Parte 1 A doxorrubicina melhora paradoxalmente a inflamação induzida por tumor em camundongos jovens

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Ibrahim Y. Abdelgawad et al

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Abstrato:

Doxorrubicina(DOX) é um dos quimioterápicos mais utilizados em oncologia pediátrica. A DOX provoca uma resposta inflamatória em múltiplos órgãos, o que contribui para os efeitos adversos induzidos pela DOX. O próprio câncer causa inflamação levando a várias condições patológicas. O presente estudo investigou a resposta inflamatória à DOX etumoresusando um modelo de linfoma EL4-, imunocompetente, juvenil. Camundongos C57BL/6N machos de quatro semanas de idade foram injetados subcutaneamente com células de linfoma EL4 (5 × 104 células/camundongo) na região do flanco, enquantotumorcamundongos livres foram injetados com veículo. Três dias após a implantação do tumor, ambos os camundongos sem tumor e portadores de tumor foram injetados intraperitonealmente com DOX (4 mg/kg/semana) ou solução salina por 3 semanas. Uma semana após a última injeção de DOX, os camundongos foram sacrificados e os corações, fígados,rins, e o soro foram colhidos. A expressão gênica e a concentração sérica de marcadores inflamatórios foram quantificados usando PCR em tempo real e ELISA, respectivamente. O tratamento com DOX suprimiu significativamentetumorcrescimento em camundongos portadores de tumor e causou atrofia cardíaca significativa em camundongos livres e portadores de tumor. Os tumores EL4 provocaram uma forte resposta inflamatória no coração, fígado erim. Surpreendentemente, o tratamento com DOX melhorou a inflamação induzida por tumor paradoxal ao efeito de DOX em camundongos sem tumor, demonstrando um efeito amplamente divergente do tratamento com DOX em camundongos sem tumor versus camundongos com tumor.

Palavras-chave:doxorrubicina; tumor; inflamação

1. Introdução

A doxorrubicina (DOX), também conhecida como adriamicina, é um dos agentes quimioterápicos mais utilizados em oncologia clínica pediátrica. Apesar de sua eficácia em uma ampla gama de cânceres, incluindo linfoma, leucemia e outros cânceres pediátricos, a utilidade clínica do DOX é limitada devido à toxicidade de múltiplos órgãos. Além de sua marcada cardiotoxicidade [1], a DOX demonstrou causar nefrotoxicidade [2-5] e hepatotoxicidade [6]. Quase 50% dos pacientes pediátricos com câncer recebem DOX como parte de seu protocolo de tratamento [7]. Devido a tratamentos eficazes contra o câncer, incluindo DOX, a taxa de sobrevivência de 5-anos de crianças diagnosticadas com câncer aumentou de menos de 60% na década de 1970 para mais de 80% agora [8,9]. Isso leva a uma grande população de sobreviventes de câncer infantil (CCSs), estimada em cerca de 400,000. Infelizmente, os CCSs estão em alto risco de desenvolver efeitos adversos a longo prazo devido ao tratamento do câncer e/ou ao próprio câncer.

Demonstrou-se que a DOX desencadeia inflamação sistêmica [10-12] e resposta inflamatória em vários órgãos, incluindo o coração [13],rim[14] e fígado [15]. Essa resposta inflamatória demonstrou promover efeitos adversos induzidos pela DOX [16,17]. A maioria desses estudos relatando inflamação induzida por DOX foi realizada emtumormodelos animais livres que não imitam o cenário clínico em que pacientes pediátricos com câncer recebem tratamento com DOX após o diagnóstico de câncer. O câncer em si também demonstrou causar inflamação, contribuindo para várias condições patológicas que podem exacerbar as toxicidades induzidas pela DOX [18,19]. Portanto, há uma necessidade crítica de estabelecer modelos animais clinicamente relevantes para investigar os mecanismos de toxicidade de múltiplos órgãos induzida por DOX em jovens,tumorcamundongos portadores para estudar a interação entre o tratamento com DOX e o próprio câncer para causar tais toxicidades.

No presente estudo, investigamos a resposta inflamatória à DOX e ao tumor em um modelo de camundongo juvenil singênico EL4- clinicamente relevante, imunocompetente. Este modelo está bem estabelecido na pesquisa do câncer [20] e é clinicamente relevante para pacientes com câncer pediátrico, uma vez que o linfoma é um dos tipos mais comuns de câncer pediátrico [21]. O uso de camundongos singênicos é fundamental para estudar a resposta inflamatória tanto à DOX quanto ao tumor devido ao papel crítico do sistema imunológico na patogênese da inflamação [22]. A idade dos camundongos era de 5 semanas após a administração de DOX, o que equivale à idade da adolescência de 10 a 12 anos em humanos [23]. Além disso, as doses de DOX administradas são clinicamente relevantes para as doses recebidas por pacientes pediátricos com câncer [24]. Primeiro determinamos os efeitos da DOX na função cardíaca em camundongos livres de tumor e portadores de tumor, uma vez que a cardiotoxicidade induzida pela DOX é considerada o efeito adverso clinicamente mais relevante da DOX, entre outras toxicidades de múltiplos órgãos. A partir daí, determinamos o efeito da DOX, o tumor e sua combinação em vários marcadores inflamatórios no coração, fígado erimalém de marcadores séricos de inflamação sistêmica. Descobrimos que a presença do tumor EL4 provocou uma forte resposta inflamatória em múltiplos órgãos. Surpreendentemente, o tratamento com DOX melhorou a inflamação induzida por tumor, paradoxalmente ao efeito relatado anteriormente de DOX em camundongos livres de tumor.

2. Resultados

2.1. Efeitos da DOX no peso corporal e no crescimento do tumor

O estudo atual foi estabelecido em camundongos juvenis para imitar o cenário clínico em pacientes pediátricos com câncer, conforme descrito na Figura 1A. Nenhuma morbidade ou mortalidade significativa foi observada em camundongos livres de tumor ou portadores de tumor após exposição à DOX (4 mg/kg/semana por 3 semanas), o que está de acordo com nosso estudo anterior usando a mesma dose [25]. No entanto, a exposição juvenil à DOX resultou em um ganho de peso corporal significativamente reduzido em comparação com camundongos tratados com solução salina (Figura 1B). Para avaliar o efeito anticancerígeno da DOX neste modelo de linfoma EL4, medimos os pesos do tumor após a necropsia dos camundongos. A administração crônica de DOX em camundongos portadores de tumor inibiu significativamente o crescimento do tumor EL4, demonstrando o efeito anticancerígeno deste regime de dosagem de DOX (Figura 1C).

2.2. Efeito da administração de DOX na função cardíaca e morfometria em camundongos sem tumor e com tumor

DOX causou atrofia cardíaca como demonstrado por uma diminuição significativa no peso do coração para o comprimento da tíbia (HW/TL) (Figura 1D). Notavelmente, a atrofia cardíaca causada por DOX foi aumentada em camundongos portadores de tumor (Figura 1D). Os efeitos da DOX, tumor e a combinação de ambos na função e morfologia cardíacas foram avaliados por meio de ecocardiografia transtorácica. Imagens representativas do Modo M de cada grupo são exibidas na Figura 2A. Nem a DOX nem o tumor causaram alterações significativas na fração de ejeção (Figura 2B), débito cardíaco (Figura 2C), encurtamento fracional (Figura 2D), massa do ventrículo esquerdo (VE) (Figura 2E), espessura da parede posterior do VE na diástole (LVPW' d) (Figura 2F), ou espessura da parede posterior do VE na sístole (LVPW's) (Figura 2G).

2.3. Efeito da administração de DOX na expressão gênica de marcadores inflamatórios no coração de camundongos com e sem tumor

Corações foram colhidos de camundongos C57BL/6N juvenis portadores de tumor de linfoma EL4 e livre de tumor uma semana após a administração de 4 mg/kg/semana de DOX ou volume equivalente de solução salina estéril por 3 semanas (n=8 por grupo). Após a extração do RNA total, expressão de mRNA cardíaco de marcadores inflamatórios interleucina-1 alfa (IL-1 ), interleucina-1 beta (IL-1 ), interleucina{{12} } (IL-6), fator de necrose tumoral alfa (TNF-), quimiocinas inflamatórias proteína quimioatraente de monócitos-1 (Mcp-1) e quimiocinas de motivo CX C (Cxcl1, Cxcl9 e Cxcl10) foram determinados por PCR em tempo real. A expressão gênica de vários marcadores inflamatórios no coração foi significativamente aumentada em camundongos portadores de tumor em comparação com camundongos sem tumor, incluindo as citocinas pró-inflamatórias IL-1 (Figura 3A), IL-1 ( Figura 3B), IL-6 (Figura 3C) e TNF- (Figura 3D) e as quimiocinas inflamatórias Mcp-1 (Figura 3E), Cxcl1 (Figura 3F) e Cxcl10 (Figura 3H). Enquanto a administração de DOX em camundongos sem tumor não resultou em mudanças significativas na expressão de marcadores inflamatórios no coração, a administração de DOX revogou significativamente a regulação positiva de IL induzida por tumor-1 (Figura 3B), Mcp{{44} } (Figura 3E), Cxcl9 (Figura 3G) e Cxcl10 (Figura 3H). É importante ressaltar que a ANOVA de duas vias demonstrou um efeito de interação significativo em todos os marcadores, exceto Cxcl1, Cxcl9 e Cxcl10, demonstrando os efeitos divergentes que a DOX tem nos marcadores inflamatórios cardíacos em camundongos portadores de tumor em comparação com camundongos livres de tumor.

2.4. Efeito da administração de DOX na expressão gênica de marcadores inflamatórios no fígado de camundongos livres de tumor e portadores de tumor

Fígados foram colhidos de camundongos C57BL/6N juvenis portadores de tumor de linfoma EL4 e livre de tumor uma semana após a administração de 4 mg/kg/semana de DOX ou volume equivalente de solução salina estéril por 3 semanas (n=8 por grupo). Após a extração do RNA total, expressão de mRNA hepático dos marcadores inflamatórios IL-1 , IL-1 , IL-6, TNF- , Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 e Cxcl10 foram determinados por PCR em tempo real. Camundongos portadores de tumor tiveram expressão hepática significativamente elevada das citocinas pró-inflamatórias IL-1 (Figura 4A), IL-1 (Figura 4B), TNF- (Figura 4D), Cxcl9 (Figura 4G), e Cxcl10 (Figura 4H) em comparação com camundongos livres de tumor. Embora menos notável, a ANOVA de duas vias demonstra um efeito significativo do tumor na expressão do gene hepático de IL-6 (Figura 4C). ANOVA de duas vias demonstrou um efeito de interação significativo entre o tumor e DOX em Cxcl10 (Figura 4H). A administração de DOX reduziu a regulação positiva induzida por tumor de IL-1 e TNF- (Figura 4B, D). Nem a DOX nem o tumor tiveram um efeito significativo na expressão hepática das quimiocinas inflamatórias Mcp-1 e Cxcl1 (Figura 4E, F).

2.5. Efeito da administração de DOX na expressão gênica de marcadores inflamatórios no rim de camundongos livres de tumor e portadores de tumor

Os rins foram colhidos de camundongos C57BL/6N juvenis portadores de tumor de linfoma EL4 e livre de tumor uma semana após a administração de 4 mg/kg/semana de DOX ou volume equivalente de solução salina estéril por 3 semanas (n=8 por grupo). Após a extração do RNA total, expressão de mRNA renal dos marcadores inflamatórios IL-1 , IL-1 , IL-6, TNF- , Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 e Cxcl10 foram determinados por PCR em tempo real. Em consonância com as alterações observadas no coração e no fígado, camundongos portadores de tumor tiveram expressão renal significativamente aumentada das citocinas pró-inflamatórias IL-1 (Figura 5A), IL-1 (Figura 5B), TNF- (Figura 5D) e Mcp-1 (Figura 5E) em comparação com camundongos livres de tumor. Além disso, a ANOVA de duas vias demonstra um efeito significativo do tumor na expressão do gene renal de Cxcl1 (Figura 5F), Cxcl9 (Figura 5G) e Cxcl10 (Figura 5H). A administração de DOX em camundongos portadores de tumor melhorou significativamente a regulação positiva induzida por tumor de IL-1 (Figura 5B), IL-6 (Figura 5C), TNF- (Figura 5D) e Mcp{{43} } (Figura 5E). Dentro desses marcadores, a ANOVA de duas vias também demonstrou uma interação significativa entre a DOX e o tumor, demonstrando os diferentes efeitos que a DOX tem nos marcadores inflamatórios renais em camundongos portadores de tumor em comparação com camundongos livres de tumor.

2.6. Efeito da administração de DOX em características histopatológicas no coração, fígado e rim de camundongos livres de tumor e portadores de tumor

Corações, fígados e rins foram colhidos de uma coorte de camundongos C57BL/6N juvenis portadores de tumor de linfoma EL4 e livre de tumor uma semana após a administração de 4 mg/kg/semana de DOX ou volume equivalente de solução salina estéril por 3 semanas ( n=4 por grupo). A avaliação histopatológica não demonstrou alterações patológicas importantes no coração (Figura 6A). Apenas infiltração de células inflamatórias mínimas, demonstradas como focos raros de inflamação mista minimamente celular (mononuclear e neutrofílica), foi observada nos tecidos hepáticos colhidos de células tumorais tratadas com DOX (três de quatro camundongos), portadoras de tumor tratadas com solução salina ( dois de quatro camundongos) e camundongos portadores de tumor tratados com DOX (três de quatro camundongos) (Figura 6B). A avaliação histopatológica dos rins não demonstrou grandes alterações patológicas em todos os grupos, exceto camundongos portadores de tumor tratados com DOX (Figura 6C), com dois dos quatro camundongos neste grupo demonstrando regiões de regeneração tubular de espessura total, fibrose e intersticial leve inflamação que afeta aproximadamente 5 por cento da área total do tecido.

2.7. Efeitos divergentes da DOX nas citocinas inflamatórias séricas em camundongos sem tumor versus camundongos portadores de tumor

Relatamos anteriormente que a administração aguda de DOX provocou uma resposta inflamatória sistêmica em camundongos C57BL/6N adultos [11]. Aqui, determinamos o efeito da administração crônica de DOX nos níveis séricos dos marcadores inflamatórios IL-6 e TNF-, em camundongos juvenis livres de tumor e portadores de tumor. Camundongos portadores de tumor tratados com solução salina demonstraram um aumento acentuado, embora estatisticamente insignificante, no soro IL-6 (Figura 7A) e TNF- (Figura 7B) em comparação com camundongos sem tumor. É importante ressaltar que a ANOVA de duas vias demonstrou uma interação significativa entre a administração de DOX e o tumor nos níveis séricos de IL-6 e TNF-. De fato, a administração de DOX normalizou a regulação positiva de IL induzida por tumor-6 para um nível semelhante ao de camundongos sem tumor de controle (Figura 7A).