Parte 2|Acteoside suprime a osteoclastogênese mediada por RANKL ao inibir a indução de C-Fos e a via de NF-kB e atenuar a produção de ROS
Mar 06, 2022
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Parte 2|Como os Acteosídeos promovem o crescimento ósseo?
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Discussão
A remodelação óssea é fortemente regulada pelo equilíbrio entre a formação óssea pelos osteoblastos e a reabsorção óssea pelos osteoclastos. A reabsorção óssea prolongada e excessiva causa um desequilíbrio no turnover esquelético, resultando em doenças de reabsorção óssea. Para explorar os efeitosacteósidona osteoclastogênese, usamos dois macrófagos, BMMs de cultura primária e células RAW264.7. Estas células foram estimuladas com RANKL para se diferenciar em osteoclastos na presença e ausência deacteósido. Mostramos pela primeira vez queacteósidoinibe a diferenciação e formação de osteoclastos.Acteosídeonas concentrações examinadas não causou uma diminuição na viabilidade dos macrófagos cultivados primários em ambas as condições de crescimento e diferenciação.Acteosídeoo tratamento também diminuiu a atividade de reabsorção de osteoclastos maduros. Estes resultados sugerem que o acteosídeo suprime a formação osteoclástica de macrófagos e a atividade de reabsorção de osteoclastos. Os resultados do nosso sistema de cultura, que não incluiu osteoblastos ou células estromais, também sugerem que o acteosídeo previne a formação de osteoclastos agindo diretamente nos precursores de osteoclastos. RANKL ativa MAPKs incluindo p38, ERK e JNK. Essas três quinases estão envolvidas na diferenciação osteoclástica precoce e, portanto, sua inibição farmacológica ou com uma transfecção de JNK dominante-negativa suprime a osteoclastogênese induzida por RANKL [29]. Nossos resultados revelaram queacteósidoo pré-tratamento inibiu todas essas quinases, indicando uma regulação negativa não específica das MAPKs. Este resultado diferiu em parte do relatório anterior de que o EGCG, o principal composto anti-inflamatório no chá verde, atenuou especificamente a ativação de JNK sem afetar ou a ativação de p38 em BMMs estimulados por RANKL [7]. Paeonol, um composto anti-inflamatório derivado de uma erva chinesa, também foi relatado para inibir ERK e p38, mas não lixo, fosforilação em células RAW264.7 estimuladas por RANKL [30]. Em contraste, a silibinina, um novo inibidor no osso, atenuou a ativação induzida por ranks de p38, ERK e JNK [31]. Esses achados sugerem que os efeitos dos compostos anti-reabsortivos na ativação da MAPK por RANKL dependem do composto, embora todas as três MAPKs estejam envolvidas na osteoclastogênese precoce. Considerando a observação de que o acteosídeo atenuou os níveis de p-JNK em BMMs estimulados por RANKL, mesmo a 1 mm, o bloqueio de JNK em vez de p38 MAPK ou ERK pareceu ser um evento mais específico noacteósidoanti-osteoclastogênese mediada nas células. Embora o acteosídeo na mesma concentração não tenha reduzido o número de osteoclastos em BMMs, houve uma diminuição significativa na formação de depressões pelo tratamento com acteosídeo. Também descobrimos que o pré-tratamento com SP600125, um inibidor farmacológico específico para JNK, preveniu drasticamente a formação de osteoclastos (dados não mostrados). Coletivamente, esses achados sugerem que a sinalização mediada por JNK está intimamente relacionada à supressão da osteoclastogênese mediada por acteosídeos estimulada por RANKL. A sinalização de NF-kB regula eventos celulares, incluindo apoptose, progressão do ciclo celular, adesão celular, produção de citocinas e sobrevivência em macrófagos [32]. A sinalização de NF-kB também é necessária para o desenvolvimento de osteoclastos, o que foi demonstrado pelo aparecimento de osteopetrose em camundongos nocauteados por NF-kB [33,34]. Portanto, a inibição de NF-kB é proposta como um alvo eficaz para agentes anti-reabsortivos para regular negativamente a atividade dos osteoclastos e tratar a osteoporose. A modificação pós-traducional de proteínas da subfamília NF-kB é crucial na modulação da atividade de NF-kB. Especialmente, a fosforilação da subunidade p65 e da IkB quinase é crítica para o NF-kB induzir a osteoclastogênese [7]. Nossos achados atuais mostraram que a estimulação de RANKL aumentou a atividade de ligação ao DNA de NF-kB e fosforilação da subunidade p65 e Ikea tanto em BMMs quanto em células RAW264.7. O pré-tratamento com acteosídeo inibiu esses aumentos induzidos por RANKL, resultando em atividade de NF-kB regulada negativamente. Consequentemente, esses resultados sugerem que, além das MAPKs, a sinalização de NF-kB é o principal alvo do acteosídeo na inibição da diferenciação e formação de osteoclastos a partir de macrófagos estimulados por RANKL. Além da sinalização de NF-kB, a via c-Fos/c-Jun/NFATc1 desempenha papéis-chave no desenvolvimento de osteoclastos, portanto, a falta de qualquer uma dessas proteínas pode interromper a osteoclastogênese [35,36]. Neste estudo, descobrimos que o acteosídeo impediu a expressão de c-Fos e NFATc1 induzida por RANKL nos níveis de mRNA e proteína. JNK é uma quinase a montante de c-Jun, que é necessária para a expressão de NFATc1 e osteoclastogênese em resposta a RANKL [29] . O bloqueio da via JNK/c-Jun com um inibidor de JNK diminuiu a formação de osteoclastos induzida por RANKL e a expressão de c-Fos e NFATc1 [7]. Nossos resultados e achados anteriores sugerem que a inibição da sinalização mediada por JNK por acteosídeo está intimamente associada à prevenção de c-Fos e NFATc1 mediados por RANKL
expressão, que suprime a diferenciação de osteoclastos em macrófagos. Diferenças nos efeitos deacteósidoem BMMs e células RAW264.7 são, pelo menos em parte, devido a diferenças na sensibilidade à inibição de JNK. O TNF-a pode induzir osteoclastogênese independente da sinalização RANKL-RANK [37]. IL-1 é um potente mediador da destruição patológica do osso induzida por deficiência de estrogênio ou inflamação[7]. A interrupção do receptor de IL-1 tipo I ou sinalização de IL-1 pode reverter a perda óssea induzida por ovariectomia [38] ou artrite reumatóide [39]. Este estudo demonstrou a capacidade deacteósidopara reduzir a produção de citocinas inflamatórias como TNF-a, IL-1b e IL-6 em macrófagos. Acredita-se que o acteosídeo inibe a produção de citocinas inflamatórias suprimindo a sinalização de p38 quinase e ERK porque a ativação de ERK1/2, p38 MAPK ou ambas é necessária para a produção induzida por lipopolissacarídeos dessas citocinas em macrófagos [40,41]. A luteolina, um composto inflamatório, também foi relatada para suprimir a produção de mediadores inflamatórios inibindo a ativação de p38 MAPK [42]. na diáfise média do fêmur direito e o desaparecimento do osso cortical osteoporótico. A administração oral de acteosídeos regulou negativamente os aumentos induzidos pela ovariectomização nos níveis séricos de IL-1b e IL-6, mas não ALP. Os níveis séricos aumentados de cálcio, TRAP e OC na OVX também foram inibidos pelo tratamento oral com acteosídeo, sugerindo que o acteosídeo atenua a alteração de biomarcadores específicos para a formação óssea, bem como a reabsorção. Como a osteoporose é caracterizada por uma densidade de massa reduzida e microarquitetura óssea trabecular deteriorada, a perda óssea trabecular induzida pela OVX e a alteração dos parâmetros morfométricos foram significativamente inibidas pela administração oral de acteosídeos. Esses achados sugerem queacteósidopode ser usado como um agente anti-reabsorção para tratar a osteoporose revertendo a ativação desequilibrada dos osteoclastos. No entanto, os osteoblastos são o principal fator responsável pela nova formação óssea. Assim, um agente capaz de aumentar a proliferação ou diferenciação de osteoblastos é necessário para aumentar a formação óssea [30]. Em contraste, descobrimos que o acteosídeo não afetou a diferenciação ou mineralização dos osteoblastos em células de medula óssea tratadas com DAG. Em conjunto, nossos resultados sugerem que o acteosídeo tem um efeito anti-reabsorção, mas não afeta diretamente a formação óssea. Experimentos mais detalhados analisando parâmetros específicos do osso in vivo e in vitro são necessários para esclarecer se o acteosídeo beneficia ou não a osteoblastogênese. , c-Fos e NFATc1. Os dados sugerem dois possíveis mecanismos pelos quais o acteosídeo tem esses benefícios. Uma possibilidade é queacteosídeo.
inibe a osteoclastogênese devido ao seu potencial antioxidante. Numerosos estudos demonstraram que a produção de ROS mediada por receptor pode servir como um mediador de sinalização a jusante [43-45]. Algumas quinases e fatores de transcrição são sensíveis ao estado redox celular, que afeta vários eventos celulares. O RANKL estimula a produção de ROS, que medeia as respostas celulares induzidas pelo RANKL para a diferenciação de osteoclastos [24]. O pré-tratamento com antioxidantes, como N-acetilcisteína e glutationa, preveniu a geração de ROS mediada por RANKL, indicando que os antioxidantes reduzem a perda óssea ao diminuir a reprodução induzida por RANKL [24]. Em consonância com esses achados, o presente estudo revela queacteósidoatenua ROS intracelulares produzidos em BMMs durante a diferenciação de osteoclastos de maneira dose-dependente. Esta observação sugere que a inibição da osteoclastogênese é pelo menos em parte devido ao potencial antioxidante do ateósido. Também sugerimos que o acteosídeo pode regular negativamente o influxo de Ca2 mais, suprimindo assim a osteoclastogênese. Recentemente foi relatado que o acteosídeo inibe as alergias do tipo I por regulação negativa/NFAT e sinalização JNK em células basofílicas [46]. O receptor sensor de cálcio está intimamente relacionado com a regulação da osteoclastogênese [47]. Essa relação sugere que um canal de cálcio está envolvido naacteósido-inibição induzida da diferenciação e formação de osteoclastos. No entanto, mais estudos são necessários para explorar os mecanismos exatos pelos quais o acteosídeo atua como um agente anti-reabsortivo através da modulação do Ca2 mais a homeostase.
Em conclusão, nossos achados mostram que o acteosídeo inibe a diferenciação osteoclástica induzida por RANKL de BMMs e macrófagos RAW264.7 e suprime a reabsorção óssea por osteoclastos maduros.Acteosídeotambém previne a ativação induzida por RANKL de três MAPKs e fatores de transcrição bem conhecidos, como NF-kB, c-Fos e NFATc1, bem como a produção de citocinas inflamatórias, como TNF-a, IL-1b, e IL-6. Além disso, a administração oral de acteosídeo atenua a osteoporose induzida pela ovariectomia, embora não afete a osteoblastogênese das células da medula óssea. Coletivamente, esses achados sugerem que o lado CTE tem papéis benéficos na redução da formação e atividade de osteoclastos como um potente agente antirreabsortivo.
Informações de Apoio
Figura S1 Estrutura química do acteósido.
(TIF) Figura S2Acteosídeoprevine a formação de depressões induzidas por RANKL em BMMs. A BMMs foram pré-tratados com as doses indicadas deacteósidopor 2 h em placas de 24-poços revestidas de osso e estimuladas com 50 ng/ml de M-CSF e 100 ng/ml de RANKL por 7 dias. A formação de pites foi observada em microscopia óptica. B, BMMs foram cultivados com M-CSF e RANKL na presença de váriosacteósidoconcentrações ({{0}}–20 mM), e 7 dias depois, a área reabsorvida foi quantificada a partir de 3 experimentos independentes e expressa como uma porcentagem de controle (n=4 por experimentar). *p,0,05, **p,0,01 e ***p,0,001 vs. células cultivadas com M-CSF e classificação.
Figura S3 Acteosídeo atenua a produção de citocinas inflamatórias em células RAW264.7 estimuladas por RANKL.
As células foram pré-tratadas com as concentrações crescentes (0-10 mM) deacteósidopor 2 h seguido de estimulação com 100 ng/ml RANKL por 48 h. Os níveis de TNF-a, IL-1b e IL-6 foram determinados usando kits ELISA. ***p,0.001 vs. células sem RANKL e acteosídeo. #p,0.05 e ##p,0.01 vs. células estimuladas apenas com RANKL.
Contribuições do autor
Concebeu e desenhou os experimentos: S-YL J-CL. Realizados os experimentos: S-YL K-SL S-HK SHY. Analisados os dados: K-SL S-YL J-CL. Reagentes/materiais/ferramentas de análise contribuídos: S-YL SHY J-CL. Escreveu o artigo: S-YL SHY J-CL.
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