE Healthcare, Estocolmo, Suécia) em tampão HBS-EP (0,005 por cento de surfactante P20, 10 mM Hepes, pH 7,4, 3 mM EDTA, 150 mM de NaCl). O antígeno NGAL foi adsorvido em chips de biossensor CM5 atingindo 400-480 unidades de resposta (RU) por um kit de acoplamento de amina. Os anticorpos (2F4 e 1G1) foram diluídos em tampão HBS-EP foram passados ​​lentamente sobre o chip com 50 µL/min por 5 min, respectivamente, e posteriormente tampão HBS-EP foi injetado sobre o chip para monitorar a fase de dissociação por 4 min . Os chips sensores foram regenerados com solução de glicina (pH 3,0) após a fase de dissociação. Para cada analito passado pelo chip, as respostas específicas do canal de fluxo de antígeno podem subtrair respostas não específicas do canal de fluxo de controle. As curvas de ligação de saturação ajustadas foram plotadas com base nas concentrações de analito para respostas de ligação de equilíbrio para calcular KD.

Os MAbs anti-NGAL purificados foram analisados ​​em SDS-PAGE a 12 por cento em condições não redutoras e condições redutoras. Resumidamente, a amostra foi misturada com 5 x tampão não redutor ou 5 x tampão de carga de proteína e carregada em 12 por cento SDS-PAGE. A especificidade dos MAbs anti-NGAL foi determinada por Western Blot. As proteínas NGAL foram feitas para 12 por cento SDS-PAGE, então adsorvidas em uma membrana PVDF que foi ativada por imersão em metanol por 15 s, e então submetida às condições de eletroforese a 100 V por 2 h. Após o bloqueio em tampão Tris-HCl com solução de Tween-20 a 1 por cento (TBST) contendo 5 por cento de leite desnatado à temperatura ambiente por 2 h, a membrana foi incubada com MAbs anti-NGAL de camundongo como anticorpos primários a 4 graus. No dia seguinte, a membrana foi lavada com TBST e incubada com anti-camundongo HRP IgG conjugado no escuro por 1,5 h à temperatura ambiente. Finalmente, a membrana foi visualizada pelo sistema de detecção de Western blot de quimioluminescência aumentada (ECL).

4. Ensaios competitivos de imunoabsorção enzimática (ELISA)

Dois MAbs foram testados quanto à capacidade de reconhecer epítopos únicos em NGAL por cELISA. MAb foi conjugado com HRP usando o HRP Antibody Labeling Kit (Shanghai YSRIBIO industrial co., LTD), cuja concentração de trabalho foi testada através de ELISA direto. As placas de microtitulação {{0}}poço foram revestidas com 2 µg/mL de antígeno NGAL durante a noite a 4 graus, então o MAb não marcado (0,2 µg/poço, 2 µg/poço) foi ligado competitivamente com a razão de diluição ideal de MAb marcado com HRP e incubado por 1 h a 37 graus. A reação enzimática apareceu com peróxido de hidrogênio pelo substrato 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) e parou com ácido sulfúrico 2 M em todos os poços. A absorbância (OD450 nm) foi determinada por um leitor de microplacas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Inc). Os efeitos de bloqueio dos MAbs foram calculados usando a seguinte equação: 100×[1-OD_{450 milhas náuticas}de (HRP-MAb mais MAb)/OD450 nm de HRP-MAb]. Dois MAbs reconheceram diferentes epítopos se os efeitos de bloqueio foram observados em mais de 40 por cento.

extrato de cistanche

5. Conjugação de EU-NPS

Os anticorpos monoclonais Anti-NGAL 1G1 e 2F4 foram conjugados covalentemente com EU-NPS com o procedimento padrão dos Bangs Laboratories. Resumidamente, 100 µL EUNPS foram adicionados a 900 µL 0.05 M MES (pH 7.{{ 32}}) e disperso por ultrassom, vibrado por 15 min em temperatura ambiente na presença de {{40}},08 M ​​N-hidroxisulfossuccinimida (NHS) e 0,05 M 1-({{19 }}Dimetilaminopropil)-3-cloridrato de etil carbodiimida (EDC). O EUNPS ativado foi lavado com tampão de acoplamento (0,05 mM H3BO3, 0,04 mM Na2B4O7, pH 7,5) e reagiu com 0,3 mg de anticorpo por 2,5 h à temperatura ambiente. O composto conjugado de európio foi incubado em 1000 µL de tampão de bloqueio (10% BSA, 20% tween-20, 0,05 M Tris-HCl) por 1 h, adicionado a 1000 µL de soluções estoque (10% BSA, 20% trealose, 20 por cento tween-20, 0,05 M Tris-HCl ) para armazenar a 4 graus .

6. O desenvolvimento da LFIA

As tiras LFIA consistiam em uma membrana de nitrocelulose, almofada conjugada, almofada de amostra e almofada absorvente. As membranas de fibra de vidro foram embebidas no tampão de bloqueio (20 por cento trealose, 10 por cento BSA, 20 por cento tween-20, 0,05 M Tris, 3,2 mM EDTA.Na2, pH 8,6) por 1,5 h. A concentração de 1 mg/mL MAbs (2F4 ou 1G1) foi revestida na linha de teste (TL) da membrana de nitrocelulose, e IgG anti-rato de cabra 1 mg/mL foi revestida na mesma membrana NC a uma distância de 4 mm para formar uma linha de controle de qualidade (CL), o volume de pulverização do instrumento dispensador foi ajustado para 1 µL/cm. A membrana e o tapete de fibra de vidro foram secos por 48 horas a 45 graus antes de serem testados. As diferentes partículas conjugadas EU-NPS-1G1 e EU-NPS-2F4 foram revestidas na almofada conjugada e o sinal de fluorescência foi medido por um analisador de imunofluorescência (Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd).

7. Coleta de amostras de urina e pacientes

Um total de 83 amostras de urina humana de pacientes com LRA foram coletadas do Hospital Afiliado da Jilin Medical University. As diretrizes éticas foram rigorosamente cumpridas no experimento e foram fornecidas pelo Hospital Afiliado da Jilin Medical University (No.2018-LW029). Todos os indivíduos receberam consentimento informado oral e por escrito em chinês para o estudo de amostras de urina. Todos os experimentos foram realizados pela Declaração de Princípios Éticos de Helsinque. A idade média dos pacientes de 62 anos variou de 20 a 80 anos que não foram infectados por COVID-19, e os estágios 1–3 de IRA foram classificados de acordo com os critérios de IRA para Melhorar Resultados Globais da Doença Renal[14]. Amostras de urina foram coletadas para análise NGAL até 12 h antes do diagnóstico de LRA e em intervalos frequentes após a operação em vários pontos de tempo (12, 24, 48 h). Para minimizar possíveis fatores de confusão, as amostras de urina foram analisadas rapidamente no laboratório de química clínica, incluindo bioquímica da urina (concentrações totais de proteína < 1 g/dL, uréia < 12 g/dL, glicose < 1 g/dL, creatinina urinária < 1 g/dL , albumina < 2,5 g/dL, pH 4.5-9.0) e realizado em duplicata. Dentro de 30 min da coleta da amostra, eles foram centrifugados a 3000 rpm a 4 graus por 15 min. Um mínimo de 100 µL de sobrenadante foi dispensado em recipientes estéreis e armazenados a -80 graus para análises posteriores, para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.

A medição dos níveis de NGAL foi realizada usando um kit ARCHITECT de reagente de urina NGAL (Lisnamuck, Longford, Co. Longford, Irlanda) utilizando um formato de sanduíche não competitivo com detecção de sinal quimioluminescente. A NGAL urinária foi reconhecida por um anticorpo antifúngico que se ligou covalentemente a partículas paramagnéticas em reagente de micropartículas, e o conjugado de um segundo anticorpo anti-NGAL associado a acridínio. Seguindo as instruções do fabricante, o ensaio de calibração foi realizado na faixa de 0- 1500 ng/mL e a concentração de NGAL foi medida.

8. Teste e análise de amostras clínicas

As concentrações seriadas do antígeno padrão NGAL (10, 50, 100, 200, 400, 800, 1500, 2000 e 3000 ng/mL) foram preparadas usando FBS para fortalecer reações específicas do bioconjugado, cada concentração fez três réplicas. Depois que as amostras clínicas foram adicionadas às almofadas de amostra, os resultados da intensidade de fluorescência na linha T (HT) e na linha C (HC) foram registrados pelo leitor. A detecção quantitativa foi completada pela razão HT/HC para eliminar efetivamente as diferenças das tiras (T e C) e os efeitos da matriz padrão da amostra matemática[15]. A curva padrão foi traçada contra cada concentração de NGAL e razão HT/HC.

9. Análise estatística

A análise de regressão Passing-Bablok e o gráfico de BlandAltman foram realizados pela análise de variância (ANOVA) dos softwares MedCalc e SPSS 17.0. Todos os dados foram apresentados como valores médios com desvio padrão (média ± DP ).

Comprimidos Cistanche

Referências

1. Zheng X, Zhao Y, Yang L: Lesão Renal Aguda na COVID-19: A Experiência Chinesa. Seminários em nefrologia 2020, 40(5):430–442.

2. Mandelbaum T, Scott D, Lee J, Mark R, Malhotra A, Waikar S, Howell M, Talmor D: Resultados de pacientes gravemente enfermos com lesão renal aguda usando os critérios da Acute Kidney Injury Network. Medicina de cuidados intensivos 2011, 39(12): 2659–2664.

3. Al-Hwiesh A, Mohammed A, Elnokeety M, Al-Hwiesh A, Al-Audah N, Esam S, Abdul-Rahman I: tratamento bem-sucedido de três pacientes com lesão renal aguda secundária a COVID-19 por diálise peritoneal : Relato de caso e análise literária. Diálise peritoneal internacional 2020, 40(5):496–498.

4. Shabaka A, Rovirosa-Bigot S, Guerrero Márquez C, Alonso Riaño M, Fernández-Juárez G: Lesão renal aguda e síndrome nefrótica secundária à glomeruloesclerose segmentar focal-19-associada à COVID. Nefrologia 2021. See More

5. Gabbard W, Milbrandt E, Kellum J: NGAL: uma ferramenta emergente para prever a gravidade da IRA é facilmente detectada por um ensaio clínico. Cuidados críticos 2010, 14(4): 318.

6. Zuk R, Ginsberg V, Houts T, Rabbie J, Merrick H, Ullman E, Fischer M, Sizto C, Stiso S, Litman D: Imunocromatografia enzimática – um imunoensaio quantitativo que não requer instrumentação. Química clínica 1985, 31(7): 1144–1150.

7. Juntunen E, Myyryläinen T, Salminen T, Soukka T, Pettersson K: Desempenho de nanopartículas fluorescentes de európio (III) e repórteres de ouro coloidal em ensaio de bioafinidade de fluxo lateral. Bioquímica analítica 2012, 428(1):31–38.

8. Swanson C, D'Andrea A: Ensaio de fluxo lateral com corante infravermelho próximo para detecção multiplex. Química clínica 2013, 59(4):641–648.

9. Chen Y, Fu Q, Xie J, Wang H, Tang Y: Desenvolvimento de um ensaio de fluxo lateral de supressão fluorescente baseado em pontos quânticos de alta sensibilidade para a detecção de zearalenona. Química bioanalítica analítica 2019, 411(10): 2169–2175.

10. Zhang F, Zou M, Chen Y, Li J, Wang Y, Qi X, Xue Q: Tiras imunocromatográficas marcadas com lantanídeos para detecção rápida de Pantoea stewartii subsp. Stewart. Biosensors bioelectronics 2014, 51:29–35.

11. Nankoberanyi S, Mbogo G, LeClair N, Conrad M, Tumwebaze P, Tukwasibwe S, Kamya M, Tappero J, Nsobya S, Rosenthal P: Validação do ensaio de microesfera fluorescente de reação de detecção de ligase para a detecção de polimorfismos mediadores de resistência de Plasmodium falciparum em Uganda. Jornal da Malária 2014, 13:95.

12. Xu H, Dong Y, Guo J, Jiang X, Liu J, Xu S, Wang H: Produção de anticorpos monoclonais e o desenvolvimento de um ensaio imunoenzimático competitivo indireto para triagem da toxina T-2 no leite. Toxico 2018, 156:1–6.

Moli Yin1, Yuanwang Nie2, Hao Liu2, Lei Liu1, Lu Tang1, Yuan Dong2, Chuanmin Hu1 e Huiyan Wang1

1 Jilin Colaborativo Inovação Centro for Anticorpo Engenharia, Jilin Medical University, 132013 Jilin, PR China.

2 Academia de Laboratório, Jilin Medical University, 132013 Jilin, PR China.