Parte 1:Echinacoside protege contra apoptose neuronal induzida por MPP+através da regulação da via ROS/ATF3/CHOP

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

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as espécies (ROS) também contribuem para o seu desenvolvimento [3]. Características semelhantes à DP podem ser induzidas por várias toxinas ambientais, incluindo 1-metil-4-fenil- 1,2,3,6-tetrahidropyridina (MPTP), cianeto, dissulfeto de carbono e tolueno. MPTP é amplamente utilizado para induzir modelos animais de DP, e seu metabólito ativo, 1-metil-4-íon fenilrítrio (MPP?), é usado em modelos celulares de DP [4, 5]. MPP? inibe seletivamente a cadeia de transporte de elétrons e resulta em produção excessiva de ROS, induzindo assim a morte neuronal e uma síndrome semelhante à DP [6]. Estudos recentes mostraram que o MPP? induz múltiplas vias em um modelo PD in vitro, incluindo o aumento da fosforilação GSK3B (pY206) e acúmulo de a-sinucleína [5], aumento da regulação do eixo heme oxygenase-1/ni-nicotinamida dinucleotídeo phosphate oxidase/ROS [7, 8], aumento da expressão do fator de transcrição ativa 3 (ATF3) e prisão de crescimento via DNA indutível 153 (GADD153)/C/EBP-proteção homologous (CHOP) [9]. No tratamento clínico, a supressão de produtos ROS é uma das estratégias mais importantes para a sobrevivência dos neurônios e o tratamento da DP [1].

Echinacoside(ECH, Fig. 1A), naturalfeniletanoideencontrado em muitas plantas medicinais, é um dos principais constituintes dofeniletanoideGlicosídeosisolado da erva tradicional chinesa,Cistanchesalsa [10]. Curiosamente, estudos recentes mostraram queECHtem efeitos protetores em um modelo de mouse de PD induzido por MPTP [10, 11].ECHtambém atenua a apoptose celular neuroblastoma induzida pela necrose tumoral fator-a ou 6-hidroxidopamina in vitro [12, 13]. No entanto, os mecanismos pelos quaisECHpromove a sobrevivência de neurônios no modelo de célula PD induzido pelo MPP.

Nós mostramos queECHreduziu significativamente os produtos ROS induzidos pelo MPP? em células SH-SY5Y.ECHtambém inibiu a expressão induzida por MPP de polímerase ATF3, CHOP e a-sinucleína, bem como suprimindo a ativação das proteínas pró-apoptose caspase-3 e poli (ADP-ribose) polimerase (PARP).

CistancheechinacosideTemneuroprotetorEfeitos

Materiais e Métodos

Reagentes

O meio essencial mínimo (DMEM) de Dulbecco, soro bovino fetal, 0,25% trippsina, penicilina/estreptomicina de 1% e reagente TRIzol eram da Life Technologies (Grand Island, NY). O corante de cromatina bisbenzimida (Hoechst 33342), poli-L-lysine, MPP? iodeto e MPTP eram de Sigma (St. Louis, MO). O kit de ensaio de malondialdeído lipídida (MDA) e o diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA) eram da Beyotime Biotech (Haimen, China). ECH de C98% de pureza foi da Push Biotechnology (Chengdu, China).

Animais e Tratamentos

A manutenção e os tratamentos de animais foram descritos anteriormente [14]. Usamos camundongos C57BL/6 machos (Shanghai Laboratory Animal Co., Xangai, China) pesando 24-26 g com 10 semanas de idade. Os animais foram mantidos em condições padrão (12:12 h de luz: ciclo escuro, 21 ± 2C e umidade relativa 40%) e permitiram acesso a alimentos e água ad libitum. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Hospital Zhongshan, Universidade de Fudan, e realizados de acordo com o Guia Nacional de Institutos de Saúde para o Cuidado e Uso de

Animais de laboratório.

Os camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (10 ratos/grupo): grupo A, grupo de controle de veículos, dado um volume igual (500 lL) de soro fisiológico normal (NS); grupo B, grupo controle ECH, dado 20 mg/kg ECH; grupo C, grupo modelo MPTP, pré-tratado com volume igual de NS; e grupo D, grupo tratado com ECH, pré-tratado com 20 mg/kgECH.ECHfoi dissolvido em NS e entregue pela administração intra-gástrica a cada 24 h por 15 dias consecutivos. O modelo de PD do mouse para os grupos C e D foi gerado por cinco injeções intraperitoneais consecutivas de 30 mg/kg MPTP a cada 24 h do dia 11 ao dia 15. Os camundongos foram mortos por luxação cervical ou perfusão sendo narcotizados por 10% de cloralhidrato (3,6 mg/kg) intraperitoneal 24h após o tratamento final.

A perfusão e o processamento de tecidos foram descritos pré-viously [14]. Após a perfusão intracardiac, amostras cerebrais foram coletadas e fixadas em 4% de paraformaldeído por 24 h a 4C, embutidas em parafina, e seções coronais que abrangem toda a SNc (coordenadas estereotipadas anteroposterior -3,64 a -2,92 mm em relação à bregma) foram cortadas a 5 lm.

Outros 5 animais de cada grupo foram mortos por deslocamento cervical e o cérebro médio ventral foi rapidamente lisedo em 1% de tampão de lise SDS no gelo. Os níveis de proteína CHOP e ATF3 no lysate foram analisados por manchas ocidentais.

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Cultura do Cérebro Médio Ventral de Ratos (VM)

Neurônios dopaminérgicos

Ratos Wistar grávidas foram comprados do Laboratório de Xangai Animal Co., (Xangai, China). Os neurônios da DA no VM foram isolados no dia 14. O VM foi dissecado e processado para estabelecer culturas primárias de neurônios VM DA como descrito anteriormente [15, 16]. Em suma, pedaços de tecido foram coletados na solução de sal balanceada da Hanks (HBSS) e centrifugar a 1000 rpm a 4C por 5 min. A pelota de tecido foi incubada em 750 lL de 0,1% de trippsina-HBSS por 15 min a 37C com 5% de CO2. O soro da panturrilha fetal (FCS; 750 lL) foi usado para inativar trippsina e tecidos foram dissociados por trituração suave

usando uma pipeta Pasteur esterilizada. As suspensões celulares foram centrifugadas a 1000 rpm por 4 min a 4C e re-suspensas em meio de diferenciação (dulbecco modificado Eagle's medium/F12, 33 mmol/L D-glicose, 1% L-glutamina e 1% FCS, suplementado com 2% de B27). As células foram semeadas em placas de cultura tecidual revestidas de poli-D(Sigma) com 24 poços em 5 9 104 células/poço em 500 lL meio de diferenciação a 37C com 5% de CO2 por 10 dias para se desenvolver em

neurônios da da maduros. Os neurônios VM DA foram caracterizados pela imunofluorescência com anticorpo anti-b-tubulin isótipo III e anticorpo de hidroxilase de tyrosina (TH). S1). As células foram tratadas com 1 mmol/L MPP?, 40 LG/ mL ECH, uma combinação de MPP? e ECH, ou PBS sozinho como um controle. A viabilidade celular foi analisada com reagente CCK-8 após 96 horas de tratamento.

e são apresentados como média ± SD (n = 6; **P \0,01 vs controle, #P \ 0,05, ##P \0,01 vs MPP? C Imagens microscópicas de alterações morfológicas induzidas pelo MPP? ou MPP? e ECH. a, controle PBS; b, 40 lg/mL ECH; c, 1 mmol/L MPP?; d, 1 mmol/L MPP? e 10 lg/mL ECH; e, 1 mmol/L MPP? e 20 lg/mL ECH; f, 1 mmol/L MPP? e 40 lg/mL ECH (barra de escala, 200 lm).

Cistanche echinacoside tem o efeito de inibir a apoptose

Cultura celular SH-Sy5Y

As células SH-SY5Y eram do Cell Bank of Shanghai Institute of Cell Biology (Academia Chinesa de Ciências, Xangai, China) e cultivadas em DMEM suplementadas com 10% de soro bovino fetal, 100 penicilina U/mL e 100 estreptomicinas U/mL. As células foram mantidas em uma incubadora 37C umidificada fornecida com 5% de CO2. MPP? foi desfecionado em água estéril e usado imediatamente. ECH foi dissolvido na PBS. Para explorar a expressão genética relacionada ao ROS e os níveis de proteína, as células foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas por 24 h. As células foram então alimentadas com meio fresco contendo MPP?, ECH, uma combinação de MPP? e ECH, ou PBS sozinho como um controle. Após 24h de tratamento, as células foram diluidas com 1% de tampão de lise SDS (1% SDS,25 mmol/L EDTA, 45 mmol/L Tris-HCl, pH 6.5) para análise de manchas ocidentais, e o RNA total foi isolado diretamente com reagente TRIzol.

Para analisar a distribuição ATF3 e CHOP após o tratamento, foram utilizados kits de reagente de extração nuclear e citoplasmica (Thermo Fisher, Waltham, MA) para extrair frações citoplasmáticas e nucleares de células tratadas com drogas e controle.

Ensaio de viabilidade celular

As células SH-SY5Y foram semeadas em placas de 96 poços e incubadas durante a noite. As células foram alimentadas a cada 24 horas com um meio completo fresco contendo diferentes drogas e mantidas por 3 dias. Em seguida, a viabilidade foi avaliada usando o kit de contador celular CCK8 (Dojindo, Japão). Os dados foram normalizados para resultados do controle da PBS e são apresentados como média ± SD. Para analisar a viabilidade nas células SH-SY5Y (ATF3 shRNA) e controle (GFP shRNA) de ATF3, as células foram adicionadas a placas de 96 poços e cultivadas por 14-16 h. Os plasmídeos de shRNA ATF3 ou GFP foram transfectados em células SH-SY5Y usando Lipofectamina 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). As células foram tratadas com 1 mmol/L MPP? ou um volume igual de PBS após 24h de transfecção e, em seguida, incubados por 3 dias. Os números de células eram contados todos os dias. Os dados são apresentados como média ± SD.

shRNA Construções e Primers Oligo

pGV298-ATF3 shRNA (ATF3shRNA) e as construções de controle GFP shRNA eram da GeneChem Co. (Xangai, China). A sequência de alvos ATF3 foi 50-GCAAAGT G! CCGAAACAAGA-30 de métodos previamente descritos [17, 18]. Para detectar a expressão genética induzida pelo MPP?, os genes relacionados ao estresse ros e associados ao PD foram selecionados para qRT-PCR, e gapDH foi usado como controle. Todos os primers foram sintetizados pela Sangon Biotech Co. (Xangai, China), e as sequências de primer estão listadas na Tabela 1.

PCR em tempo real

O RNA total foi extraído com reagente TRIzol de acordo com as instruções do fabricante. A transcrição reversa e o PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR) foram realizados como descrito anteriormente. A reação de transcrição reversa foi realizada usando o kit de síntese do ReversAid First Strand (Thermo Scientific, Waltham, MA) de acordo com as instruções do fabricante. O kit SYB Premix Ex Taq II (TaKaRa, Dalian, China) foi usado para qRT-PCR: sistemas de reação de 20 lL foram usados com ABI (Life Technologies, Carlsbad, CA). Os parâmetros pcr compreendeu as seguintes etapas: 95C para 3 min, 1 ciclo; 95C para 5 s e 60C para 40 s, 40 ciclos. Os dados finais foram nem...

moralizados para GAPDH e são apresentados como uma razão para o controle. Os primers usados para amplificação estão listados na Tabela 1.

Mancha Ocidental

A análise da mancha ocidental foi realizada como descrito anteriormente [19]. Os anticorpos primários foram caspase 3 e p53 (Tecnologia de Sinalização Celular, Danvers, MA), anti-GAPDH (Proteintech Group, Chicago, IL), anti-GADD153/CHOP (Wanlei Bio, Shenyang, China), e anti-ATF3, anti-PARP, anti-PUMA e anti-histone 3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Anticorpos secundários com peroxidase de rabanete eram de Laboratórios de Pesquisa Imune Jack-son (Western Grove, PA). As membranas PVDF eram da EMD Millipore (Billerica, MA) e o substrato da ECL era da CWBio (Suzhou, China). Níveis relativos de proteína com base nos níveis cinzentos da imagem foram analisados com o software Tanon GIS (Tanon Biotech, Xangai, China), e os dados são apresentados como a razão da proteína alvo para GAPDH.

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