Parte 2:Echinacoside protege contra a apoptose neuronal induzida por MPP plus via regulação da via ROS/ATF3/CHOP

EchinacosideProtege contra a apoptose neuronal induzida por MPP plus via regulação da via ROS/ATF3/CHOP

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

Contato:joanna.jia@wecistanche.com

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Cistanche echinacosidetem propriedades antioxidantes

Coloração por imunofluorescência

1 mmol/L MPP?, 40 LG/mL ECH, ou uma combinação de MPP? e ECH. As células foram então incubadas em um tampão de bloqueio (3 por cento BSA em PBS) à temperatura ambiente (RT) por 30 min. Em seguida, os anticorpos anti-ATF3, anti-CHOP ou anti-caspase 3 clivada foram diluídos a 1:100 em tampão de bloqueio (1 por cento de BSA em PBS com 0,3 por cento de Triton X-100) e incubados durante a noite a 4C. Após a lavagem três vezes com PBS, as células foram incubadas com Alexa 488-IgG anti-coelho de cabra (Life Technologies, Carlsbad, CA) à temperatura ambiente por

1h. Os núcleos foram corados com Hoechst 33342. As imagens foram capturadas com um microscópio confocal (Leica SP8, Wetzlar, Alemanha).

Ensaio de rotulagem de dUTP mediada por desoxinucleotidil transferase terminal (TUNEL)

Coramos cada 10ª seção coronal (total 14-15) através do SNc de bregma -2.92 nm a -3.64 mm.

Quatro seções típicas através do SNc no mesmo nível em cada grupo foram usadas para contagens de TH e TUNEL [10]. Os ensaios TUNEL foram realizados para analisar a apoptose em cortes de tecido com um kit de detecção de morte celular in situ (Roche, Rotkreuz, Suíça), seguindo as instruções do fabricante. Após a marcação do DNA, os cortes foram utilizados para coloração de imunofluorescência com anticorpo anti-TH e as imagens foram capturadas com microscópio confocal (Leica SP8, Wetzlar, Alemanha). Após o delineamento do SNc em baixa ampliação (10 9 objetivos) de acordo com o atlas cerebral de camundongo [20], as células TH positivas e as células TH/TUNEL duplamente positivas foram contadas em uma ampliação maior ({{7} } objetivos) por dois observadores cegos ao tratamento. A razão de células duplamente positivas TH/TUNEL para células TH positivas foi calculada.

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Análise estatística

Todos os dados são apresentados como média ± DP. ANOVA de uma via seguida de análise post hoc com HSD de Tukey e o teste de comparações múltiplas de Student–Newman–Keuls foram realizados para fins estatísticos. Um valor de P \ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

ECH diminui os produtos ROS e atenua

MPP1-Apoptose induzida

A ECH demonstrou proteger os neurônios da apoptose em modelos animais, bem como reduzir os níveis de citocinas pró-inflamatórias em células de neuroblastoma [12]. No entanto, ainda não está claro se a ECH modula diretamente a apoptose neuronal induzida pela MPP?. Nossos dados mostraram que a ECH não afetou a proliferação ou morte de células SH-SY5Y (Fig. 1B), e sua morfologia permaneceu inalterada (Fig. 1C). Curiosamente, após a exposição das células SH-SY5Y ao MPP?, a sobrevivência aumentou de maneira dose-dependente após o tratamento com ECH (10-40 lg/mL) (Fig. 1B, C).

Estudos anteriores mostraram que MPP? especificamente inibe a cadeia de transporte de elétrons na mitocôndria e também está associada à geração de ROS [6, 21]. Usando DCFH-DA como uma sonda fluorescente para avaliar as mudanças nos níveis de ROS, descobrimos que a ECH suprimiu marcadamente a geração de ROS induzida por MPP? (Fig. 2A). A microscopia confocal revelou que os produtos ROS diminuídos estavam associados aos níveis de ECH (Fig. 2C). ECH também foi mostrado para proteger a membrana celular contra ROS e diminuir os níveis de MDA, o produto final da peroxidação lipídica (Fig. 2B). Tomados em conjunto,

A ECH promove a sobrevivência celular diminuindo os produtos de ROS induzidos por MPP? em neurônios.

A ECH suprime a expressão gênica induzida por ROS/MPP1-induzida e aumenta o GDNF

Expressão em MPP1-Células tratadas

Os produtos ROS demonstraram estimular a resposta da proteína desdobrada e induzir a expressão de genes relacionados ao estresse, incluindo ATF3, ATF4 e CHOP [22]. ATF3 e CHOP desempenham um papel especialmente importante na apoptose neuronal induzida por estresse [9, 23]. A expressão anormal de a-sinucleína também é um dos marcadores críticos na patologia da DP [2]. Usando qRT-PCR, analisamos a expressão de ATF3, CHOP, SNCA e fator neurotrófico derivado de linha de células gliais (GDNF) no MPP? modelo de célula e descobriu que MPP? aumentou significativamente a expressão de ATF3, CHOP e SNCA em comparação com o grupo controle PBS. A ECH não afetou a expressão desses genes em células SH-SY5Y que não foram tratadas com MPP?. No entanto, ECH revogou sua expressão induzida por MPP? (Fig. 3). Além disso, MPP? suprimiu significativamente a expressão de GDNF em células SH-SY5Y, mas a ECH reverteu parcialmente esse fenômeno (Fig. 3B).

ECH inibe a ativação de MPP1-Caspase induzida-3 em células SH-SY5Y

Altos níveis de ATF3 e CHOP promovem diretamente a apoptose neuronal [9, 23]. Nossos dados mostraram que a ECH inibiu a expressão de ATF3 e CHOP de maneira dose-dependente (Fig. 4A). A ECH também bloqueou a caspase induzida por MPP?-3

atividade (Fig. 4A, B). A análise de imunofluorescência da forma clivada de caspase-3 mostrou ainda que ECH diminuiu acentuadamente a expressão da proteína caspase-3 clivada em células tratadas com MPP? (Fig. 4C).

ECH reverte MPP1-Acumulação induzida de ATF3 e CHOP em células SH-SY5Y

Após a exposição a toxinas ambientais, as proteínas ATF3 e CHOP se localizam no citoplasma e no núcleo [24, 25], e isso leva à apoptose. Nossos resultados sugeriram que MPP? o tratamento aumentou a expressão de ATF3 e CHOP no núcleo, e a ECH atenuou efetivamente esse processo (Fig. 5A, B). A análise de Western blotting mostrou que MPP? níveis marcadamente aumentados de ambas as proteínas no citoplasma e no núcleo. Curiosamente, a ECH revogou o MPP? efeitos e suprimiram o acúmulo de ATF3 e CHOP no núcleo (Fig. 5C-E).

ATF3 desempenha um papel crítico na MPP1-Apoptose induzida em células SH-SY5Y

Demonstrou-se que o ATF3 induz apoptose em células SH-SY5Y [23], e os resultados do presente estudo indicam que a ECH suprime significativamente o mRNA do ATF3 e a expressão da proteína induzida por MPP? nestas células. No entanto, o papel do ATF3 na apoptose e na proteção da sobrevivência celular por ECH permaneceu obscuro. Então, usamos RNA em gancho pequeno (shRNA) específico para ATF3 para investigar isso e não encontramos diferença na viabilidade entre o grupo ATF3-knockdown e o grupo controle em condições normais (Fig. 6A). No entanto, a supressão do ATF3 ou o tratamento com ECH resgatou significativamente as alterações morfológicas induzidas pelo MPP? (Fig. 6B). As células ATF3-knockdown tiveram maior viabilidade do que o grupo controle após a exposição ao MPP? (Fig. 6C). Os níveis de proteína de CHOP e caspase ativada-3 foram mais baixos em células ATF3-knockdown do que

em células de controle com shRNA não específico (Fig. 6C, D). Estes dados indicaram que o ATF3 desempenha um papel crítico na apoptose induzida por MPP? de células de neuroblastoma. Assim, estes resultados suportam a hipótese de que a ECH protege as células SH-SY5Y contra os efeitos induzidos por MPP? através da regulação negativa da via ROS/ATF3/CHOP. Curiosamente, nossos dados mostraram que a ECH também inibiu o aumento induzido por MPP? dos níveis de p53 e PUMA (p{10}}modulador de apoptose regulado positivamente) em células SH-SY5Y (Fig. 7).

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ECH protege os neurônios DA contra a apoptose

Induzida por MPP1 in Vitro ou por MPTP in Vivo

Para confirmar a ação da ECH na DP, os neurônios primários da DA foram tratados com MPP? ou MPP? e ECH. Os experimentos in vitro revelaram que MPP? reduziu significativamente a viabilidade dos neurônios DA e isso foi prevenido por ECH

(Fig. 8). Nós avaliamos ainda a apoptose em neurônios DA no SNc após diferentes tratamentos em camundongos com DP induzida por MPTP e controles. Mais neurônios TH-positivos foram encontrados nesta área no controle do que no grupo MPTP (Fig. 9A). Ensaios TUNEL mostraram que NS e ECH não induziram apoptose em neurônios DA no SNc, mas MPTP sim e ECH protegeu os neurônios contra ele (Figs. 9B, S2). Curiosamente, Western blotting de lisados ​​do SNc do modelo de camundongo de PD mostrou que os níveis de proteína ATF3 e CHOP também foram diminuídos por ECH (Fig. 10).

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