PARTE 2 Isolamento e identificação de feniletanóides glicosides da Aloysia Polystachya e sua atividade como inibidores da monoamina oxidase-A

Qual é a razão pela qual o Cistanche Actosides pode inibir a atividade enzimático?

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Separação e identificação de constituintes por ultra-performance de cromatografia líquida-massa espectrometria

Análises cromatográficas foram realizadas por meio de uma Absolvição de Águas Sistema UPLC Classe H equipado com um detector de matriz de diodo (PAI) e um espectrômetro de massa quadrupole tandem Waters Xevo TQ-S com uma fonte de spray Z operando no modo íon negativo. Soluções de ações contendo 1,0mg/mL de extrato ou as normasacteoside,isoacteoside, 6'-acetilacteoside, e 4',4''',5''-tetrahidroxy-6,6'',3'''-trimethoxy-[C7-O-C7'''/Biflavona em metanol de grau LC foram preparados separadamente, com sônica para 30min cada quando necessário, e filtrado através de filtros millipore de 0,45μm (Merck Millipore). As soluções foram diluídas para 10μg/mL com metanol e alíquotas (5μL) foram injetados em uma coluna Sigma-Aldrich Ascentis Express C18 (100×4,6 mm i.d.; tamanho de partícula de 2,7μm). A fase móvel consistia de água contendo 0,1% de ácido fórmico (solvente A) e metanol contendo 0,1% de ácido fórmico (solvente B) fornecido a uma taxa de fluxo de 0,5mL/min de acordo com o perfil de eluição: isocrático com 3% B entre 0 e 4min, seguido por gradientes lineares de 3 a 60% B entre 4 e 19min e de 60 a 90% B entre 19 e 23min, e finalmente retornou a 3% B entre 23 e 28min. O efluente foi monitorado pelo PAI na faixa de 210 a 720nm e por MS com a fonte otimizada e parâmetros operacionais da seguinte forma: tensão capilar 2,50 kV, temperatura da fonte Z-spray 150 °C, desolação temperatura (N2) 350 °C, fluxo de gás desolvação 600 L/h, e massa gama de m/z 150 a 600 no modo de varredura completo.

Purificação de constituintes identificados

O extrato hidroetanolico bruto (10 g) foi dissolvido em água: etanol (50:50; v/v) e particionado consecutivamente contra hexano, acetato etílico e n-butanol. A fração butanol foi concentrada em um evaporador rotativo e uma amostra de 3g do extrato fracionado foi aplicada a uma coluna de vidro (10 × 3 cm o.d.) preenchida com gel de sílica RP C-18 (malha 230-400; Sigma-Aldrich) e eluido com água, seguido por sucessivas misturas de água: metanol (90:10, 50:50 e 10:90; v/v). A subfração obtida por elução com água: metanol (90:10; v/v) foi ainda purificado pelo RP-HPLC usando um Sistema Shimadzu LC-20AP acoplado a um detector SPD-20A UV/Vis e equipado com uma coluna Phenomenex Luna® C-18 (250 × 10 mm i.d.; 5 μm tamanho de partícula). A fase móvel foi a água: metanol começando às 90:10 (v/v) e mudando para 30:70 (v/v) em 100 min para produzir os quatro compostos conhecidosacteoside(750 mgs), lado isolado (430 mgs), 6'-acetilacteoside(42 mgs) e 4',4''',5''-tetrahidroxy-6,6''',3'''-trimethoxy-[C7-O-C7'''-biflavona (13 mgs). A vazão da fase móvel foi de 1 mL/min, o volume de injeção foi de 500 μL, o cromatógrafo foi registrado em 340 nm e o espectro UV foi obtido na faixa de 240 a 400 nm. As identidades dos constituintes purificados foram confirmadas a partir de seus espectrômetros 1S- (500 MHz) e 13C-NMR (125 MHz) registrados em um espectrômetro bruker modelo DPX 500, e comparação dos dados com os disponíveis na literatura [18, 19, 41]. As purezas dos compostos isolados foram confirmadas pela UPLC-DAD-MS ( ▶Figo. 1b-d) e NMR ( ▶Figo. S1-S12, Informações de suporte).

Quantificação deacteosidepor um detector de matriz HPLC-diodo

Uma amostra (1 mg) do extrato hidroetodâneo seco foi redissolved em 1 mL de uma mistura (80:20; v/v) de metanol (grau J.T. Baker HPLC) e água Milli-Q Ultrapure (Merck Millipore), sonicada por 30 min, e filtrada através de um filtro milpore de 0,45-μm. As alíquotas (20 μL) desta solução foram analisadas em um sistema Shimadzu LC-10APvp acoplado a um PAI SPD-M10Avp e equipado com uma coluna Phenomenex Luna C18 (250 × i.d., 4,6 mm, 5 μm) protegido por um pré-cólumn Phenomenex C18 (4,0 × 3,0 mm i.d., 5 μm). As separações foram realizadas à temperatura ambiente (22 ± 1 °C) utilizando uma fase móvel composta por ácido acético 0,1 % em água (solvente A) e metanol (solvente B;

J.T. Baker HPLC grau) fornecido a uma taxa de fluxo constante de 1,0 mL/ min de acordo com o programa: gradiente linear de 10 a 70 % B entre 0 e 32 min, de 70 a 10 % B entre 32 e 35 min, e uma eluição isocrática final com 10 % B entre 35 e 40 min. O comprimento de onda de detecção foi definido em 330 nm.

O conteúdo deacteosideno extrato foi estimado usandoacteoside(Sigma-Aldrich; CAS nº 61276-17-3) como padrão externo. Foram preparadas soluções contendo 500, 250, 125, 62,5, 31,2 e 15,6 μg/mL do padrão de referência, e as curvas de calibração foram construídas submetendo cada solução à análise HPLC em triplicado [42]. A razão de pico de área de padrãoacteosideà concentração correspondente de analito foi estabelecida através da regressão linear das curvas padrão ( ▶Figo. S13, Informações de suporte). Os dados analíticos foram validados com relação à linearidade, precisão e precisão de acordo com as diretrizes emitidas pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária [42]. Limites de detecção (LoD) e quantitação (LoQ) deacteosideforam 0,30 e 0,92 μg/mL, respectivamente.

Ensaios de inibição da monoamina oxidase-A

Humano recombinante MAO-A, tiramina, clorgyline, ácido vanlílico, antipirina de 4 amino e peroxidase de rabanete foram comprados da Sigma-Aldrich. Os ensaios de inibição mao-A foram realizados utilizando-se placas de 96 poços seguindo uma versão modificada do método descrito por López et al. [43]. Cada poço foi carregado com 50 μL de solução cromogênica (ácido vanlímico de 0,8 mM, 2,5 mM 4-amino antipirina, e 4 U/mL peroxidase de rabanete em tampão fosfato no pH 7.6), 100 μL de 3 mM de tiramina, e uma alíquota de 50-μL do extrato hidroetoanólico bruto ou um dos feniletanoides purificados dissolvidos inthan meol. Finalmente, 50 alíquotas de 8 U/mL MAO-A foram adicionadas a cada um dos poços e a placa foi incubada a 37 °C por 30 min, durante as quais foram registradas absorções de tempo a cada 5 minutos usando um leitor de microplaca. Clorgyline ( ≥ 97 % GC; Sigma-Aldrich) e metanol foram incluídos como controles positivos e negativos, respectivamente, em cada placa de ensaio.

Análise estatística

Foram realizadas três avaliações independentes das atividades inibitórias do MAO-A e analisadas as dados adquiridos por meio do software Graph-Pad Prism. O IC₅₀os valores do extrato hidroeonâneo, os feniletanoides purificados e o controle positivo foram calculados por regressão não linear, simulando parcelas de tronco (concentração inibidora) versus inibição percentual normalizada.

Informações de suporte

Espectros H e 13C-NMR deacteoside, isoacteoside, 6'-acetylacteoside, e 4,4,5,5-tetrahidroxia-6,6,3 trimethoxy-[C7-O– C7'''-biflavona e HSQC/HMBC análises de correlação para os três feniletanoides estão disponíveis como Informações de Suporte.

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