Parte 2: Regulação epigenética do gene circadiano Per1 contribui para mudanças relacionadas à idade na memória hipocampal

Contato: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

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Knockdown de Per1 prejudica a longo prazomemóriaem camundongos jovens.Em seguida, para testar se a regulação positiva de Per1 no hipocampo dorsal é necessária paramemóriaformação, nós infundimos siRNA visando Per1 no hipocampo dorsal de camundongos jovens 48 h antes do treinamento de 10-min OLM. A infusão de Per1 siRNA produziu uma redução significativa da proteína PER1 no hipocampo dorsal, medida 2 h após a sessão final de teste (Fig. 4d, Fig. 5 suplementar). Este knockdown relativamente modesto da proteína PER1 (~30%) produziumemóriaformação para OLM; camundongos infundidos com Per1 siRNA não mostraram aumento significativo no DI entre treinamento e teste e exibiram significativamente menos preferência pelo objeto em movimento durante o teste do que camundongos de controle (Fig. 4e) sem efeito na exploração total do objeto no teste (Fig. 4f) e nenhuma diferença no movimento durante as sessões de habituação pré-treinamento (Fig. 8c suplementar). Isso demonstra, pela primeira vez, que a ruptura local de um gene do relógio circadiano central seletivamente dentro do hipocampo pode prejudicarmemóriaformação.

A superexpressão de Per1 melhoramemóriaem camundongos idosos. Finalmente,determinar se a superexpressão de Per1 no hipocampo dorsal é suficiente para melhorarmemóriadeficiências, nós regulamos localmente Per1 usando dois métodos complementares. Primeiro, usamos um lentivírus que expressa Per1 de tipo selvagem com um marcador de epítopo v5 (pLVX-v5Per1) (Fig. 5a, Fig. 6a suplementar). Para confirmar que este plasmídeo superexpressa Per1, transfectamos células HT22 com pLVX-v5Per1 ou pLVX-EV e medimos a expressão de mRNA de Per1. Em ambas as 24 e 48 h após a transfecção, o mRNA Per1 foi significativamente aumentado nas células transfectadas com pLVX-v5Per1 em relação às células transfectadas com o plasmídeo controle (Fig. 5b). A transfecção de pLVX-v5Per1 também levou a um aumento significativo no mRNA para Per2 (um membro da família do relógio de período que interage com Per1) às 24 h (Fig. 6b suplementar), embora esse aumento tenha sido muito menor do que o aumento observado em Per1 (em 24 h, Per1: 466-aumento de vezes sobre EV, Per2: 1.6-aumento de vezes sobre EV). A superexpressão de Per1 não afetou a transcrição do gene a jusante mais próximo Hes7, no entanto (Fig. 6c suplementar).

Para determinar se a superexpressão de Per1 melhoramemóriadesempenho em camundongos idosos, pLVX-v5Per1 foi infundido no hipocampo dorsal de camundongos 18-mo 2 semanas antes do comportamento. camundongos pLVX-v5Per1 mostraram melhora significativamemóriapara OLM no teste em relação aos controles pLVX-EV (vetor vazio) (Fig. 5c). Apenas os camundongos pLVX-v5Per1 mostraram um aumento significativo na preferência pelo objeto em movimento em repouso em relação ao treinamento, sem diferenças observadas entre os grupos na exploração total no teste (Fig. 5d) ou no movimento durante a habituação (Fig. 8d complementar).

Seguindo o comportamento, o tecido hipocampal de um subconjunto de animais foi processado para sequenciamento de RNA para confirmar a presença dos transcritos pLVX-EV e pLVX-v5Per1 nos grupos apropriados in vivo (Fig. 7a, b, f, g suplementares).

Para complementar essa abordagem, também usamos o sistema CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM)33 para conduzir a ativação transcricional de Per1 no hipocampo dorsal. Este sistema consiste em três componentes lentivirais: um sistema cataliticamenteCas9 inativo (dCas9) fundido a um domínio de ativação transcricional VP64 com uma tag GFP (dCas9-VP64-GFP), um RNA de guia único modificado (sgRNA) visando Per1 com dois aptâmeros de RNA MS2 que podem recrutar o terceiro componente, uma proteína de fusão do ativador transcricional duplo MS2- (MS2-p65-HSF1)(Fig. 5e). Os animais de controle receberam um sgRNA de controle sem a sequência de 20 nucleotídeos necessária para direcionar o sistema SAM para Per1 (referido como ctrl sgRNA). A montagem desses componentes no promotor Per1 permite que os três domínios efetores (VP64, p65 e HSF1) conduzam a transcrição Per1. Para confirmar, a eficácia da Fig. 5 Superexpressão de Per1 no hipocampo dorsal melhora as deficiências relacionadas à idade na localização do objetomemória. um Esquema de construção de lentivírus usado para superexpressar v{{0}}Per1 marcado (pLVX-v5Per1) em comparação com o controle de vetor vazio (pLVX-EV). b Per1 mRNA foi significativamente aumentado 24 e 48 h após a transfecção de pLVX-v5Per1 em células HT22 em comparação com células transfectadas com EV (ANOVA de duas vias: interação Grupo x Timepoint (F(1,8)=52.8, p < {{20}}.0{{40}}1),="" testes="" post="" hoc="" de="" sidak,="" ***p="">< 0.001,="" n="3," 3,="" 3,="" 3).="" c="" 18-mo="" camundongos="" que="" receberam="" infusões="" hipocampais="" de="" plvx-v5per1="" mostraram="" memória="" significativamente="" melhor="" para="" olm="" do="" que="" camundongos="" que="" receberam="" o="" vírus="" de="" controle="" plvx-ev="" (anova="" de="" duas="" vias:="" interação="" vírus="" x="" sessão,="" (f(1,29)="" {{34)="" }}.15,="" p="">< 0,05),="" testes="" post="" hoc="" de="" sidak,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" n="16," 15,="" todos="" do="" sexo="" masculino).="" d="" a="" exploração="" total="" foi="" semelhante="" para="" ambos="" os="" grupos="" no="" teste="" (t(29)="0.57," p="0.57)." e="" esquema="" do="" sistema="" crispr/dcas9="" synergistic="" activation="" mediator="" (sam)="" usado="" para="" conduzir="" a="" transcrição="" per1.="" acima:="" componentes="" individuais="" do="" sam.="" abaixo:="" componentes="" montados="" no="" promotor="" per1,="" conduzindo="" a="" transcrição="" per1.="" f="" o="" mrna="" de="" per1="" aumentou="" significativamente="" 48="" h="" após="" a="" transfecção="" de="" componentes="" crispr-sam="" em="" células="" ht22="" em="" comparação="" com="" células="" transfectadas="" com="" o="" sgrna="" de="" controle="" (anova="" de="" duas="" vias:="" interação="" grupo="" x="" ponto="" de="" tempo="" (f(1,8)="14.77" ,="" p="">< 0,01),="" testes="" post="" hoc="" de="" sidak,="" **p="">< 0,001,="" n="3,3,3,3)." g="" 18-mo="" camundongos="" que="" receberam="" infusões="" hipocampais="" do="" sistema="" crispr-sam="" com="" sgrna="" direcionado="" a="" per1="" mostraram-se="" significativamente="">memóriapara OLM em comparação com camundongos de controle EV com sgRNA de controle (ANOVA de duas vias: interação vírus x sessão (F(1,30)=5,83, p < 0,05)="" ,="" testes="" post="" hoc="" de="" sidak,="" ***p="">< 0,001,="" n="17," 15,="" todos="" do="" sexo="" masculino).="" h="" a="" exploração="" total="" foi="" semelhante="" para="" ambos="" os="" grupos="" no="" teste="" (t(30)="0.41," p="0.68)." os="" dados="" são="" apresentados="" como="" média="" ±="" sem="" no="" sistema="" crispr-sam,="" transfectamos="" células="" ht22="" com="" todos="" os="" três="" plasmídeos,="" coletamos="" as="" células="" 24="" ou="" 48="" h="" depois="" e="" medimos="" a="" expressão="" de="" mrna="" per1.="" por="" 48="" h="" após="" a="" transfecção,="" per1="" mrna="" foi="" significativamente="" aumentado="" no="" grupo="" que="" recebeu="" per1="" sgrna="" em="" comparação="" com="" os="" controles="" (fig.="" 5f),="" confirmando="" que="" o="" sistema="" crispr-sam="" efetivamente="" impulsiona="" a="" expressão="" de="" per1="" mrna.="" não="" observamos="" nenhuma="" alteração="" na="" expressão="" de="" mrna="" de="" per2="" (fig.="" 6e="" complementar)="" ou="" mrna="" de="" hes7="" (fig.="" 6f="" complementar),="" indicando="" que="" o="" sistema="" crispr-sam="" impulsiona="" a="" superexpressão="" seletiva="" do="" gene="" alvo,="">

Em seguida, camundongos 18-mo receberam infusões intra-hipocampais dos lentivírus CRISPR-SAM (Fig. 6d suplementar) e foram treinados em OLM 2 semanas depois. Conforme observado com nossa superexpressão de pLVX-v5Per1, a superexpressão de Per1 mediada por CRISPR-SAM melhorou significativamentememóriadesempenho em camundongos infundidos com sgRNA Per1 em relação aos animais de controle (Fig. 5g) sem afetar a exploração total (Fig. 5h) ou movimento durante a habituação (Fig. 8e suplementar). Apenas os camundongos que receberam o sgRNA Per1 mostraram um aumento significativo na preferência pelo objeto em movimento em repouso em relação ao treinamento, indicandomemóriapara as localizações dos objetos (Fig. 5g). Seguindo o comportamento, o tecido hipocampal de um subconjunto de animais foi processado para sequenciamento de RNA para confirmar a presença dos transcritos CRISPR nos grupos apropriados in vivo (Fig. 7c-g suplementar). Juntos, esses resultados demonstram que a superexpressão de Per1 no hipocampo dorsal é suficiente para melhorar as deficiências relacionadas à idade na memória de localização de objetos de longo prazo. Per1 é, portanto, um gene chave que é crítico para a formação da memória de longo prazo, é regulado por HDAC3 e é prejudicado no envelhecimento do cérebro.

Discussão

Nossos resultados mostram que a deleção ou interrupção da histona desacetilase repressiva HDAC3 pode melhorar as deficiências relacionadas à idade tanto em longo prazo.memóriae plasticidade sináptica. Além disso, a deleção de HDAC3 restaura a expressão induzida pela experiência do gene circadiano Per1 no hipocampo dorsal. Como a expressão de PER1 no hipocampo é crítica para a formação de memória de longo prazo (Fig. 4) e a superexpressão de Per1 no hipocampo melhora as deficiências de memória relacionadas à idade (Fig. 5), PER1 é um mecanismo potencial através do qual a exclusão de HDAC3 melhoramemóriae plasticidade sináptica em camundongos idosos. Mais amplamente, a interrupção relacionada à idade de Per1 pode conectar deficiências relacionadas à idade na memória de longo prazo e na ritmicidade circadiana, dependendo da estrutura.

Uma descoberta importante do estudo atual foi que as deficiências relacionadas à idade na LTP hipocampal podem ser melhoradas com deleção ou interrupção de HDAC3. Isso é consistente com um trabalho recente do laboratório Sajikumar, demonstrando que o bloqueio farmacológico de HDAC3 também pode melhorar as deficiências relacionadas à idade na LTP34 hipocampal associativa. Curiosamente, descobrimos que fatias de animais velhos HDAC3flox/flox e HDAC3 (Y298H) não conseguiram atingir o mesmo nível de potencialização que fatias de animais jovens HDAC3flox/flox ou HDAC3 (Y298H) (Fig. 2c, f), sugerindo que cérebros envelhecidos podem ter um teto de plasticidade menor do que cérebros jovens. Uma possível explicação para essa diferença na potencialização é que a perda de contatos sinápticos relacionada à idade no CA122 poderia diminuir o teto de plasticidade no hipocampo envelhecido, pois as menos sinapses disponíveis se tornariam saturadas mais rapidamente do que as sinapses relativamente abundantes no jovem DH. Se for esse o caso, fortalecer o protocolo de estimulação ou fornecer sessões de estimulação espaçadas35 não deve aumentar ainda mais a LTP no hipocampo envelhecido, pois não há sinapses adicionais disponíveis. Mais trabalho será necessário para determinar o mecanismo subjacente a esta diferença.

Nossos resultados de sequenciamento de RNA demonstraram que apenas um pequeno subconjunto de genes se encaixa no critério de ser restaurado no cérebro envelhecido pela deleção de HDAC3 (Fig. 3e). Assim, em vez de recapitular o perfil de expressão gênica do cérebro jovem, a exclusão de HDAC3 no cérebro envelhecido restaurou a expressão induzida pela experiência de alguns genes-chave que são criticamente importantes para a formação da memória de longo prazo, incluindo Per1. Per1 parece ser regulado diretamente por HDAC3, pois a deleção focal da expressão de Per1 induzida pela experiência de HDAC3 restaurada e HDAC3 é fisicamente removida do promotor Per1 em resposta ao treinamento de OLM. Além disso, a expressão Per1 é necessária paramemória, como knock-down mediado por siRNA da proteína PER1 no DH prejudicado a longo prazomemóriaformação em camundongos jovens, e a superexpressão melhoroumemóriapara OLM em camundongos idosos. Notavelmente, ambos os sistemas lentivirais usados ​​para superexpressar Per1 apenas transfectaram um pequeno número de células na área CA1b do hipocampo dorsal (Fig. 6a, d suplementar), tornando necessário confirmar a presença desses construtos com sequenciamento de RNA (ver métodos ). Como trabalhos anteriores mostraram que essa região precisa do hipocampo dorsal é crítica para OLM36, isso demonstra que mesmo uma pequena alteração focal de Per1 dentro de uma estrutura relevante para a memória pode afetar a formação da memória de longo prazo. Isso estende pesquisas anteriores mostrando que a deleção não específica de Per1 em todo o cérebro pode prejudicar a formação da memória em camundongos jovens6,28,29. A repressão anormal mediada por HDAC3-de Per1 no cérebro envelhecido é, portanto, um evento-chave que pode levar a deficiências relacionadas à idade na formação da memória de longo prazo e na ritmicidade circadiana. Embora este estudo demonstre claramente que Per1 é um gene importante através do qual HDAC3 regula a memória de longo prazo no cérebro envelhecido, outros genes provavelmente contribuem para os efeitos de melhoria da memória da deleção de HDAC3. Outros genes propostos para mediar os efeitos de HDAC3 na plasticidade sináptica e memória incluem NF-κB34, FMRP37 e Nr4a226. No estudo atual, identificamos três genes adicionais (Fig. 3f:Nr4a1, Egr1, Tsc22d3) que, como Per1, mostram expressão prejudicada no cérebro envelhecido que é melhorada pela deleção de HDAC3. Como esses diferentes genes contribuem exclusivamente para os efeitos de melhoria da memória da deleção de HDAC3 ainda não está claro. Notavelmente, todos esses genes fazem interface com a via CBP/CREB, que é crítica para a formação da memória de longo prazo38,39 e está tanto a montante quanto a jusante de PER16,28. Como PER1 está a montante da fosforilação de CREB6, é possível que a repressão de Per1 mediada por HDAC3-reduza a fosforilação de CREB, prejudicando a transcrição de genes mediados por CREB como Fmrp40,41 e os membros da família de genes Nr4a Nr4a1 e Nr4a226. Compreender a dinâmica complexa entre HDAC3, PER1 e esses outros atores moleculares será um objetivo importante de pesquisas futuras.

No presente estudo, usamos dois métodos complementares para superexpressar Per1 no cérebro envelhecido: superexpressão de um construto de cDNA Per1 completo usando pLVX-v5Per1 e ativação transcricional de Per1 endógeno usando o sistema CRISPR-SAM. Embora a superexpressão mediada por pLVX tenha levado a um grande aumento no mRNA Per1 (Fig. 5b), isso foi acompanhado por um aumento em Per2, outro membro da família Period (Fig. 6b suplementar). A expressão do gene a jusante Hes7, no entanto, não foi alterada por pLVX-v5Per1 (Fig. 6c suplementar). O sistema CRISPR-SAM, por outro lado, produziu um aumento mais sutil no mRNA de Per1 que evitou aprimoramentos fora do alvo da expressão de Per2 ou Hes7 (Fig. 6e-f suplementar). Como ambas as abordagens melhoraram similarmente a longo prazomemóriaem camundongos idosos, é improvável que o aumento fora do alvo em Per2 observado com pLVX-v5Per1 tenha sido a causa da melhora observada na memória de longo prazo.

Efeitos circadianos a longo prazomemóriaAcredita-se tradicionalmente que decorrem da desregulação dentro do SCN, que então leva a alterações nas estruturas periféricas envolvidas na formação da memória, como o hipocampo dorsal. Pouco se sabe sobre o papel dos genes individuais do relógio circadiano na DH, apesar de uma clara conexão entre a ritmicidade circadiana e a formação da memória de longo prazo. A memória está intimamente ligada à hora do dia, pois as cascatas de genes relacionadas à plasticidade mostram oscilações circadianas3,6 ememóriapodem ser adquiridos mais facilmente em determinados períodos do ciclo circadiano. Por exemplo, o condicionamento de medo de contexto é adquirido mais fortemente durante o dia, quando os níveis de fosforilação da MAPK atingem o pico3. Além disso, está bem documentado que o envelhecimento é acompanhado por uma quebra dos ritmos circadianos, presumivelmente devido a mudanças no relógio circadiano central, o núcleo supraquiasmático (SCN) (para revisão1). Como essa interrupção no relógio circadiano se relaciona com as deficiências relacionadas à idade namemóriaé uma questão aberta. Nossos resultados sugerem que o HDAC3 limita a Per1 induzida pela experiência no hipocampo do envelhecimento, possivelmente contribuindo para as deficiências observadas na memória de longo prazo. A repressão epigenética de Per1 pode, portanto, representar uma interface importante entre deficiências relacionadas à idade na ritmicidade circadiana e na formação da memória de longo prazo.

Dos genes centrais do relógio circadiano canônico, o Per1 está preparado para afetar drasticamente o hipocampo a longo prazomemória. Per1 parece estar predominantemente envolvido nas vias de saída do SCN e desempenha um papel fundamental nos relógios periféricos a jusante do SCN, como o hipocampo42. Além disso, trabalhos recentes sugerem que Per1 pode "portar" a formação de memória espacial ao longo do ciclo dia/noite, controlando a fosforilação de CREB6,28,29. De fato, a regulação positiva do mRNA Per1 do hipocampo foi observada após o aprendizado de contexto ou espacial em pelo menos três outros estudos de RNA-seq, incluindo trabalho em ratos, indicando que Per1 é tipicamente regulado positivamente após o aprendizado entre espécies20,43,44. Juntamente com os resultados do estudo atual, este trabalho indica que a expressão de PER1 é criticamente importante para a formação da memória de longo prazo do hipocampo; reduções no PER1 que ocorrem à noite29 ou com o envelhecimento podem prejudicar o hipocampomemória. A data,

pesquisa implicando Per1 emmemóriaA formação depende exclusivamente de nocautes globais que interrompem a expressão de Per1 no relógio circadiano central e outras regiões, além de estruturas relevantes para a memória, como o hipocampo6,28,29,45,46, tornando impossível determinar se o PER1 hipocampal é especificamente necessário para formação da memória. De fato, a deleção global de Per1 afeta a ritmicidade circadiana em alguns relatos42. Aqui, mostramos pela primeira vez que a redução da expressão de PER1 diretamente no hipocampo dorsal pode prejudicarmemóriaem camundongos jovens, enquanto a superexpressão local de Per1 no hipocampo dorsal pode melhorar a memória em camundongos idosos. Como a deleção seletiva HDAC3 (que regula Per1) no hipocampo dorsal não teve efeito nos padrões de atividade circadiana no estudo atual (Fig. 4 suplementar), e mesmo as lesões eletrolíticas do hipocampo dorsal são insuficientes para afetar a ritmicidade circadiana47, parece improvável que manipular Per1 dentro do hipocampo dorsal afeta a função do relógio circadiano central. No entanto, é possível que aumentos induzidos pela experiência em Per1 ou superexpressão de Per1 mediada por vírus possam afetar a oscilação circadiana de outros jogadores moleculares, como outros genes do relógio, dentro dos neurônios do hipocampo, mesmo sem afetar os padrões de atividade circadiana. Compreender como Per1 funciona para alterar a formação da memória, incluindo a identificação desses potenciais parceiros de interação, será o alvo de trabalhos futuros.

Juntos, esses resultados demonstram que o gene central do relógio circadiano Per1 desempenha um papel fundamental namemóriaestruturas para alterar a formação da memória, um papel que é independente de sua função no SCN. De maneira mais geral, isso desafia a hipótese tradicional de que as mudanças circadianas namemóriaformação são impulsionadas por alterações no relógio circadiano central e, em vez disso, apoia a hipótese de que os genes do relógio circadiano desempenham um papel mais autônomo nas células do hipocampo, possivelmente controlando a formação da memória com base na hora do dia6.

Métodos

Ratos. Os camundongos adultos jovens tinham entre 2 e 4 meses de idade no momento do teste e os camundongos idosos tinham entre 18 e 20 meses de idade. Todos os camundongos eram C57BL/6J ou mantidos em um fundo C57BL/6 (camundongos HDAC3 plus/plus e HDAC3flox/flox). Os camundongos tiveram livre acesso a comida e água e as luzes foram mantidas em um ciclo claro/escuro de 12 h. Todos os testes comportamentais foram realizados durante o ciclo de luz. Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA para cuidados e uso de animais e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia, Irvine.

Cirurgia. Os camundongos foram anestesiados com isoflurano (induzido, 4 por cento; mantido 1,5-2,0 por cento) e colocados no estereotáxico. As agulhas de injeção foram abaixadas para o hipocampo dorsal a uma taxa de 0,2 mm/15 s (AP, −2,0 mm; ML, ± 1,5 mm, DV, − 1,5 mm em relação ao Bregma ). Dois minutos após atingir a profundidade alvo, 1,{15}} ul de vírus ou siRNA foi infundido bilateralmente no DH a uma taxa de 6 ul/h. Para as infusões lentivirais CRISPR-SAM, um coquetel dos três vírus foi infundido em um volume final de 1,5 μL por hemisfério na mesma taxa. As agulhas de injeção permaneceram no local por dois minutos após a injeção para permitir a difusão do vírus. Os injetores foram então elevados 0,1 mm e deixados em repouso por mais um minuto antes de serem removidos a uma taxa de 0,1 mm por 15 s. As infusões virais foram realizadas 2 semanas antes da análise comportamental, enquanto o knockdown do siRNA foi realizado 2 dias antes do treinamento13. Para todos os experimentos de injeção, os animais foram aleatoriamente designados para as diferentes condições de injeção (com exceção de camundongos HDAC3 plus/plus e HDAC3flox/flox, que foram todos injetados com AAV-CaMKII-Cre). Para todos os experimentos comportamentais, os animais dentro de cada condição viral foram aleatoriamente designados para grupos de homecage/treinados e todas as condições (objetos, caixas, etc.) foram contrabalançadas entre os grupos.

Produção AAV. AAV2.1-CaMKII-Cre foi adquirido da Penn Vector Core (título: 1,81 × 1013 GC/ml). Para AAV2.1-HDAC3(Y298H)-v5, amplificamos HDAC3 de tipo selvagem a partir de cDNA do hipocampo e clonamos o produto em um pAAV-IRES-hrGFP modificado (Agilent) sob controle do promotor CMV e íntron -globina. A etiqueta 3×-FLAG, elemento IRES e hrGFP foram removidos do vetor e substituídos por uma etiqueta V5, permitindo uma fusão C-terminal com HDAC3 (plasmídeo MW91). Para criar a mutação pontual, alteramos os nucleotídeos para codificar um resíduo de histidina no lugar da tirosina no aminoácido 298 (plasmídeo MW92). Para o controle de vetor vazio, a sequência de codificação HDAC3 não estava presente, mas todos os outros elementos permanecem (plasmídeo MW87). O AAV foi feito pelo Penn Vector Core e os títulos finais foram determinados por qPCR (AAV-HDAC3(Y298H): 6,48 × 1012 GC/ml; AAV-EV: 1,35 × 1013 GC/ml).

Produção de lentivírus. Para o sistema CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM), os plasmídeos lentivirais foram adquiridos da Addgene para o dCas9- VP64-GFP (#61422-LVC) e MS2- Construções P65-HSF1_Hygro (#61426-LVC) (títulos maiores ou iguais a 8× 106 TU/ml). Para o sgRNA Per1, clonamos e inserimos uma sequência guia antisense correspondente ao elemento CRE no promotor Per1 (AGAGGGAGGTGACGTCAAAG) no esqueleto de clonagem Addgene sgRNA(MS2) (#61427). O sgRNA de controle era idêntico, exceto que nenhuma sequência guia foi clonada no plasmídeo. Os lentivírus tanto para o sgRNA Per1 (título: 6,8 × 107 IFU/ml) quanto para o sgRNA controle (3,5 × 107 IFU/ml) foram produzidos pela Escola de Farmácia Lentiviral Laboratory da USC.

Para o construto de superexpressão pLVX-V5Per1, amplificamos Per1 de tipo selvagem completo do plasmídeo Addgene pCMV-Sport2-mPer1 (#16203) e clonamos o produto em um pLVX-EF modificado1 -IRES-mCherry espinha dorsal (Takara, #631987). Os elementos IRES e mCherry foram removidos e substituídos por uma etiqueta V5, permitindo uma fusão N-terminal com PER1 (plasmídeo MW206). Para o controle de vetor vazio (EV), a sequência de codificação PER1 não estava presente, mas todos os outros elementos permaneceram (Plasmídeo MW93). Os lentivírus para o pLVX-v5Per1 (título: 1,3 × 108 IFU/ml) e pLVX-EV (título: 1,5 × 108 IFU/ml) foram produzidos pelo Laboratório de Lentiviral da Escola de Farmácia da USC. Todos os construtos lentivirais foram expressos sob o promotor EF1.

Verificação de cultura celular de pLVX-v5Per1 e CRISPR-SAM. Para verificar se pLVX-v5Per1 produz superexpressão de mRNA Per1, células HT22 de camundongo (Salk Institute, La Jolla, CA, #T09031) foram transfectadas com pLVX-v5Per1 ou pLVX-EV (Fig. 5a) usando Lipofectaine LTX (Invitrogen). Da mesma forma, para verificar se o sistema CRISPR-SAM pode efetivamente conduzir a transcrição Per1, células HT22 foram transfectadas com dCas9-VP64 (lenti MS2-P65_HSF1_Blast foi um presente de Feng Zhang Addgene plasmid #61425), MS2-P65-HSF1 (lenti dCAS-VP64_Blast foi um presente de Feng Zhang, Addgene plasmid #61426), e ou Per1 sgRNA (Per1 sgRNA) ou o sgRNA de controle não direcionado (ctrl sgRNA) (lenti sgRNA (MS2)_zeo backbone foi um presente de Feng Zhang, Addgene plasmid #61427) usando Lipofectamine LTX (Invitrogen). As células foram colhidas após 24 ou 48 h, lisadas e o mRNA foi isolado como descrito acima. qRT-PCR foi realizado como descrito acima usando os iniciadores e sonda Per1, Per2 e Hes7 listados na Tabela S4.

siRNA. Para o experimento knockdown Per1, pequenos RNAs interferentes Accell SMARTpool (siRNAs; Dharmacon, GE) visando Per1 foram diluídos para uma concentração total final de 10 μM em ddH20 e infundidos no DH (1,0 ul/lado). O siRNA do pool não direcionado Accell foi usado como controle (concentração total, 10 μM) e foi infundido da mesma maneira. Para experimentos de siRNA, os camundongos foram manipulados e habituados conforme descrito acima e a cirurgia foi realizada no dia seguinte ao último dia de habituação. Os camundongos receberam um dia inteiro de recuperação após a cirurgia e foram treinados no dia seguinte (~ 48 h após a cirurgia) para garantir o knock-down máximo do alvo. Para garantir o knockdown, os camundongos foram sacrificados ~ 1 h após o teste e os socos do hipocampo dorsal foram processados ​​com western blots para garantir o knockdown da proteína PER1.

Localização de objetos e reconhecimento de objetosmemóriatarefas. Para as tarefas de localização de objetos e memória de reconhecimento de objetos, os camundongos foram manipulados por 2 min/dia por 4 dias e então habituados ao contexto por 5 min/dia por seis dias consecutivos na ausência de objetos. Durante o treinamento, os camundongos foram expostos a dois objetos idênticos (bebés de 100 ml, latas de especiarias ou castiçais de vidro) e deixados para explorar por 10 min. Durante o teste de retenção (24 h depois paramemóriaou 60 m depois para memória de curto prazo), os camundongos foram autorizados a explorar por 5 min. Para localização do objetomemória, um dos dois objetos familiares foi movido para um novo local. Para reconhecimento de objetosmemória, as localizações dos objetos permaneceram constantes, mas um dos objetos foi substituído por um novo item. A habituação para a memória de reconhecimento de objetos começou pelo menos uma semana após a conclusão do teste OLM e um novo contexto e objetos desconhecidos foram usados48. A exploração foi pontuada quando a cabeça do rato se orientou em direção ao objeto e chegou a 1 cm ou quando o nariz tocou o objeto. O tempo total de exploração foi registrado (t) e a preferência pelo novo item foi expressa como um índice de discriminação (DI=(tnovel -tfamiliar) / (tnovel mais tfamiliar) x 100 por cento ). Para sessões de treinamento, o objeto designado para ser movido no teste foi usado como o novo objeto para permitir que o treinamento e teste DI fossem comparados diretamente. Camundongos que exploraram ambos os objetos por menos de 2 s durante o teste ou 3 s durante o treinamento foram removidos das análises posteriores. Camundongos que mostraram preferência por um objeto durante o treinamento (DI > ±20) também foram removidos. As sessões de habituação foram analisadas (para determinar a distância percorrida e a velocidade) usando o software de análise comportamental ANY-maze (Stoelting Co). Toda habituação, treinamento, teste e pontuação foram realizados por experimentadores cegos para os grupos experimentais.

Contexto medo de condição. Para condicionamento de medo contextual, os camundongos foram manuseados pela primeira vez por 5 dias. Durante a aquisição, os camundongos foram expostos ao contexto por 2 min e 28 s seguidos por um choque de 2 s (0,75 mA), um protocolo que normalmente produz memória de longo prazo robusta12,20. Os camundongos permaneceram no contexto por mais 30 s antes de serem removidos. Os camundongos foram sacrificados 60 m após o treinamento, juntamente com os controles da gaiola que foram manipulados, mas não treinados. O comportamento de congelamento foi medido usando o software Ethovision 11 (Noldus)12.

Labirinto em cruz elevado. O labirinto em cruz foi conduzido por um experimentador cego aos grupos experimentais. Uma semana após a conclusão do ORM, um subconjunto de camundongos foi testado no labirinto em cruz. Dois braços do labirinto foram abertos (30 × 5 cm) e dois braços foram fechados (30 × 5 × 15 cm), conectados por uma plataforma central (5 × 5 cm). O labirinto foi elevado 40 cm acima do chão. Os camundongos foram testados por 5 min no aparelho, que consistiu em colocar cada camundongo na plataforma central de frente para um dos braços abertos. Entre os sujeitos, o labirinto foi limpo com 70% de etanol. A porcentagem de tempo gasto nos braços fechado e aberto foi pontuada usando o software ANY-maze.

Análise do ritmo circadiano. Camundongos jovens ({{0}}}mês) e idosos (18-mês) HDAC3 plus/plus e HDAC3flox/flox foram criados e alojados sob um ciclo claro/escuro (LD) de 12 h. Duas semanas após a infusão de AAV-CaMKII-Cre (descrita acima), os camundongos foram transferidos para uma sala de arrastamento de 12 h LD isolada por 7 dias. Os camundongos foram então transferidos para uma sala de análise de atividade protegida da luz, onde a atividade locomotora foi analisada usando detectores de movimento de feixe óptico (Philips Respironics). A atividade foi monitorada durante 2 semanas de arrastamento do ciclo LD na sala protegida da luz antes dos camundongos serem trocados para escuridão constante (DD) por mais 3 semanas. O monitoramento da atividade continuou durante toda a fase DD para determinar se a deleção de HDAC3 no DH afetou os ritmos circadianos endógenos. Os dados foram coletados usando o Minimitter VitalView 5.0 e o software Clocklab (Actimetrics) foi usado para determinar o início da atividade livre. Os valores de Tau foram calculados obtendo-se a inclinação deste início e calculando-se o ajuste dos mínimos quadrados com o software Clocklab49,50.

Imuno-histoquímica. Após a conclusão do comportamento, os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical e seus cérebros foram removidos e congelados em isopentano gelado. Fatias de vinte micrômetros foram coletadas em todo o campus dorsal do quadril, descongeladas em lâminas e armazenadas a -80 graus. As lâminas foram fixadas com 4 por cento de paraformaldeído (10-min), permeabilizado em 0.01 por cento de Triton X-100 em 0,1 M PBS (5-min) , e bloqueado por 1 h com 8 por cento de soro de cabra normal (Jackson). As lâminas foram incubadas durante a noite (4 graus) em anticorpo de coelho para HDAC3 (1:250, Abcam, clone Y415, ab32369) ou V5 (1:1000, Abcam, ab9116), ou anticorpo de galinha para GFP (1:250, Aves Labs, #GFP1010). No dia seguinte, as lâminas foram lavadas e incubadas por 1 h em temperatura ambiente com anti-coelho de cabra Alexa 488 (HDAC3 e V5; 1:1000, ThermoFisher, #A-11008) ou anti-frango de cabra Alexa 488 (GFP ; 1:1000, ThermoFisher, #A-11039) no escuro. As lâminas foram então lavadas com PBST e incubadas por 50 m em NeuroTrace 530/615 (1:50; ThermoFisher, #N21482), um corante nissl fluorescente. Para extinguir a autofluorescência não específica51, as fatias foram então lavadas em PBS com 0,01 por cento de Triton, enxaguadas em água e incubadas por 10-min em CuSO4 10 mM em tampão de acetato de amônio 50 mM. As fatias foram novamente lavadas em água, lavadas em PBS e cobertas com lamínula com meio de montagem VectaShield Antifade (Vector Laboratories).

Todas as imagens foram adquiridas com um Olympus Scanner VS110 com uma objetiva apocromática de 20x (abertura numérica 0,75) com o software do scanner VS110. Todos os grupos de tratamento foram representados em cada lâmina e todas as imagens em uma lâmina foram capturadas com o mesmo tempo de exposição sob condições não saturadas. A intensidade de imunomarcação foi quantificada com ImageJ amostrando a densidade óptica da camada de células em CA1 e subtraindo uma amostra de fluorescência de fundo na mesma imagem. Para todos os experimentos de AAV, os animais que não expressaram o vírus na área CA1 do hipocampo dorsal foram excluídos das análises. A imagem e a quantificação foram realizadas por experimentadores cegos às condições experimentais.

Mancha ocidental. Para verificar o knockdown de PER1, os camundongos Per1 siRNA e controle siRNA foram sacrificados 2 h após o teste e os cérebros foram congelados. Os cérebros foram seccionados coronalmente e perfurações de 1 mm DH foram coletadas de fatias de 500 μm. Os punções foram homogeneizados em tampão T-PER (Thermo Fisher) com Halt protease e inibidor de fosfatase (Thermo Fisher) usando um homogeneizador Dounce. Os lisados ​​de proteína foram quantificados usando um ensaio de Bradford modificado (BioRad) e 5 0 ug de lisado de proteína total foi carregado em cada pista de um gel NuPAGE Bis-Tris a 7,5 por cento (Thermo Fisher). Os géis funcionaram durante 50 min a 200 volts e os blots foram transferidos durante a noite a 15 V a 4 graus para membranas de nitrocelulose (Novexi, LC2001). No dia seguinte, as membranas foram incubadas em tampão de bloqueio por 1 h (5 por cento de leite desnatado em solução salina tamponada com Tris com 0,01 por cento de Tween 20), lavadas (0,1 por cento de Tween 20 em TBS) e depois incubadas em anticorpo primário (1:500, coelho anti-Per1, Thermo Fisher #PA1-524) em tampão de anticorpo primário (3 por cento de BSA em TBS com 0,1 por cento de Tween) durante a noite a 4 graus. As membranas foram então lavadas e incubadas em anticorpo de camundongo conjugado com HRP para coelho (1:10,000, Jackson Laboratories, específico para cadeia leve, #211-032-171) por 1 h. As membranas foram lavadas e reveladas usando Pierce SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, 34077). Várias exposições de filmes foram usadas para verificar a linearidade. Os blots foram lavados e removidos por 10 m com Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher #21059), lavados novamente, e então novamente sondados durante a noite (4 graus) com um anticorpo de coelho para GAPDH (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, SC25778 ). Os blots de PER1 e GAPDH de comprimento total são mostrados na Figura Suplementar 5. As densidades ópticas relativas foram calculadas a partir do filme digitalizado usando ImageJ (US National Institutes of Health) por um experimentador cego para as condições experimentais. Todos os valores foram normalizados para os níveis de expressão de GAPDH.

qRT-PCR. O tecido foi coletado de punções DH (descritos acima) e congelado a -80 graus até o processamento. O RNA foi isolado usando um RNeasy Minikit (Qiagen, #74104) e o cDNA foi criado usando o kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche, 04379012001). Primers e sondas foram derivados da Roche Universal ProbeLibrary (Tabela S4) e foram usados ​​para multiplexação na máquina Roche Light-Cycle 480 II (Roche). Todos os valores foram normalizados para Gapdh. As análises e estatísticas foram realizadas utilizando os algoritmos proprietários da Roche e o software REST 2009 baseado no método Pfafff52,53.

RNA sequencing. RNA was isolated from dorsal hippocampus punches as described above, using the RNeasy Minikit (Qiagen, 74104). RNA quality was assessed by Bioanalyzer and samples with an RNA integrity number >9 foram incluídos em nossa análise. As bibliotecas de cDNA para cada grupo foram preparadas de acordo com o Guia de Preparação de Amostras de RNA TruSeq (Illumina). Duzentos e cinquenta nanogramas de RNA total de cada camundongo foram purificados com esferas magnéticas poli-T oligo-ligadas e fragmentadas por calor. A primeira e a segunda fita de cDNA foram então sintetizadas e purificadas. Após o embotamento das extremidades, a extremidade 3' foi adenilada para evitar a concatenação do molde durante a ligação do adaptador. Para cada grupo, um conjunto de adaptadores exclusivo foi adicionado às extremidades do cDNA e as bibliotecas foram amplificadas por PCR. A qualidade da biblioteca foi avaliada pelo Bioanalyzer e quantificada usando qRT-PCR com uma curva padrão preparada a partir de uma biblioteca de sequenciamento comercial (Illumina). As amostras foram multiplexadas, com cada grupo comportamental representado em cada célula de fluxo do sequenciador. 10 nM de cada biblioteca foram agrupados em quatro bibliotecas multiplex e sequenciados em um instrumento Illumina HiSeq 2500 durante um sequenciamento de 50 bp de leitura única, executado pelo Genomic High- Throughput Facility da Universidade da Califórnia, Irvine. Os dados de sequenciamento resultantes para cada biblioteca foram pós-processados ​​para produzir arquivos FastQ. Os dados foram então demultiplexados e filtrados usando o software Illumina CASAVA 1.8.2, bem como software interno. Leituras de baixa qualidade (falhando nos testes de qualidade padrão da Illumina) e leituras de controle alinhadas com sucesso ao genoma de controle PhiX foram removidas das análises. A qualidade das sequências restantes foi ainda avaliada usando pontuações de qualidade PHRED produzidas em tempo real durante a etapa de chamada de base da execução de sequenciamento (Fig. 3a complementar).

Alinhamento com o genoma de referência e transcriptoma. As leituras de cada experimento foram alinhadas separadamente ao genoma de referência e ao transcriptoma correspondente usando alinhadores de leitura curta ELAND v2e (Illumina) e Bowtie24. As leituras alinhadas exclusivamente por ambas as ferramentas para exons conhecidos ou junções de emenda com não mais do que duas incompatibilidades em qualquer fragmento de 25 pb da leitura foram incluídas no transcriptoma. As leituras alinhadas exclusivamente, mas com mais de duas incompatibilidades em qualquer fragmento de 25 bp da leitura, foram removidas das análises. Da mesma forma, as leituras correspondentes a vários locais no genoma de referência foram removidas da análise. A porcentagem de leituras atribuídas ao genoma de referência e ao transcriptoma usando este protocolo é relatada para cada grupo de réplicas (Fig. 3b suplementar). Isso resultou em uma média de aproximadamente 30 milhões de leituras por amostra.

Para verificar a presença dos plasmídeos pLVX e CRISPR-SAM após a infusão lentiviral, executamos o sequenciamento de RNA em amostras do hipocampo de um subconjunto de três animais por grupo seguindo o comportamento. Como o número de células infectadas com os lentivírus in vivo era muito pequeno para detectar com segurança a presença dos transcritos apropriados usando RT-qPCR (Fig. 6a, d complementar), usamos RNA-seq como um método mais sensível para detectar a presença dessas transcrições. Uma versão atualizada da montagem do genoma e anotação do genoma foi construída anexando as sequências e anotação das construções de plasmídeo ao genoma original do camundongo mm10 e à anotação do genoma do camundongo mm10, respectivamente. Usando a ferramenta de alinhamento de leituras TopHat no Tuxedo Suite54, as leituras foram mapeadas para o genoma e apenas os acessos que eram exclusivos dos transcritos de plasmídeo em comparação com o genoma de referência de camundongo endógeno foram considerados "leituras correspondentes" aos construtos de plasmídeo. O número dessas leituras combinadas foi então quantificado para cada construto para cada amostra.

Expressão gênica e análise diferencial. Os níveis de expressão gênica foram calculados diretamente a partir dos resultados de alinhamento de leitura para cada réplica. Valores RPKM padrão55, leituras por quilobase do modelo de exon por milhão de leituras mapeadas) foram extraídos para cada gene coberto pelos dados de sequenciamento e cada réplica usada neste estudo.

Análises transcricionais diferenciais foram realizadas usando Cyber ​​T56,57 em cada par de grupos (homecage versus 60 m após o treinamento) para identificar genes regulados para cima ou para baixo após OLM. Além dos 18-camundongos HDAC3 plus/plus e HDAC3flox/flox de um mês de idade treinados para o estudo atual, dados de sequenciamento de RNA processados ​​de forma idêntica de {{10}}camundongos C57 de tipo selvagem de meses de idade ( homecage e OLM treinados da mesma forma que o estudo atual) de um estudo anterior20 foi usado para análises diferenciais. O número de animais (repetições biológicas) para cada grupo foi: Young HDAC plus/plus HC: 6, Young HDAC3 plus/plus OLM: 6, Old HDAC3 plus/plus HC: 6, Old HDAC3 plus/plus OLM: 6, Old HDAC3flox/flox HC: 8, HDAC3flox/flox OLM antigo: 8. Não foram utilizadas réplicas técnicas. O limiar do valor p usado para determinar a expressão diferencial é 0,05 para todos os grupos. A taxa de falsa descoberta (FDR) medida pelo valor q de Benjamini & Hochberg (BH) foi usada para corrigir vários testes, com um limite de FDR de 0,15. Os conjuntos de genes regulados positivamente após a experiência (em comparação com o homecage) para esses 3 grupos (jovem selvagem, envelhecimento HDAC plus / plus ou envelhecimento HDAC3flox/flox) foram intersectados para determinar genes comuns a dois ou mais grupos. O enriquecimento de cada grupo para expressão específica de tecido, termos Gene Ontology58 e vias KEGG59,60 foi avaliado usando DAVID61, com base em genes diferencialmente expressos após comportamento. A visualização de dados foi realizada usando "matplotlib" para python e "ggplot" para R.

Imunoprecipitação da cromatina. O ChIP foi realizado em punções DH com base no protocolo do kit Millipore ChIP11,12,62. O tecido foi reticulado com formaldeído a 1 por cento (Sigma), lisado e sonicado, e a cromatina foi imunoprecipitada durante a noite com 2 ul de anti-H4K8Ac (Millipore #17-10099) ou 4 ul de anti-HDAC3 (Millipore #{{ 13}}) ou uma quantidade equivalente de Soro de Coelho Normal (controle negativo H4K8Ac, Millipore) ou IgG anti-camundongo (controle negativo HDAC3, Millipore). Após a lavagem, a cromatina foi eluída das esferas e reticulada na presença de proteinase K antes da purificação da coluna de DNA. As sequências de iniciadores para os promotores de cada gene foram desenhadas pelo programa Primer 3 (Tabela S4). Cinco ul de entrada, IgG anti-H4K8Ac/IgG anti-HDAC3, ou imunoprecipitado IgG anti-coelho/camundongo de cada animal foram examinados em duplicata. Para normalizar os dados de ChIP-qPCR, usamos o método de entrada percentual. A amostra de entrada foi ajustada para 100 por cento e as amostras de IP e IgG foram calculadas como uma porcentagem desta entrada usando a fórmula 100*AE^(entrada ajustada – Ct(IP)). O enriquecimento de dobras foi então calculado como uma razão do ChIP para a IgG média. Uma curva padrão na placa determinou a eficiência de amplificação (AE).

Preparação e gravação de fatias. Camundongos jovens (aproximadamente 3-mês) e idosos (18-mês) foram infundidos estereotaxicamente com o vírus. Para o primeiro experimento, camundongos HDAC3 plus/plus e HDAC3flox/flox jovens e velhos foram infundidos com AAV-CaMKII-Cre bilateralmente no DH. Para o segundo experimento, camundongos C57 de tipo selvagem jovens e velhos foram infundidos com AAV-HDAC3(Y298H) no DH de um hemisfério e controle de AAV-EV no outro hemisfério. Duas semanas após a infusão (para permitir a expressão ideal do vírus)2, fatias transversais do hipocampo (320 μm) foram colocadas em uma câmara de gravação de interface com líquido cefalorraquidiano artificial pré-aquecido (31 ± 1 grau) (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, MgSO4 1,5 mM, CaCl2 2,5 mM, NaHCO3 26 mM e D-glicose 10 mM). As fatias foram continuamente perfundidas a uma taxa de 1,75-2 ml por minuto, enquanto a superfície das fatias foi exposta a 95% de O2/5% de CO2 quente e umidificado. As gravações começaram após pelo menos 2 h de incubação.

Potenciais pós-sinápticos excitatórios de campo (fEPSPs) foram registrados a partir do estrato radiatum CA1b usando uma única pipeta de vidro (2–3MΩ) preenchida com NaCl 2 M. Pulsos de estimulação (0.05 Hz) foram entregues às projeções colateral-comissurais de Schaffer usando um eletrodo estimulador bipolar (fio de nicromo torcido, 65 μm) posicionado em CA1c. A intensidade da corrente foi ajustada para obter 50 por cento da resposta máxima de fEPSP. Depois que uma linha de base estável foi estabelecida, LTP foi induzida com um único trem de cinco rajadas teta, em que cada rajada (quatro pulsos a 100 Hz) foi entregue com 200 ms de distância (ou seja, na frequência teta). A intensidade de estimulação não foi aumentada durante o TBS. Os dados foram coletados e digitalizados pelo NAC 2.0 Neurodata Acquisition System (Theta Burst).

Análise estatística. As análises estatísticas foram realizadas conforme indicado no texto e nas legendas das figuras usando o Prism 6 (GraphPad). Nossas abordagens analíticas são baseadas em trabalhos publicados anteriormente12,20,63,64. Não foram utilizados métodos estatísticos para pré-determinar o tamanho das amostras, mas nossos tamanhos amostrais são semelhantes aos geralmente usados ​​na área, incluindo aqueles relatados em publicações anteriores12,20,64,65. A distribuição dos dados foi considerada normal, com variância semelhante observada entre os grupos, mas isso não foi formalmente testado. Quando um experimento tinha dois grupos para comparar, os testes t de Student bicaudal eram usados. Quando dois fatores foram comparados (como idade e genótipo ou sessão e grupo), os dados foram analisados ​​com ANOVAs de duas vias seguidas de testes post hoc de comparações múltiplas de Sidak. Todas as análises são bicaudais, com um valor de 0,05 necessário para significância. As barras de erro em todas as figuras representam SEM. Para todos os experimentos, valores ± 2DP da média do grupo foram considerados outliers e foram removidos das análises.

Disponibilidade de dados. Os dados que suportam os achados deste estudo estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação razoável. Os dados de sequenciamento de RNA foram depositados no Gene Expression Omnibus do NCBI e podem ser acessados ​​através do número de acesso da série GEO GSE94832.

Referências

1. Deibel, SH, Zelinski, EL, Keeley, RJ, Kovalchuk, O. & McDonald, RJ Alterações epigenéticas no núcleo supraquiasmático e hipocampo contribuem para o declínio cognitivo relacionado à idade. Oncotarget 6, 23181–23203 (2015).

2. Gerstner, JR & Yin, JC Ritmos circadianos e formação da memória. Nat. Rev. Neurosci. 11, 577-588 (2010).

3. Eckel-Mahan, KL et ai. Oscilação circadiana da atividade da MAPK hipocampal e cAmp: implicações para a persistência da memória. Nat. Neurociência. 11, 1074-1082 (2008).

4. Chaudhury, D. & Colwell, CS Modulação circadiana de aprendizagem e memória em camundongos condicionados pelo medo. Comportamento Res. Cérebro. 133, 95-108 (2002).

5. Kondratova, AA & Kondratov, RV O relógio circadiano e a patologia do cérebro envelhecido. Nat. Rev. Neurosci. 13, 325-335 (2012).

6. Rawashdeh, O., Jilg, A., Maronde, E., Fahrenkrug, J. & Stehle, JH Period1 gates a modulação circadiana da sinalização relevante para a memória no hipocampo do rato regulando o transporte nuclear da CREB quinase pP90RSK. J. Neurochem. 138, 731-745 (2016).

7. Penner, MR, Roth, TL, Barnes, CA & Sweatt, JD Uma hipótese epigenética de disfunção cognitiva relacionada ao envelhecimento. Frente Envelhecimento Neurosci. 2, 9 (2010).

8. Peleg, S. et ai. A acetilação alterada de histonas está associada ao comprometimento da memória dependente da idade em camundongos. Ciência 328, 753-756 (2010).

9. Snigdha, S. et ai. A inibição do H3K9me3 melhora a memória, promove a formação da coluna e aumenta os níveis de BDNF no hipocampo envelhecido. J. Neurosci. 36, 3611-3622 (2016).

10. Spiegel, AM, Sewal, AS & Rapp, PR Contribuições epigenéticas para o envelhecimento cognitivo: separando o tempo de mente e o tempo de vida. Aprenda Mem. 21, 569-574 (2014).

11. Malvaez, M. et al. O inibidor seletivo de HDAC3-aumenta a extinção do comportamento de busca de cocaína de maneira persistente. Proc. Natl Acad. Sci. EUA 110, 2647–2652 (2013).

12. Kwapis, JL et ai. O contexto e o medo auditivo são regulados diferencialmente pela atividade HDAC3 nos subnúcleos laterais e basais da amígdala. Neuropsicofarmacologia 42, 1284-1294 (2017).

13. McQuown, SC et al. HDAC3 é um regulador negativo crítico da formação de memória de longo prazo. J. Neurosci. 31, 764-774 (2011).

14. Bieszczad, KM et ai. A inibição da histona deacetilase via RGFP966 libera os freios na plasticidade sensorial cortical e na especificidade da formação da memória.J. Neurociência. 35, 13124-13132 (2015).

15. Lahm, A. et ai. Desvendando a atividade catalítica oculta das histonas desacetilases de classe IIa de vertebrados. Proc. Natl Acad. Sci. EUA 104, 17335-17340 (2007).

16. Sun, Z. et ai. A função independente de deacetilase de HDAC3 na transcrição e metabolismo requer um corepressor do receptor nuclear. Mol. Célula 52, 769-782 (2013).

17. Alaghband, Y. et al. Papéis distintos para o domínio desacetilase de HDAC3 no hipocampo e córtex pré-frontal medial na formação e extinção da memória. Neurobiol. Aprender. Memória 145, 94-104 (2017).

18. Nott, A. et al. A histona deacetilase 3 se associa ao MeCP2 para regular o FOXO e o comportamento social. Nat. Neurociência. 19, 1497-1505 (2016).

19. Norwood, J., Franklin, JM, Sharma, D. & D'Mello, SR A histona desacetilase 3 é necessária para o desenvolvimento adequado do cérebro. J. Biol. Química 289, 34569-34582 (2014).

20. Vogel-Ciernia, A. et al. A subunidade reguladora da cromatina específica do neurônio BAF53b é necessária para a plasticidade sináptica e memória. Nat. Neurociência. 16, 552-561 (2013).

21. Alberini, CM Fatores de transcrição na memória de longo prazo e plasticidade sináptica. Fisiol. Rev. 89, 121-145 (2009).

22. Barnes, CA Potenciação de longo prazo e envelhecimento cerebral. Philos. Trans. R. Soc. Londres. B 358, 765-772 (2003).

23. Speir, ML et al. O banco de dados UCSC Genome Browser: atualização de 2016. Res. de Ácidos Nucleicos. 44, D717–D725 (2016).

24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, SL Alinhamento ultrarrápido e eficiente de memória de sequências curtas de DNA ao genoma humano. Genoma Biol. 10, R25 (2009).

25. Rowe, WB et al. Análises de expressão hipocampal revelam associação seletiva de vias imediatas precoces, neuroenergéticas e mielinogênicas com comprometimento cognitivo em ratos idosos. J. Neurosci. 27, 3098-3110 (2007).

26. McNulty, SE et al. Papéis diferenciais para Nr4a1 e Nr4a2 na localização de objetos vs. memória de longo prazo de reconhecimento de objetos. Aprenda Mem. 19, 588-592 (2012).

27. Vecsey, CG, Park, AJ, Khatib, N. & Abel, T. Efeitos da privação do sono e envelhecimento na memória remota e de longo prazo em camundongos. Aprenda Mem. 22, 197-202 (2015).

28. Rawashdeh, O. et ai. PERIOD1 coordena os ritmos hipocampais e o processamento da memória com o dia. Hipocampo 24, 712-723 (2014).

29. Jilg, A. et ai. A dinâmica temporal da expressão do gene do relógio hipocampal do camundongo suporta o processamento da memória. Hipocampo 20, 377-388 (2010).

30. Eckel-Mahan, KL As oscilações circadianas dentro do hipocampo apoiam a formação e a persistência da memória. Frente Mol. Neurociência. 5, 46 (2012).

31. Guzowski, JF, Setlow, B., Wagner, EK & McGaugh, JL Expressão gênica dependente da experiência no hipocampo de rato após aprendizagem espacial: uma comparação dos genes precoces imediatos Arc, c-fos e zif268. J. Neurosci. 21, 5089-5098 (2001).

32. Kouzarides, T. Modificações de cromatina e sua função. Célula 128, 693-705 (2007).

33. Konermann, S. et ai. Ativação transcricional em escala de genoma por um complexo CRISPR-Cas9 projetado. Natureza 517, 583-588 (2015).

34. Sharma, M., Shetty, MS, Arumugam, TV & Sajikumar, S. A inibição da histona deacetilase 3 restabelece a marcação sináptica e a captura no envelhecimento através da ativação do fator nuclear kappa B. Sci. Rep. 5, 16616 (2015).

35. Kramar, EA et ai. Evidência sináptica para a eficácia da aprendizagem espaçada. Proc. Natl Acad. Sci. EUA 109, 5121–5126 (2012).

36. Barrett, RM et al. O nocaute focal hipocampal da CBP afeta modificações específicas de histonas, potencialização de longo prazo e memória de longo prazo. Neuropsicofarmacologia 36, ​​1545-1556 (2011).

37. Franklin, AV, Rusche, JR & McMahon, LL O aumento da potenciação de longo prazo nas sinapses de células granulares com perfurantes mediais induzida pela inibição seletiva da histona desacetilase 3 requer proteína de retardo mental X frágil. Neurobiol. Aprender. Memória 114, 193-197 (2014).

38. Silva, AJ, Kogan, JH, Frankland, PW & Kida, S. CREB e memória. Anu. Rev. Neurosci. 21, 127-148 (1998).

39. Kida, S. & Serita, T. Funções funcionais de CREB como um regulador positivo na formação e aprimoramento da memória. Res. Cérebro. Touro. 105, 17-24 (2014).

40. Smith, KT, Nicholls, RD & Reines, D. O gene que codifica a proteína de ligação ao RNA X frágil é controlado pelo fator respiratório nuclear 2 e pela família CREB de fatores de transcrição. Res. de Ácidos Nucleicos. 34, 1205-1215 (2006).

41. Wang, H. et ai. Papéis de CREB na regulação de FMRP por receptores de glutamato metabotrópicos do grupo I no córtex cingulado. Mol. Cérebro 5, 27 (2012).

42. Cermakian, N., Mônaco, L., Pando, MP, Dierich, A. & Sassone-Corsi, P. Alterou os ritmos comportamentais e a expressão do gene do relógio em camundongos com uma mutação direcionada no gene Period1. EMBO J. 20, 3967-3974 (2001).

43. Halder, R. et ai. Alterações na metilação do DNA em genes de plasticidade acompanham a formação e manutenção da memória. Nat. Neurociência. 19, 102-110 (2016).

44. Duke, CG, Kennedy, AJ, Gavin, CF, Day, JJ & Sweatt, JD Reorganização epigenômica dependente da experiência no hipocampo. Aprenda Mem. 24, 278-288 (2017).

45. Sakai, T., Tamura, T., Kitamoto, T. & Kidokoro, Y. Um gene do relógio, ponto final, desempenha um papel fundamental na formação da memória de longo prazo em Drosophila. Proc. Natl Acad. Sci. EUA 101, 16058-16063 (2004).

46. ​​Abarca, C., Albrecht, U. & Spanagel, R. A sensibilização e recompensa da cocaína estão sob a influência de genes e ritmo circadianos. Proc. Natl Acad. Sci. EUA 99, 9026-9030 (2002).

47. Phan, TX, Chan, GC, Sindreu, CB, Eckel-Mahan, KL & Storm, DR A oscilação diurna das atividades de MAP (proteína ativada por mitógeno) e adenilil ciclase no hipocampo depende do núcleo supraquiasmático. J. Neurosci. 31, 10640-10647 (2011).

48. Vogel-Ciernia, A. & Wood, MA Examinando a localização de objetos e memória de reconhecimento de objetos em camundongos. atual Protocolo Neurociência. 69, 1-17 (2014).

49. Orozco-Solis, R. et ai. O relógio circadiano no hipotálamo ventromedial controla o gasto energético cíclico. Célula Metab. 23, 467-478 (2016).

50. Eckel-Mahan, K. & Sassone-Corsi, P. Fenotipagem de ritmos circadianos em camundongos. atual Protocolo Rato Biol. 5, 271-281 (2015).

51. Schnell, SA, Staines, WA & Wessendorf, MW Redução de autofluorescência tipo lipofuscina em tecido marcado com fluorescência. J. Histochem. Citoquímico. 47, 719-730 (1999).

52. Pfafff, MW Um novo modelo matemático para quantificação relativa em RT-PCR em tempo real. Res. de Ácidos Nucleicos. 29, e45 (2001).

53. Pfaffle, MW, Horgan, GW & Dempfle, L. Ferramenta de software de expressão relativa (REST) ​​para comparação em grupo e análise estatística de resultados de expressão relativa em PCR em tempo real. Res. de Ácidos Nucleicos. 30, e36 (2002).

54. Trapnell, C. et ai. Análise diferencial de expressão gênica e de transcrição de experimentos de RNA-seq com TopHat e Cufflinks. Nat. Protocolo 7, 562-578 (2012).

55. Mortazavi, A., Williams, BA, McCue, K., Schaeffer, L. & Wold, B. Mapeamento e quantificação de transcriptomas de mamíferos por RNA-Seq. Nat. Métodos 5, 621-628 (2008).

56. Kayala, MA & Baldi, P. Servidor web Cyber-T: análise diferencial de dados de alto rendimento. Res. de Ácidos Nucleicos. 40, W553–W559 (2012).

57. Baldi, P. & Long, AD Uma estrutura Bayesiana para a análise de dados de expressão de microarranjos: teste t regularizado e inferências estatísticas de alterações genéticas. Bioinformática 17, 509-519 (2001).