Parte 2 Mutações ERCC1 impedem o reparo de danos no DNA e causam disfunção hepática e renal em pacientes

Contato:ali.ma@wecistanche.com

Clique aqui para a parte 1

Parte 2

Clique para Cistanche NZ para doença renal

Discussão

Um novo caso de bialélicoERCC1mutações Apenas dois indivíduos com bialélicaERCC1mutações foram relatadas até o momento, ambas exibindo características semelhantes a CS. O indivíduo mais gravemente afetado (165TOR) teve uma variante nonsense (Q158X) e uma variante missense F231L no motivo (HhH)2 de ERCC1 (Fig. S5 F), apresentou retardo de crescimento, falha de desenvolvimento e contraturas, e morreu após o primeiro ano de vida por pneumonia (Jaspers et al., 2007). O segundo indivíduo afetado (CS20LO) apresentava contraturas, microcefalia e hipertonia e era homozigoto para a variante F231L missense e faleceu no segundo ano de vida (Kashiyama et al., 2013).

Relatamos dois irmãos com bialélicaERCC1mutations—a paternally inherited missense variant (p.R156W; c.466C>T) e um alelo nulo devido a uma deleção intragênica herdada materna. Toda a proteína ERCC1 restante expressa nas células desses pacientes carrega a substituição de aminoácidos R156W, que rompe uma ponte salina entre o resíduo R156 carregado positivamente e o resíduo D129 carregado negativamente oposto localizado logo abaixo da bolsa de ligação a XPA no domínio central deERCC1. O impacto dessa substituição é duplo: (1) diminui fortemente a estabilidade geral de ERCC1 e seu parceiro de ligação XPF e (2) afeta especificamente a interação com XPA (Fig. 9).

Níveis de proteína nuclear reduzidos de ERCC1 devido ao dobramento incorreto parcial

Western blot e análises de imunofluorescência revelaram que aERCC1and XPF protein levels are dramatically reduced to below 20% of WT levels in the fibroblasts from both siblings. This effect is also recapitulated by the bi-allelic KI of the missense mutation (p.R156W; c.466C>T) no endógenoERCC1locus de células RPE1-hTERT. Curiosamente, a perda completa de ERCC1 em camundongos levou à morte em 4 semanas, enquanto o aumento dos níveis de proteína para cerca de 15% dos níveis em camundongos WT aumentou cinco vezes a expectativa de vida (Weeda et al., 1997), sugerindo que mesmo níveis baixos de ERCC1 aumentar consideravelmente o potencial de viabilidade. Consistente com nossos achados, estudos anteriores mostraram que mutações missense no domínio central deERCC1geralmente causam desestabilização (Sijbers et al., 1996b), indicando que esta região é importante para a estabilidade da proteína.

A estrutura de microscopia eletrônica criogênica recentemente relatada doERCC1-XPF heterodímero (Jones et al., 2020) revela que oERCC1R156resíduo está localizado na borda do heterodímero. Especulamos que o aumento do volume e a alteração da estrutura eletrônica da substituição de uma arginina por triptofano não só perturba a bolsa de ligação de XPA, mas também a interface de dimerização entre o domínio central de ERCC1 e o domínio de nuclease de XPF, causando desestabilização geral (Fig. S5F). De interesse, a variante missense XPFR799W está localizada na mesma interface no lado XPF (Fig. S5 F) e também resulta em desestabilização e níveis de proteína XPF severamente reduzidos (Mori et al., 2018). Em um indivíduo afetado (CALIF1010) que apresentou características progeroides segmentares e semelhantes a CS, a variante XPFR799W foi herdada juntamente com uma deleção intergênica no outro alelo XPF, resultando em um forte defeito do NER combinado com um defeito leve no reparo do ICL (Mori et. al., 2018), semelhante aos irmãos relatados neste estudo.

Expressão ectópica de uma versão induzível deERCC1R156Wpor 24 h nos permitiu atingir níveis de WT dessa proteína mutante, o que resultou em má localização no citoplasma, redução da interação com XPF e aumento da interação com chaperonas de dobramento de proteínas, conforme detectado por MS. Todas essas descobertas dão suporte à noção de queERCC1R156Wé parcialmente dobrado e degradado nas células do paciente, resultando em uma redução de -80 por cento nos níveis de proteína nuclear ERCC1. KI de ERCC1R156W em células RPE1-hTERT suporta esta conclusão.

Ao comparar oERCC1e níveis de proteína XPF em células PV46LD e PV50LD com aqueles em células de indivíduos mais gravemente afetados (165TOR e CS20LO), notamos que esses níveis eram comparáveis, ou talvez até menores, em células dos irmãos descritos neste estudo (Fig. 3 C e Fig. S3, E e F; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). Observe que CS20LO é homozigoto para ERCC1F231L, enquanto 165TOR é heterozigoto e carrega uma parada prematura adicional no outroERCC1alelo (Q158X). Esses achados sugerem que, além dos níveis proteicos reduzidos, a funcionalidade da proteína mutante que ainda é expressa e a combinação dos dois alelos mutados precisam ser levadas em consideração como um potencial modulador da gravidade e expressividade fenotípica.

ERCC1R156W: Impacto diferencial nas vias de reparo de DNA dependentes de ERCC1-

A expressão de ERCC1R156W-GFP em células ERCC1-KO em níveis semelhantes a ERCC1WT nos permitiu separar o impacto da substituição de aminoácidos na estabilidade da proteína do impacto na funcionalidade da proteína. Enquanto a proteína mutante ERCC1R156W foi severamente prejudicada em sua interação induzida por UV com XPA e peixes e não conseguiu localizar eficientemente em locais de lesões de DNA induzidas por UV, ainda detectamos atividade de reparo considerável (~40%) em ensaios UDS, sobrevivências clonogênicas, e ensaios de NER in vitro. Esses achados sugerem que uma proteína mutante ERCC1 que interage muito fracamente com o complexo NER ainda pode suportar níveis consideráveis ​​de atividade de NER (~40%) dentro das células. Juntos, esses achados sugerem que o baixo nível de expressão de ERCC1 (~20 por cento) combinado com a atividade residual de GGR das proteínas mutantes que ainda são expressas fornece proteção suficiente para evitar que PV46LD e PV50LD desenvolvam XP completo. De fato, a atividade residual de GGR ainda foi detectada em condições mais sensíveis em ensaios UDS quando comparados com fibroblastos de um paciente XP-A severamente afetado e propenso ao câncer. No entanto, ambos os pacientes ainda podem estar em risco de desenvolver câncer de pele e, portanto, a proteção contra a luz solar é recomendada. A atividade residual nas células PV46LD e PV50LD foi semelhante ou inferior à atividade de reparo que detectamos em células 165TOR ou CS20LO (Fig. 6 J; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). A gravidade clínica, portanto, não se correlaciona com a atividade do NER, mas é provavelmente devido a um papel de ERCC1 fora do NER que é importante durante o desenvolvimento.

Apesar de nossas descobertas de que ERCC1R156W mostrou uma interação reduzida com SLX4 e também foi recrutado de forma menos eficiente para locais de indução de ICL local, análises posteriores revelaram que a proteína mutante ERCC1R156W foi apenas levemente afetada no suporte ao reparo de ICL quando expressa ectopicamente em ERCC1- Células KO. No entanto, o impacto no reparo de ICL foi muito mais leve do que o impacto da substituição R156W no NER, que, combinado com descobertas anteriores de que o reparo de ICLs requer muito menos proteína ERCC1 do que o reparo de lesões de DNA específicas de NER (Jaspers et al. , 2007; Sijbers et al., 1996b), pode muito bem explicar o leve impacto no reparo do ICL. Em fibroblastos de pacientes, que têm níveis fortemente reduzidos de ERCC1, detectamos sensibilidade moderada, bem como maior quebra cromossômica após exposição ao composto indutor de ICL MMC, embora muito mais suave do que células de um paciente com FA que foram incluídas em paralelo. É importante ressaltar que nem PV46LD nem PV50LD apresentaram sinais evidentes de características clínicas semelhantes a FA, sugerindo que a proteína mutante ERCC1R156W fornece proteção suficiente contra a baixa carga endógena de ICL nesses pacientes.

A deficiência de ERCC1 causa insuficiência hepática e renal

Camundongos que são KO para ERCC1 ou XPF mostram corrida severa (ou seja, menores e mais fracos do que camundongos WT) e morrem antes das primeiras 4 semanas de vida devido a insuficiência hepática grave (McWhir et al., 1993; Sijbers et al., 1996b; Tian et al., 2004; Weeda et al., 1997). A expressão específica do fígado de ERCC1 nesses camundongos corrigiu parcialmente o tamanho menor e a vida útil estendida até 12 semanas, mas também desmascarou gravesdisfunção renale insuficiência renal como causa secundária de morte (Selfridge et al., 2001). Camundongos KO específicos para XP ou FA não apresentam doença hepática, sugerindo que este fenótipo não é causado por um defeito de reparo de NER ou ICL. É possível que a redundância parcial entre essas duas vias, que é perdida em camundongos ERCC1-KO deficientes em ambas as vias, possa explicar esse fenótipo. De acordo com essa ideia, hepatócito ecélulas do túbulo proximal do rimtornou-se poliplóide em camundongos ERCC1-KO e acumulou altos níveis de p53 (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997), sugerindo que o acúmulo de danos endógenos ao DNA nesses órgãos pode ocorrer. A natureza precisa desta lesão de DNA endógeno, no entanto, permanece obscura.

Curiosamente, camundongos com inativação conjunta de reparo de NER e ICL não apresentam disfunção hepática, sugerindo que a redundância entre essas vias de reparo de DNA não é a única explicação e que uma função adicional de ERCC1-XPF fora dessas vias de reparo de DNA contribui ao comprometimento hepático (Mulderrig e Garaycoechea, 2020). É possível que ERCC1-XPF esteja envolvido em vias de reparo de DNA adicionais que lidam com danos endógenos ao DNA. Por exemplo, ERCC1-XPF foi recentemente mostrado para atuar em estruturas alternativas de DNA, como Z-DNA, durante as quais coopera com proteínas de reparo de incompatibilidade em vez de fatores de reparo de NER ou ICL (McKinney et al., 2020). Além disso, ERCC1-XPF mostrou estar envolvido em uma subvia de reparo de excisão de base junto com a RECQ1 helicase (Woodrick et al., 2017).

Os dois irmãos (PV46LD e PV50LD) neste estudo apresentaram déficit de crescimento, baixa estatura e falta de gordura subcutânea, lembrando o pequeno tamanho observado em camundongos ERCC1-KO (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997). Além disso, os irmãos desenvolveram insuficiência hepática com quadro predominantemente colestático que levou ao transplante ortotópico de fígado antes dos 9 anos de idade. Essa intervenção evitou claramente a morte precoce, mas não melhorou o déficit de crescimento, como evidenciado pelo crescimento pós-transplante de peso, altura e perímetro cefálico bem abaixo do terceiro percentil.

De interesse, a doença hepática colestática foi relatada como uma característica comum em pacientes egípcios com SC, sugerindo que isso deve ser monitorado mais de perto em pacientes com SC de outras origens étnicas para ver se esta é uma característica mais comum do que anteriormente reconhecido (Abdel Ghaffar et al. , 2011). Embora nenhuma anormalidade hepática tenha sido descrita em pacientes com XP, existem alguns casos de citólise hepática (quebra ou ruptura celular) em pacientes com AF (Masserot-Lureau et al., 2012), que podem ser distintos das anormalidades hepáticas observadas no ERCC 1- irmãos deficientes. O exame histológico de uma biópsia hepática do irmão mais velho (PV50LD) revelou alterações na morfologia dos hepatócitos com aumento e variabilidade nuclear, como observado nos camundongos com deficiência de ERCC1-(Fig. S1 D; N´uñez et al., 2000 ).

A segunda causa de morte em camundongos ERCC1-KO com expressão hepática específica de ERCC1 foi gravefalência renal(Selfridge et al., 2001). Ambos os irmãos também apresentam disfunção renal, com características sugestivas de disfunção tubular proximal levando arimimparidade. No entanto, a função tubular estabilizou após o transplante de fígado, masrimfunçãorequer monitoramento contínuo. O fenótipo renal dos camundongos ERCC1- KO—com túbulos dilatados contendo material proteico vazado consistente com uma tubulopatia (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997)—é semelhante ao dos pacientes descritos em nosso estudo. Além disso, insuficiência renal e, em alguns casos, insuficiência foram relatadas em XP/CS combinados (Ben Chehida et al., 2017; Kondo et al., 2016; Kralund et al., 2013), bem como CS (Funaki et al. ., 2006; Reiss et al., 1996; Sato et al., 1988), enquanto uma associação entre AF e anomalias estruturais dorimhas also been reported (Sathyanarayana et al., 2018). The phenotype in these siblings is distinct from prior reports of individuals with biallelic ERCC1 mutations and also distinct from the known phenotypic entities, CS and XP. Neither individual had features suggestive of FA. There may be parallels between the phenotype of these siblings and a previously reported individual with biallelic ERCC1 mutations (XP2020DC; p.K266X; IVS6-26G>A) que morreu aos 37 anos de idade (Gregg et al., 2011; Imoto, K., et al. 2007. Pacientes com defeitos nas proteínas de reparo por excisão de nucleotídeos ERCC1 ou XPF apresentam xeroderma pigmentoso com degeneração neurológica grave de início tardio [Resumo] J. Invest. Dermatol. 127:S92). Embora nenhum comprometimento hepático tenha sido relatado, esse paciente desenvolveu atrofia cerebral grave aos 15 anos, que evoluiu para neurodegeneração progressiva com demência. Atrofia cerebral leve também foi observada em ambos os irmãos aos 13 e 11 anos, indicando que o desenvolvimento neurológico de ambos os irmãos deve ser monitorado cuidadosamente.

A previously reported 15-yr-old boy with bi-allelic XPF mutations (XP51RO; p.R153P; c.458G>C; Jaspers et al., 2007; Niedernhofer et al., 2006) apresentou um fenótipo com alguma sobreposição com os irmãos aqui relatados, incluindo fotossensibilidade sem câncer de pele, baixa estatura, falta de gordura subcutânea, atraso no desenvolvimento e insuficiência renal (Niedernhofer et al., 2006). Diferente dos irmãos relatados aqui, este menino apresentava características progeroides segmentares pronunciadas, mas um quadro hepático muito mais leve sem colestase. Os irmãos relatados aqui demonstram que as mutações bi-alélicas do ERCC1 podem causar um espectro de fenótipos, desde o tipicamente observado na SC até um fenótipo que inclui baixa estatura mais leve, fotossensibilidade e fígado e fígado graves.rimimparidade, potencialmente devido a um forte impacto combinado no NER e um impacto simultâneo no reparo do ICL, que pode afetar particularmente esses órgãos.

Materiais e métodos

Todos os procedimentos realizados neste estudo estão de acordo com os padrões éticos e foram aprovados pelo Comitê de Ética Humana do Royal Children's Hospital, Melbourne, Victoria, Austrália (HREC36291C) e pelo Comitê Nacional do Serviço de Ética em Pesquisa do Reino Unido North East–Newcastle e North Tyneside 2. Os pacientes foram recrutados em Programas de Doenças Não Diagnosticadas para pacientes pediátricos com supostos distúrbios mendelianos "órfãos". Amostras de saliva ou sangue dos pacientes e seus familiares foram coletadas para extração de DNA genômico após o consentimento informado por escrito. Os pais deram permissão para mostrar fotografias não editadas dos irmãos afetados na Fig. 1 A.

Next-generation sequencing (NGS) DNA extracted from the blood of both affected siblings and unaffected parents was subjected to exome capture and sequencing through Oxford Gene Technologies Ltd. Genomic data were analyzed using a custom-made in-house pipeline using an autosomal recessive disease model. A paternally inherited missense variant in NM_202001.2 (ERCC1), g.45922415G>A, c.466C>T foi identificado em ambos os indivíduos afetados no exon 4 de 8 do gene ERCC1. Na interrogação inicial dos dados do exoma em ambos os indivíduos afetados, essa variante parecia estar em um estado homozigoto, mas estava presente em um estado heterozigoto no pai e ausente na mãe, sugerindo uma possível deleção no alelo materno. A variante missense está presente no banco de dados gnomAD com uma frequência de 0,01 por cento (22 heterozigotos, nenhum homozigoto) e não foi relatada anteriormente em indivíduos afetados. A variante missense foi depositada no banco de dados LOVD (http://www.LOVD.nl/ERCC1_000020 e http://www.LOVD.nl/ERCC1_000021) e no banco de dados ClinVar ( ID de variação: 978472).

Detecção da deleção por qPCR

Para detectar a deleção, o DNA genômico foi extraído de linfócitos/células epiteliais, e a região relevante do gene ERCC1 foi amplificada em uma qPCR. qPCR foi realizado usando sondas e primers específicos (listados na Tabela S1) projetados usando o Universal ProbeLibrary Assay Design Center (Roche) e sintetizados pela Sigma-Aldrich. Os primers foram projetados para incluir a região deletada no exon 4 e uma região dentro do gene que não é deletada como um controle (exon 5). Uma qPCR multiplex usando a mistura de reação LightCycler R 480 Probes Master (Roche) foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante para amplificar e quantificar a região do gene ERCC1, usando o gene CFTR (exon 27) como padrão interno (Tabela S1). A qPCR foi realizada no instrumento LightCycler R 480 (Roche), e a análise dos dados foi realizada usando o software LightCycler R 480 versão 1.5.0 (Roche). As diretrizes do American College of Medical Genetics foram seguidas para a interpretação da variação da sequência.

Detecção da variante missense por sequenciamento de Sanger

O DNA genômico foi isolado por ressuspensão de pellets de células em tampão de lisado de célula inteira (50 mM KCL, 10 mM Tris, pH 8.0,25 mM MgCl2, {{12}) },1 mg/ml de gelatina, 0,45 por cento de Tween-20 e 0,45 por cento de NP-40) contendo 0,1 mg/ml de Proteinase K (EO0491; ThermoFisher Scientific) e incubando por 1 h a 56 graus seguido por 10-min de inativação por calor da Proteinase K a 96 graus. Fragmentos de ~1 kb abrangendo as mutações missense foram amplificados por PCR (os primers de sequenciamento estão listados na Tabela S1) seguidos pelo sequenciamento de Sanger usando o primer direto ou reverso.

Linhas de celular

Linhas celulares de fibroblastos foram estabelecidas a partir de biópsias de pele de indivíduos afetados e pais. Todas as linhas celulares (listadas na tabela S2) foram cultivadas a 37 graus em uma atmosfera de 5 por cento de CO2 índio (Thermo Fisher Scientific) suplementado com penicilina/estreptomicina (Sigma-Aldrich) e 10 por cento de FBS (Bodinco BV). Todas as linhagens celulares foram rotineiramente testadas para infecção por micoplasma.

Imortalização de fibroblastos com hTERT

Os fibroblastos WT (48BR) e PV50LD foram imortalizados por nucleofecção de p Babe-Neo-TERT (Addgene Plasmid #1774) usando o Amaxa Nucleofector (programa U23). Cada eletroporação continha 400 000 fibroblastos e 2,5 µg de DNA de plasmídeo. Após a eletroporação, as células foram semeadas em frascos de cultura de tecidos 25-cm2 contendo 5 ml de DMEM e 10% de FBS. Após 2 dias, o meio de cultura foi substituído por um meio contendo 20 µg/ml de neomicina.

/estreptomicina (Sigma-Aldrich) e 10 por cento de FBS (Bodinco BV). Todas as linhagens celulares foram rotineiramente testadas para infecção por micoplasma.

Construções de plasmídeo

All plasmids used in this study are listed in Table S3. The GFP gene in pERCC1-GFP-N1 (Houtsmuller et al., 1999) was replaced with m Venus (a gift of Joachim Goedhart, Amsterdam, Netherlands) using AgeI and BsrGI. The GFP-NLS gene (Luijsterburg et al., 2017) was inserted into pcDNA5-FRT-TO-Puro. The ERCC1-m Venus cassette was amplified by PCR (see Table S1 for primers) and inserted as a NheI and BspEI fragment into plenty-CW57-TO-GFP digested with NheI and AgeI to generate plenty-CW57-TO-ERCC1WT-mVenus. Overlap PCR was used to introduce the c.466C>Mutações T em ERCC1. O produto de PCR de sobreposição foi inserido como um fragmento NheI e AgeI para gerar bastante CW57-TO-ERCC1R156W-mVenus. ERCC1WT e ERCC1R156Wforam inseridos como fragmentos NheI e AgeI no pcDNA5-FRT-TO Puro-EGFP-N1 para gerar pcDNA5-FRT-TO-Puro-ERCC1WT-EGFPe pcDNA5-FRT-TO -Puro-ERCC1R156W-EGFP. A mutagênese direcionada ao local foi usada para introduzir mutações pontuais em pMacro Bac-XPF-ERCC1WT usando o kit de mutagênese KOD-plus (Toyobo) conforme descrito no protocolo do fabricante, usando os primers listados na Tabela S1. Todas as sequências foram verificadas por sequenciação de Sanger.

Geração de célula KO

linhas para gerar KOs únicos, células U2OS(FRT) e RPE1-hTERT (PuroR/TP53-dKO) foram cotransfectadas com pLV-U6g-PPB codificando um RNA guia do Leiden University Medical Center/Sigma -Biblioteca Aldrich de guia único de RNA (sgRNA) (consulte a Tabela S3 para plasmídeos e a Tabela S4 para sequências de sgRNA) visando o gene ERCC1 juntamente com um vetor de expressão que codifica Cas9-2A-GFP (pX458; Addgene #48138) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). As células U2OS (FRT) transfectadas foram selecionadas em puromicina (1 µg/ml) por 3 d e plaqueadas em baixa densidade, após o que os clones individuais foram isolados. As células RPE1-hTERT transfectadas foram classificadas por FACS em BFP/GFP e plaqueadas em baixa densidade, após o que os clones individuais foram isolados. Os clones KO foram verificados por análise de Western blot. A ausência de integração de Cas9/expressão estável foi confirmada por Western blot.

Geração de linhas celulares estáveis

Um único clone ERCC1 KO no fundo U2OS(FRT) (ver tabela S2) foi usado para expressar de forma estável ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP ou GFP-NLS por cotransfecção de pcDNA5-FRT-TO-Puroplasmid que codifica estes cDNAs (2 µg), juntamente com o plasmídeo pOG44 que codifica a recombinase Flp (0,5 µg). Uma população de células policlonais foi obtida após seleção em 1 µg/ml de puromicina e 4 µg/ml de blasticidina S. A expressão das proteínas ERCC1 marcadas com GFP ou GFP-NLS foi induzida pela adição de 2 µg/ml de doxiciclina por 24 h.

Geração de linhagens de células KI

Para gerar KIs homozigotos, as células RPE{{0}}hTERT foram primeiro tratadas por 30 min com 1 µM de inibidor de DNA-PK (NU7441) para suprimir o reparo de DSB propenso a erros e aumentar o uso de reparo dependente de homologia. Subsequentemente, 350,000 células foram ressuspensas em 20 µl de tampão nucleofector (V4XP-3032; Lonza) na presença de 4,5 µg de plasmídeo contendo Cas9 e sgRNA visando o gene ERCC1 (ver Tabela S3 para plasmídeos e Tabela S4 forsgRNA sequências) e 100 µM de DNA doador de fita simples contendo a mutação do paciente, bem como mutações silenciosas para destruir o sítio PAM para evitar o corte por Cas9 e mutações silenciosas para introduzir um sítio de restrição HindIII para facilitar a triagem de clones KI. As células foram eletroporadas usando uma Unidade Nucleofectora Amaxa 4D-X (Lonza) usando o programa EA-104. Após a eletroporação, as células foram plaqueadas em baixa densidade em meio McCoy com 10% de FBS. No dia seguinte, o meio foi substituído por DMEM (10 por cento de FBS e 1 por cento de penicilina/estreptomicina), e as células foram deixadas para formar colônias. Aproximadamente 400 colônias foram isoladas e expandidas. O DNA genômico foi isolado e um fragmento incluindo a mutação introduzida e o sítio de restrição introduzido (HindIII) foi amplificado por PCR nested (ver Tabela S1 para iniciadores). Os fragmentos de PCR foram digeridos com HindIII (NEB) por 3 h a 37 graus e depois separados por eletroforese em gel. Os clones que tinham o sítio de restrição HindIII introduzido foram analisados ​​por sequenciação de Sanger (ver Tabela S1 para iniciadores). Obtivemos dois clones homozigotos de KI entre 400 clones isolados, o que corresponde a uma eficiência de KI de ~0,5 por cento.

Transdução lentiviral

para transdução lentiviral, mVenus-ERCC1WT ou mVenus ERCC1R156W foi inserido no vetor lentiviral pLenti-CW57-TO. HEK293T foi transfectado com vetores que codificam essas fusões de ERCC1, VSV-G, RRE e REV usando JetPEI (Sigma Aldrich) para produzir o vírus. O sobrenadante contendo vírus foi coletado após 24 h e filtrado com um filtro 0.44-µm. Os fibroblastos primários PV46LD e PV50LD foram transduzidos lentiviralmente na presença de polibreno (Sigma-Aldrich). As células foram selecionadas com 15 µg/ml de puromicina. A expressão das proteínas ERCC1 marcadas com mVenus foi induzida pela adição de 2 µg/ml de doxiciclina por 24 h.

Ensaios de sobrevivência clonogênica

Cells were trypsinized, seeded at low density, and allowed to attach. The next day, cells were either mock-treated or exposed to an increasing dose of UV light (1, 2, 3, and 4 J/m2 of UV-C 266nm), an increasing dose of IR (2, 4, 6, and 8 Gy), or increasing concentrations of MMC (2, 4, 6, and 8 ng/ml). After 7–9 d, the cells were washed with 0.9% NaCl and stained with methylene blue. Colonies of >20 células foram pontuadas. Os experimentos de sobrevivência foram realizados em duplicata e repetidos pelo menos duas vezes.

Imunoprecipitação para Co-IP

As células foram tratadas de forma simulada ou irradiadas com UV-C (20 J/m2) e colhidas após 1 h. Os pellets de células foram lisados ​​por 20 min em gelo em tampão EBC-150 (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 por cento NP-40, 2 mM MgCl2 e inibidor de protease cocktail [Roche]) suplementado com 500 U/ml de Benzonase Nuclease (Novagen). Os lisados ​​celulares foram incubados durante 1,5 h a 4 graus com esferas GFP-Trap A (Chromotek). As esferas foram então lavadas seis vezes com tampão EBC-150 (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 por cento NP-40, 1 mM EDTA e coquetel inibidor de protease) e fervidos em Laemmli-SDS tampão de amostra.

Western blot

As células foram centrifugadas, lavadas com PBS e fervidas por 10 min em tampão Laemmli (40 mM Tris, pH 6,8, 3,35 por cento de SDS, 16,5 por cento de glicerol, 0,0005 por cento de azul de bromofenol e 0,05 M ditiotreitol). As proteínas foram separadas em géis Criterion XT Bis-Tris de 4% a 12% (#3450124; Bio-Rad) em tampão NuPAGE MOPSrunning (NP0001-02; Thermo Fisher Scientific) e transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (IPFL00010; EMD Millipore ). A membrana foi bloqueada com tampão de bloqueio (MB-070-003; Rock land) por 1 h em temperatura ambiente. A membrana foi então sondada com anticorpos (listados na Tabela S5) conforme indicado. Um sistema Odyssey CLx (LI-COR Biosciences) foi usado para detecção.

Ensaio de recuperação de RNA (RRS)

30,000 células foram semeadas em 12-lamelas de vidro de mm em 24-placas de poços em DMEM com 1% de FBS. Após 24 h, as células foram irradiadas com UV-C na dose de 6 J/m2 e incubadas em meio condicionado por diferentes períodos de tempo ({{20}} h, 3 h e 18 h). Após a incubação, os transcritos nascentes foram marcados incubando as células com 400 µM de 5-etinil-uridina (CLK-N002-10; Jena Bioscience), que foi então visualizado com uma mistura Click-iT consistindo em 50 Tampão Tris mM, pH 8,0, 60 µM Atto Azida (647N-101; ATTO-TEC), 4 mM CuSO4•5H2O, 10 mM ácido L-ascórbico (A0278; Sigma-Aldrich) e 0,1 µg/ml DAPI (D1306; Thermo Fisher Scientific) por 1 h. As células foram lavadas três vezes durante 5 min com PBS e montadas em lâminas de microscópio (Thermo Fisher Scientific) usando Aqua Polymount (Brunschwig).

Imunofluorescência

Para coloração imunofluorescente, 250,000 células foram semeadas em lamelas de vidro 18-mm. No dia seguinte, as células foram fixadas com 4% de paraformaldeído, seguido de permeabilização com {{10}},5% Triton X-100 por 10 min. As células foram tratadas com 100 glicinas em PBS por 10 min para bloquear grupos aldeídos que não reagiram, enxaguadas com PBS e equilibradas em tampão de lavagem (PBS contendo 0,5 por cento de BSA e 0,05 por cento de Tween-20; Sigma-Aldrich) por 10 min. As etapas de anticorpos e lavagens foram em tampão de lavagem. Os anticorpos primários foram incubados por 2 h em temperatura ambiente, seguidos por anticorpos secundários por 1 h e DAPI por 5 min. Os anticorpos primários e secundários estão listados na TabelaS5. As células foram incubadas com 0,1 µg/ml de DAPI e montadas usando Aqua Polymount.

Coloração H2AX

200,000 células foram semeadas em 18-lamelas de vidro de mm em 24-placas de poços com DMEM (10% FBS e 1% P/S). No dia seguinte, as células foram expostas a IR pelo gerador de raios X YXlon International (200 KV, 4 mA; taxa de dose 2 Gy/min). Nos pontos de tempo indicados, as células foram fixadas com 3% de paraformaldeído em PBS por 10 min e coradas para H2AX por 1 h (ver acima). As imagens foram quantificadas usando uma macro personalizada no ImageJ que permitiu a análise automática e objetiva do número de focos por célula, conforme descrito anteriormente (Typas et al., 2015).

Análise microscópica de células fixas

As imagens das amostras fixas foram adquiridas em um microscópio de fluorescência de campo amplo Zeiss AxioImagerM2 ou D2 equipado com objetivas de imersão em óleo 63× PLAN APO (1,4 abertura numérica [NA]) (Zeiss) e uma lâmpada de iodetos metálicos HXP 120 usada para excitação. As sondas fluorescentes foram detectadas usando os seguintes filtros para DAPI (filtro de excitação: 350/50 nm; espelho dicróico: 400 nm; filtro de emissão: 460/50 nm), Alexa 555 (filtro de excitação: 545/25 nm; espelho dicróico: 565 nm ; filtro de emissão: 605/70 nm), ou Alexa 647 (filtro de excitação: 640/30 nm; espelho dicróico: 660 nm; filtro de emissão: 690/50 nm). As imagens foram gravadas no software ZEN 2012 e analisadas no ImageJ.

Microirradiação a laser UV

As células foram cultivadas em 18-mm quartzo (UV-C) ou lamelas de vidro (UV-A) e colocadas em uma câmara magnética Chamlide CMB em que o meio de crescimento foi substituído por CO2-independente Leibovitz L{ {4}} médio (Thermo Fisher Scientific). As trilhas de laser UV-C foram feitas usando um laser de granada de alumínio de ítrio de estado sólido bombeado por diodo 266-mm (potência média de 5 mW, taxa de repetição de até 10 kHz e comprimento de pulso de 1 ns). Antes da microirradiação UV-A, as células foram sensibilizadas com trioxsalen 6 µM por 1 h para gerar ICLs ou com BrdU 15 µM por 24 h para gerar DSBs. As trilhas de laser UV-A foram feitas por um laser de estado sólido 355-nm de granada de ítrio e alumínio bombeado por diodo (potência média de 14 mW e taxa de repetição de até 200 Hz). Ambos os lasers foram integrados em um sistema UGA-42-Caliburn/2L Spot Illumination (Rapp OptoElectronic).

A microirradiação foi combinada com imagens de células vivas em uma câmara ambiental ajustada para 37 graus em um microscópio Zeiss Axio Observer 7 de fluorescência de campo amplo de quartzo, usando uma objetiva de imersão em glicerol de ultrafiltro de 100 × (1,2 NA) (UV-C ) ou uma objetiva de imersão em óleo Plan-Neofluar 63× (1,25 NA) (UV-A). O sistema de laser é acoplado ao microscópio por meio de um TriggerBox, e um filtro de densidade neutra (ND{17}}) bloqueia 90% da luz do laser. Uma lâmpada de haleto metálico AnHXP 120-V foi usada para excitação. As imagens foram adquiridas no Zeiss ZEN e quantificadas no ImageJ.

Ensaio de quebra cromossômica

2 × 1{{20}}6 fibroblastos foram semeados em frascos de cultura de tecidos 175-cm2 com DMEM (10 por cento de FBS) e cultivados a 37 graus na presença ou ausência de 50 nM de MMC. Após 48 h, 600 µl de demecolcina (10 µg/µl) foram adicionados a cada frasco de cultura e as células foram incubadas por mais 30 min a 37 graus para enriquecer as metáfases. As células foram então tripsinizadas e ressuspensas em 75 mM KCL e incubadas durante 20 min à temperatura ambiente. As células foram centrifugadas, ressuspensas em 10 ml de fixador (75 por cento de metanol e 25 por cento de ácido acético), incubadas durante 30 min à temperatura ambiente e centrifugadas. Os pellets foram ressuspensos em 10 ml de fixador e incubados por 5 min à temperatura ambiente. Essa etapa foi repetida e, finalmente, o pellet foi ressuspenso em 0,5-1,0 ml de fixador. A suspensão de células foi colocada em uma lâmina e deixada secar. As lâminas foram coradas por 5 minutos em uma solução de Giemsa a 3%, enxaguadas em água corrente e deixadas secar. As lâminas foram codificadas e, de cada cultura codificada, 50 metáfases foram examinadas quanto a danos cromossômicos. Após a pontuação, as lâminas foram decodificadas e os resultados analisados ​​conforme apresentados (Stoepker et al., 2011).

UDS

180,000 células foram semeadas em 18-lamelas de vidro de mm em 12-placas de poços em DMEM com 1% de FBS. Após 24 h, as células foram irradiadas localmente através de um filtro 5-µm com 30 J/m2 UV-C. As células foram subsequentemente marcadas por pulso com 20 µM de EdU (VWR) e 1 µM de 5-fluoro-desoxiuridina (Sigma-Aldrich) por 1 h ou 4 h. Após a marcação, as células foram perseguidas em meio com 10 µM de timidina em DMEM sem suplementos por 30 min e fixadas por 15 min com 3,7 por cento de formaldeído em PBS. As células foram permeabilizadas por 20 min em PBS com 0,5 por cento de Triton-X100 e bloqueadas em 3 por cento de BSA (Thermo Fisher Scientific) em PBS. O EdU incorporado foi acoplado ao Attoazide Alexa Fluor 647 usando a química Click-iT de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Após o acoplamento, as células foram pós-fixadas com formaldeído a 2% por 10 min e subsequentemente bloqueadas com glicina 100 mM. O DNA foi desnaturado com NaOH 0,5 M por 5 min, seguido de bloqueio com BSA a 10 por cento por 15 min. Em seguida, as células foram incubadas com um anticorpo contra dímeros de pirimidina de ciclobutano (ver Tabela S5) por 2 h, seguido por anticorpos secundários por 1 h e DAPI por 5 min. As células foram montadas em Polymount (Brunschwig).

Aquisição de dados MS

A EM foi realizada essencialmente como descrito anteriormente (Salas Lloret et al., 2019). Todos os experimentos foram realizados em um sistema EASY-nLC 1000 (Proxeon) conectado a um Orbitrap Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific) através de uma fonte de íons nano-electrospray. O Q-Exactive foi acoplado a um emissor de sílica 25-cm (FS360-75-15-N-5-C25; NewObjective) embalado internamente com esferas C18-AQ de 1,9 µm (Reprospher -DE; Pur; Dr. Manish, Ammerbuch-Entringen, Alemanha). As amostras foram executadas em um gradiente de cromatografia 40-min de 0% a 30% de acetonitrila e, em seguida, aumentadas para 95% de acetonitrila antes do reequilíbrio da coluna com uma taxa de fluxo de 200 NL/min. O espectrômetro de massa foi operado em um modo de aquisição dependente de dados com um método dos sete primeiros e uma faixa de varredura de 300 a 1.600 m/z. Os espectros de MS de varredura completa foram adquiridos em um valor alvo de 3 × 106 e uma resolução de 70,000, e os espectros de massa em tandem de dissociação colisional mais altos (MS/MS) foram registrados em um valor alvo de 105, e com resolução de 35.000, janela de isolamento de 2,2 m/z e energia de colisão normalizada de 25%. O alvo de controle de ganho automático mínimo foi 104. Os tempos máximos de injeção MS1 e MS2 foram 250 e 120 ms, respectivamente. As massas de íons precursores de íons escaneados foram excluídas dinamicamente da análise MS/MS por 30 s. Íons com carga 1 e superior a 6 foram excluídos do desencadeamento da análise MS2.

Análise de dados MS Todos os dados brutos foram analisados ​​usando MaxQuant (versão 1.6.6.0) conforme descrito anteriormente (Tyanova et al., 2016a). Realizamos a pesquisa contra um proteoma de referência UniProt digerido in silico para Homo sapiens, incluindo sequências canônicas e isoformas (27 de maio de 2019). As pesquisas de banco de dados foram realizadas de acordo com as configurações padrão com as seguintes modificações. A digestão com Tripsina/P foi usada, permitindo quatro clivagens perdidas. Oxidação (M) e acetil (proteína N-term) foram permitidas como modificações variáveis ​​com um número máximo de três. O carbamido-metil (C) foi desativado como uma modificação fixa. A quantificação sem rótulo (LFQ) foi habilitada, não permitindo Fast LFQ. Os dados de saída Max-Quant foram processados ​​usando a plataforma computacional Perseus (v 1.6.6.0; Tyanova et al., 2016b). Os valores de intensidade de LFQ foram transformados em log2 e os contaminantes e proteínas potenciais identificados apenas pelo local ou peptídeos reversos foram removidos. As amostras foram agrupadas em categorias experimentais e as proteínas não identificadas em quatro das quatro réplicas em pelo menos um grupo também foram removidas. Os valores omissos foram imputados usando valores normalmente distribuídos com um downshift de 1,8 (log2) e uma largura aleatória de 0,3 (log2) considerando os valores da matriz inteira. A análise estatística (testes t) foi realizada para determinar quais proteínas foram significativamente enriquecidas. Gráficos de vulcões foram gerados e as tabelas de saída da análise estatística foram posteriormente processadas no Microsoft Excel. Os dados de proteômica do MS foram depositados no Consórcio ProteomeXchange por meio do repositório parceiro PRIDE (Perez-Riverol et al., 2019) com o identificador do conjunto de dados PXD017940.

Purificação de ERCC recombinante1-XPF

A produção de baculovírus foi realizada conforme descrito usando as construções pMacroBac-His-ERCC1/XPF-HA (Enzlin e Sch¨arer, 2002). ERCC1WT e ERCC1R156W foram coexpressos com XPFWT de um único baculovírus em células de inseto Sf9. Os heterodímeros foram purificados por afinidade de níquel, exclusão de tamanho e cromatografia de heparina como descrito (Enzlin e Scherr, 2002). ERCC{10}}XPF foi eluído da coluna de heparina em cerca de 600 mM de NaCl. As concentrações de proteína variaram de 0,1 a 0,2 mg/ml.

Ensaio de nuclease

Um substrato de alça de haste (GCCAGCGCTCGG(T)22CCGAGCGCTGGC) contendo corante fluorescente Cy5 (50 pmol) em 39 terminais (IDT) foi recozido em um 100-µl tampão de recozimento (10 mM Tris, pH 7,5 e 50 mM NaCl) aquecendo a 95 graus por 5 min e resfriando lentamente por um período de 2 h. 200 fmol de substrato recozido foi usado em reações de 20-µl contendo 25 mM de HEPES, pH 8,0, 2 mM de MgCl2, 10 por cento de glicerol, 0,5 mM de mercaptoetanol, 0,1 mg/ml de BSA, 40 mM NaCl e 0-40 nM de proteína. As reações foram incubadas a 30 graus por 30 min e paradas pela adição de 10 µl de formamida a 90 por cento/EDTA 10 mM. Após aquecimento a 95 graus por 5 min e resfriamento em gelo, 15 µl de cada amostra foram carregados em um gel de poliacrilamida desnaturante a 15%. Os géis foram executados a 30 mA por 30 min e as bandas foram visualizadas por fluorescência por Typhoon RGB (Amersham Biosciences).

Ensaio NER in vitro

Extratos de células deficientes em XPF (XP2YO) e o plasmídeo contendo lesão dG-AAF específica do local foram gerados como descrito anteriormente (Gillet et al., 2005; Shivji et al., 1999) . Para cada reação, 2 µl de tampão de reparo (2{{40}}0 mM Hepes-KOH, 25 mM MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM ATP, 110 mM fosfocreatina e 1,8 mg / ml BSA, pH final 7,8), 0,2 µl de tampão de creatina fosfoquinase (2,5 mg/ml de creatina fosfoquinase de músculo de coelho [Sigma Aldrich], glicina 10 mM, pH 9,0 e 50 por cento de glicerol), 3 µl de célula deficiente em XPF extrato, NaCl (para uma concentração final de 70 mM) e proteínas ERCC 1-XPF purificadas em um volume total de 9 µl foram pré-aquecidos a 30 graus por 10 min. 1 µl de plasmídeo contendo dG-AAF (50 ng/µl) foi adicionado a cada reação, e as reações foram incubadas a 30 graus por 45 min. A mistura de reação foi então resfriada em gelo por 5 min, seguido pela adição de 0,5 µL de 1 µM de fita complementar d(GGGGCATGTGGCGCCGGTAATAGC TACGTAGCTC), e a mistura de reação foi desnaturada por aquecimento a 95 graus por 5 min. Após 15 min de hibridização à temperatura ambiente, 1 µl de mistura de sequência (contendo 0,13 U de sequência e 2,0 µCi [-32}P] dCTP para cada reação) foi adicionado. Após pré-incubação a 37 graus durante 3 min, adicionou-se 1,2 µl de mistura de trifosfato de desoxirribonucleótido (50 µM dCTP, 100 µM dTTP, 100 µM dATP e 100 µM dGTP). A mistura de reação foi incubada a 37 graus por 12 min, e a reação foi interrompida pela adição de 8 µl de corante de carga (80 por cento de formamida e 10 mM de EDTA). As amostras foram aquecidas a 95 graus por 5 min, resfriadas em gelo e carregadas em um gel de poliacrilamida desnaturante a 14%. Os géis foram executados a 45 W por 2,5 h e as bandas visualizadas usando um PhosphorImager (Typhoon RGB).

Material complementar online

A Fig. S1 mostra os valores laboratoriais das funções hepáticas e renais no irmão 1 e no irmão 2. A Fig. S2 mostra os dados de sequenciamento genômico confirmando a mutação missense e a deleção intragênica no gene ERCC1. A Fig. S3 mostra a expressão proteica de ERCC1 e XPF em fibroblastos de pacientes. A Fig. S4 mostra proteínas ERCC1 e XPF recombinantes purificadas e Co-IP de ERCC1WT e ERCC1R156W. A Fig. S5 mostra imagens de microscopia de UDS, os focos H2AX e a localização das mutações do paciente em ERCC1-XPF. A Tabela S1 contém as sequências de todos os primers e sondas usados ​​neste estudo. A Tabela S2 lista todas as linhas celulares testadas neste estudo. A Tabela S3 lista todos os plasmídeos envolvidos neste estudo. A Tabela S4 fornece as sequências de sgRNA do estudo e a Tabela S5 mostra os anticorpos. A Tabela S6 fornece o número de células usadas para quantificação nas figuras. O Data S1 exibe todos os arquivos de Western blot não cortados.

Agradecimentos

Os autores agradecem aos irmãos e seus pais pela contribuição para este artigo, Sylvie Noordermeer (Leiden University Medical Center [LUMC], Leiden, Holanda) pelo vetor de expressão lentiviral thepLenti-CW57-TO-GFP e conselhos sobre a geração de KI células, Joachim Goedhart (Universidade de Amsterdã, Amsterdã, Holanda) para o cDNA mVenus, Bert van derKooij (LUMC, Leiden, Holanda) para o inibidor de DNA-PK, Wim Vermeulen e Anja Rams (Erasmus MC, Rotterdam, Holanda) para fornecer células 165TOR, Tomoo Ogi (Universidade de Nagoya, Japão) por fornecer células CS20LO, Alan Lehman (Universidade de Sussex, Reino Unido) por fornecer células CSL16NG e CSL16NG hTERT e Joost Schimmel (LUMC, Leiden, Holanda) por aconselhamento sobre a geração de células KI .

Este trabalho foi financiado por uma bolsa de pesquisa do Centro Médico da Universidade de Leiden e uma bolsa Nederlandse Organisatie voor We tenschappelijk Onderzoek VIDI (ALW.016.161.320) para MSLuijsterburg, uma bolsa inicial do Conselho Europeu de Pesquisa (310913) para ACO Vertegaal, uma bolsa KWF Kankerbestrijding YoungInvestigator ( 11367) para R. Gonz´alez-Prieto, uma bolsa KWF Kan kerbestrijding (VU 2013-5983) para MA Rooimans, e bolsas do Instituto Coreano de Ciências Básicas (IBS-R022-A1) e do National Cancer Institute (P01CA092584) para ODSch arer.

Contribuições dos autores: K. Apelt gerou células KO, células KI e linhas celulares estáveis; realizaram Western blot e imunocolorações para expressão de ERCC1 e XPF, transduções lentivirais, sobrevivências clonogênicas (UV, MMC, IR), experimentos Co-IP para análise de Western blot, experimentos UDS, experimentos Co-IP para MS e H2AX; e escreveu o papel. A. Kragten realizou UDS, RRS e imunocolorações após UV local. AP Wonder gem gerou células KO e KI e realizou experimentos UDS, Western blot e sequenciamento Sanger para confirmar a mutação missense. SM White forneceu aconselhamento para os pacientes, analisou dados do exoma, realizou biópsias, gerou fibroblastos primários e escreveu a descrição clínica do paciente. S. Lunke e BT Wilson geraram dados NGS. S. Pantaleo e D. Flanagan realizaram qPCR para validar a exclusão. C.Quinlan escreveu a descrição clínica do rim. W. Hardikar escreveu a descrição clínica do fígado. MA Rooimans e R.MF Wolthuis geraram fibroblastos 48BR e PV50LD imortalizados por hTERT e realizaram os ensaios de quebra cromossômica induzida por MMC. R. Gonzalez-Prieto e ACO Vertegaal analisaram todos os experimentos de MS. WW Wiegant e H. vanadium realizaram sobrevivências clonogênicas em células U2OS (IR). J.-E.Yeo e HS Kim purificaram proteínas recombinantes e realizaram o ensaio de nuclease e os ensaios in vitro de NER. OD Scharer supervisionou o trabalho NER in vitro contribuiu para a interpretação estrutural do alelo R156W e editou o artigo. MS Luij sterburg supervisionou o projeto e escreveu o artigo.

Referências

Abdel Ghaffar, TY, ES Elsobky e SM Elsayed. 2011. Colestase em pacientes com síndrome de Cockayne e critérios modificados sugeridos para diagnóstico clínico. Orphanet J. Raro Dis. 6:13. -1172-6-13

Abdullah, UB, JF McGouran, S. Brolin, D. Ptchelkine, AH El-Sagheer, T. Brown e PJ McHugh. 2017. RPA ativa a endonuclease XPF-ERCC1 para iniciar o processamento de ligações cruzadas entre fitas de DNA. EMBO J. 36: 2047-2060.

Adair, GM, RL Rolig, D. Moore-Faver, M. Zabelshansky, JH Wilson e RS Nairn. 2000. Papel de ERCC1 na remoção de longas caudas não homólogas durante a recombinação homóloga direcionada. EMBO J. 19:5552-5561.

Ahmad, A., AR Robinson, A. Duensing, E. van Drunen, HB Beverloo, DB Weisberg, P. Hasty, JH Hoeijmakers e LJ Niedernhofer. 2008. ERCC1-XPF endonuclease facilita o reparo de quebra de fita dupla de DNA. Mol. Célula. Biol. 28:5082–5092.

Ahmad, A., JH Enzlin, NR Bhagwat, N. Wijgers, A. Raams, E. Appledoorn, AF Theil, JH J Hoeijmakers, W. Vermeulen, NG J Jaspers, et al. 2010. A localização incorreta da nuclease XPF-ERCC1 contribui para a redução do reparo do DNA em pacientes com XP-F. PLoS Genet. 6:e1000871.

Auerbach, AD 2009. Anemia de Fanconi e seu diagnóstico. Mutante. Res. 668:4-10.

Ben Chehida, A., N. Ghali, R. Ben Abdelaziz, F. Ben Moussa e N. Tebib. 2017. Envolvimento Renal em 2 Irmãos com Síndrome de Cockayne. Irã. J. Doença renal. 11:253-255.

Biggerstaff, M., DE Szymkowski e RD Wood. 1993. Co-correção do ERCC1, ERCC4, e xeroderma pigmentosum grupo F defeitos de reparo de DNA in vitro. EMBO J. 12:3685-3692.

-2075.1993.tb06043.xBogliolo, M., B. Schuster, C. Stoepker, B. Derkunt, Y. Su, A. Raams, JP Trujillo, J. Minguillón, MJ Ramı´rez, R. Pujol , et ai. 2013. Mutações em ERCC4, codificando a endonuclease XPF de reparo de DNA, causam anemia de Fanconi. Sou. J. Hum. Genet. 92:800-806.

Ceccaldi, R., P. Sarangi e AD D'Andrea. 2016. O caminho da anemia de Fanconi: novos atores e novas funções. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17: 337-349.

de Laat, WL, E. Appeldoorn, NG Jaspers e JH Hoeijmakers. 1998a. Elementos estruturais de DNA necessários para a atividade da endonuclease ERCC1-XPF. J. Biol. Química 273:7835–7842.

de Laat, WL, AM Sijbers, H. Odijk, NG Jaspers e JH Hoeijmakers. 1998b. Mapeamento de domínios de interação entre proteínas humanas de reparo ERCC1 e XPF. Res. de Ácidos Nucleicos. 26:4146–4152.

nar/26.18.4146

de Vries, A., CT van Oostrom, FM Hofhuis, PM Dortant, RJ Berg, FR de Gruijl, PW Wester, CF van Kreijl, PJ Capel, H. van Steeg e SJ Verbeek. 1995. Aumento da suscetibilidade ao ultravioleta-B e carcinógenos de camundongos sem o gene XPA de reparo por excisão de DNA. Natureza. 377:169-173.

DiGiovanna, JJ, and KH Kraemer. 2012. Brilhando uma luz sobre o xeroderma pigmentoso. J. Investir. Dermatol. 132:785-796.

Enzlin, JH e OD Schrer. 2002. O sítio ativo da endonuclease de reparo de DNA XPF-ERCC1 forma um motivo de nuclease altamente conservado. EMBO J. 21:2045–2053.

Funaki, S., S. Takahashi, H. Murakami, K. Harada e H. Kitamura. 2006. Síndrome de Cockayne com nefrite tubulointersticial aguda recorrente. Patol. Int. 56:678-682.

.02029.x

Gillet, LC, J. Alzeer e OD Schrer. 2005. Incorporação específica do local de N-(desoxiguanosina-8-il)-2-acetilaminofluoreno (dG-AAF) em oligonucleotídeos usando síntese de DNA 'ultra-suave' modificada. Res. de Ácidos Nucleicos. 33:1961-1969.

Gregg, SQ, AR Robinson e LJ Niedernhofer. 2011. Consequências fisiológicas de defeitos em ERCC1-XPF DNA reparação endonuclease. Reparo de DNA (Amst.). 10:781-791.

Guo, C., Y. Nakazawa, L. Woodbine, A. Bjorkman, M. Shimada, H. Fawcett, N. Jia, K. Ohyama, TS Li, ​​Y. Nagayama, et ai. 2015. A deficiência de XRCC4 em seres humanos causa um fenótipo neurológico marcante, mas nenhuma imunodeficiência evidente. J. Allergy Clin. Immunol. 136:1007–1017.

Helfricht, A., PE Thijssen, MB Rother, RG Shah, L. Du, S. Takada, M. Rogier, J. Moritz, H. IJspeert, C. Stoepker, et ai. 2020. A perda de ZBTB24 prejudica a junção de extremidades não homólogas e a recombinação de mudança de classe em pacientes com síndrome da CIF. J. Exp. Med. 217:e20191688.

Houtsmuller, AB, S. Rademakers, AL Nigg, D. Hoogstraten, JH Hoeij-makers e W. Vermeulen. 1999. Ação da endonuclease de reparo do DNA ERCC1/XPF em células vivas. Ciência. 284:958-961. h

ciência.284.5416.958

Jaspers, NG, A. Raams, MC Silengo, N. Wijgers, LJ Niedernhofer, AR Robinson, G. Giglia-Mari, D. Hoogstraten, WJ Kleijer, JH Hoeij-makers e W. Vermeulen. 2007. O primeiro paciente relatado com deficiência de ERCC1 humano tem síndrome cerebro-oculofacio-esquelética com um defeito leve no reparo de excisão de nucleotídeos e grave falha de desenvolvimento. Sou. J. Hum. Genet. 80:457-466.

Joenje, H., AB Oostra, M. Wijker, FM di Summa, CG van Berkel, MA Rooimans, W. Ebell, M. van Weel, JC Pronk, M. Buchwald e F. Arwert. 1997. Evidência de pelo menos oito genes da anemia de Fanconi. Sou. J. Hum. Genet. 61:940-944.

Jones, M., F. Beuron, A. Borg, A. Nans, CP Earl, DC Briggs, AP Snijders, M. Bowles, EP Morris, M. Linch e NQ McDonald. 2020. As estruturas Cryo-EM da endonuclease XPF-ERCC1 revelam como o envolvimento da junção de DNA interrompe uma conformação auto-inibida. Nat. Comum. 11: 1120.

Karikkineth, AC, M. Scheibye-Knudsen, E. Fivenson, DL Croteau e VA Bohr. 2017. Síndrome de Cockayne: características clínicas, sistemas modelo e vias. Envelhecimento Res. Ap. 33:3–17.002

Kashiyama, K., Y. Nakazawa, DT Pilz, C. Guo, M. Shimada, K. Sasaki, H. Fawcett, JF Wing, SO Lewin, L. Carr, et ai. 2013. Mau funcionamento da nuclease ERCC1-XPF resulta em diversas manifestações clínicas e causa síndrome de Cockayne, xeroderma pigmentoso e anemia de Fanconi. Sou. J. Hum. Genet. 92:807-819.