Xican Li 1,2,*,† ID, Yulu Xie 1,2,†, Ke Li 3,4, Aizhi Wu 1,2,*, Hong Xie 1,2, Qian Guo 1,5,

Penghui Xue 1, Yerkingul Maleshibek 1, Wei Zhao 6, Jiasong Guo 7 e Dongfeng Chen 3,4

Contato:joanna.jia@wecistanche.com

1 Escola de Fitoterapia Chinesa, Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou, Guangzhou 510006, China; xieyulu1900@163.com (YX); xiehongxh1@163.com (HX); 15622178307@163.com (QG); 15228738137@163.com (PX); pandiphd@163.com (YM)

2 Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento Inovador da MTC, Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou,

Guangzhou 510006, China

3 Escola de Ciências Médicas Básicas, Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou, Guangzhou 510006, China; ys1090992678@163.com (KL); chen888@gzucm.edu.cn (DC)

4 Centro de Pesquisa de Medicina Integrativa Básica, Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou,

Guangzhou 510006, China

5 Escola de Ciências Médicas Básicas, Universidade Farmacêutica de Guangdong, Guangzhou 510007, China

6 Escola de Medicina de Zhongshan, Universidade Sun Yat-sen, No. 74 Zhongshan Road. 2, Guangzhou 510080, China; zhaowei23@mail.sysu.edu.cn

7 Departamento de Histologia e Embriologia, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;

† Estes autores contribuíram igualmente para este trabalho.

Recebido: 24 de janeiro de 2018; Aceito: 20 de fevereiro de 2018; Publicado: 23 de fevereiro de 2018

Resumo: O estudo procurou explorar o papel dos açúcares-resíduos e os mecanismosfenilpropanóideantioxidantes. Acteosídeo, juntamente com seu apioside forsythoside B e ramnoside

poliumosídeo, foram investigados comparativamente usando vários ensaios antioxidantes. Em três ensaios baseados em transferência de elétrons (ET) (FRAP, CUPRAC, PTIO·-scavenging em pH 4,5), os níveis de antioxidantes relativos governaram aproximadamente comoacteósido >forsythoside B > poliumoside. Tal ordem também foi observada em

Ensaio de eliminação de PTIO· envolvido em transferência de H mais a pH 7,4, e em três ensaios de eliminação de radicais envolvidos em múltiplas vias, ou seja, eliminação de ABTS mais ·, eliminação de DPPH· e eliminação de ·O2.. Nos espectros UV-vis, cada um deles apresentou um desvio para o vermelho em 335 364 nm e dois picos fracos (480 e 719 nm), quando misturados com Fe2 plus ; Contudo,acteósidodeu a absorção mais fraca.

Na análise de cromatografia líquida de ultra-efetividade acoplada com espectrometria de massa em tandem de quadrupolo de ionização por eletrospray (UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS), nenhum pico de formação de aduto radical (RAF) foi encontrado. O ensaio MTT revelou que o poliumosídeo exibiu a maior viabilidade de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea com estresse oxidativo. Para concluir,acteósido, forsythoside B e poliumosside podem estar envolvidos em múltiplas vias para exercer a ação antioxidante, incluindo ET, H plus -transfer ou Fe2 plus -quelante, mas não RAF. A transferência de ET e H plus pode ser impedida por porções ramnosil e apiosil; no entanto, o potencial quelante de Fe2 plus pode ser aumentado por dois resíduos de açúcar (especialmente a fração ramnosil). O efeito geral das porções de ramnosil e apiosil é melhorar os efeitos antioxidantes ou citoprotetores.

Palavras-chave:acteósido; apiosil; forsitósido B;fenilpropanóideglicosídeos; poliumósido; ramnosil

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1. Introdução

Recentemente, o acteosídeo (verbascosídeo, Figura 1), umfenilpropanóideglicosídeoocorrendo em verbena e outras plantas [1], foi encontrado para melhorar a eficiência da transferência nuclear de células somáticas caninas (SCNT) durante o processo de clonagem de cães [2]. Além disso, o acteosídeo pode proteger as células SH-SY5Y do neuroblastoma humano contra danos induzidos por -amiloide [3] e fibroblastos da pele humana contra danos induzidos por raios-X [4]. Seu apioside forsythoside B (Figura 1) também é distribuído em plantas [5], e foi observado exercer potentes efeitos neuroprotetores com uma janela de tempo terapêutica favorável [6]. Acredita-se que esses efeitos benéficos sobre células e tecidos estejam associados à proteção de algumas biomoléculas, como lipídios e DNA. De fato, o acteosídeo e seu análogo cistanosídeo F demonstraram inibir a peroxidação lipídica mitocondrial em ratos [7]. Sabe-se que a peroxidação lipídica é resultado do estresse oxidativo celular e, em última análise, das espécies reativas de oxigênio (ROS).

Figura 1. As estruturas (esquerda) e os modelos de bola e vareta baseados em conformação preferencial (direita) de trêsfenilpropanóideglicosídeos(acteoside, forsythoside B e poliumoside).

Do ponto de vista da proteção do DNA, o acteosídeo e seus derivados podem reparar rapidamente radicais de DNA, como 2'-desoxiadenosina-5'-monofosfato (dAMP) e 2'-desoxiguanosina-5'-monofosfato (dGMP) [ 8]. Esses radicais desoxinucleotídeos secundários podem danificar ainda mais as células de forma oxidativa, levando à mutagênese e carcinogênese [9]. O estudo biofísico indicou que o acteosídeo e seus derivados podem se encaixar em sulcos menores do DNA e reparar rapidamente esses danos oxidativos no DNA [10]. O modelo ball-stick baseado em conformação preferencial propõe (Figura 1, à direita) que essas moléculas são prolatas e podem alcançar facilmente a alça do DNA e, assim, são capazes de reparar rapidamente os danos dos radicais de DNA [8].

No entanto, do ponto de vista da bioquímica, o reparo é realizado essencialmente por meio de uma via de eliminação de ROS (ou seja, antioxidante). Como mencionado anteriormente, a geração de cátions radicais desoxinucleotídeos é, em última análise, a partir do ataque de ROS, incluindo radicais livres (por exemplo, radical ·OH [11]) e moléculas oxidantes (por exemplo, H2O2 [12]). Acredita-se que a eliminação de ROS reduz de forma eficiente o estado oxidativo celular [13,14] e melhora a qualidade das células-tronco [12,15]. Portanto, é necessário estudar sua capacidade antioxidante e discutir mais possíveis mecanismos.

Neste estudo, três fenólicosfenilpropanóideglicosídeos(acteoside, forsythoside B e poliumoside) foram investigados comparativamente usando vários ensaios antioxidantes, incluindo o 2-fenil-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil{{6 }}ensaio de eliminação de radical óxido (PTIO·), ensaio de poder antioxidante redutor de íons férricos (FRAP), ensaio de capacidade antioxidante redutora cúprica (CUPRAC), 2,2→-azino-bis(3-etilbenzeno-tiazolina{{13) }}ensaio de eliminação de radical ácido sulfônico (ABTS mais ·),

Ensaio de 1,1-difenil-2-picril-hidrazina (DPPH·) e ensaio de eliminação de ·O2., bem como análise de espectros UV quelantes de Fe2 mais. Subsequentemente, seus produtos de reação com DPPH· foram determinados usando cromatografia líquida de ultra-eficácia acoplada com análise de espectrometria de massa em tandem de quadrupolo de ionização por eletrospray (UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS). Finalmente, seu efeito citoprotetor contra as células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (bmMSCs) foi estimado usando o

3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-ensaio de difenil (MTT). Como visto na Figura 1, a diferença entre os três fenólicosfenilpropanóideglicosídeos(ou seja, acteoside, forsythoside B e poliumosside) é o tipo de glicosídeo: forsythoside B é um apioside do acteoside, enquanto o poliumosside é um ramnosside do acteoside. Assim, este estudo comparativo também auxilia na compreensão dos papéis do apiosil e do ramnosil naantioxidanteefeitos.

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2. Resultados

2.1. Ensaios de Redução de Metais (FRAP & CUPRAC)

No estudo, realizamos dois ensaios de redução de metais, ou seja, ensaio FRAP e ensaio CUPRAC. Conforme ilustrado no Supl. 1, o acteosídeo e seus derivados aumentaram as porcentagens relativas de FRAP (ou Cu2 mais poder redutor) em 0–10 g/L de maneira dose-dependente. Sua ordem de níveis relativos de redução de metal diminuiu aproximadamente na ordem de acteosídeo > forsitósido B > poliumosídeo (Tabela 1).

Tabela 1. Os valores IC50 de acteoside, forsythoside B e poliumoside em váriosantioxidantesensaios.

2.2. PTIO·-Ensaio de eliminação

O ensaio de eliminação de PTIO· foi desenvolvido recentemente pelo nosso laboratório [16]. Pode ser usado para avaliar os níveis de antioxidantes e explorar as vias antioxidantes. Conforme mostrado no Supl. 1, o acteosídeo e seus derivados podem eliminar PTIO· com sucesso em pH 4,5 e pH 7,4. No entanto, de acordo com os valores de IC50 na Tabela 1, seus níveis relativos de eliminação de PTIO· no mesmo valor de pH eram diferentes um do outro. Além disso, cada acteosídeo e seus derivados exibiram diferentes níveis de eliminação de PTIO· entre pH 4,5 e pH 7,4. Em geral, os níveis de eliminação de PTIO· em 7,4 foram maiores do que aqueles em pH 4,5.

2.3. Ensaios ABTS plus ·-Scavenging e DPPH·-Scavenging

O ABTS plus ·-scavenging e DPPH·-scavenging são agora amplamente utilizados para estudos antioxidantes de compostos puros ou extratos. Como visto em Supl. 1, o acteosídeo e seus derivados aumentaram de forma dependente da concentração as porcentagens de eliminação de ABTS mais · ou de eliminação de DPPH·.

No entanto, em termos dos valores de IC50 na Tabela 1, seus níveis relativos de ABTS mais ·-scavenging foram encontrados na ordem de acteosídeo > forsitosídeo B > poliumósido > Trolox. Uma ordem semelhante também pode ser observada no ensaio de eliminação de DPPH.

2.4. UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS Análise de Produtos de Reação DPPH·

O produto da reação de DPPH· com cada um dos trêsfenilpropanóideglicosídeosfoi explorado usando a análise UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS. Na análise (Supl. 2), nenhum dos três glicosídeos fenilpropanóides produziu o pico do produto RAF. Em comparação, verificou-se que o ácido cafeico produz um produto dimérico (m/z 359–360, Supl. 2).

2.5. Análise UV-Vis-Spectra de Fe2 plus -Produtos Quelantes

Uma vez que o espectro UV-vis-espectro pode caracterizar complexos metálicos, o estudo utilizou espectros UV-vis-visto para analisar a possível reação quelante de Fe2 mais com trêsfenilpropanóide glicosídeos. Conforme mostrado na Figura 2, cada um deles pode produzir um deslocamento batocrômico (335 nm●364 nm) nos espectros de UV. Enquanto isso, cada um deles pode fornecer dois picos fracos no espectro visível (480 nm e 719 nm) e levar a uma aparência verde clara. No entanto, o pico de intensidade foi em ordem decrescente de poliumósido > forsitósido B > acteósido.

2.6. Ensaio de Autooxidação de Pirogalol para Anião Superóxido (·O2.) Eliminação

O ensaio de autooxidação de pirogalol foi aprimorado pelo nosso laboratório em 2012 [17]. Ele foi usado para estimar o potencial de eliminação de ·O2. no presente estudo. Como visto em Supl. 1, todos os acteósidos e seus derivados podem aumentar de forma dose-dependente as percentagens de eliminação de ·O2.. No entanto, a bioatividade relativa diminuiu na ordem de poliumósido > forsythoside B > acteoside, de acordo com os valores de IC50 na Tabela 1.

2.7. Efeito citoprotetor para bmMSCs sob estresse oxidativo (ensaio MTT)

Para avaliar os efeitos citoprotetores do acteosídeo e seus derivados, realizamos um ensaio de MTT. No ensaio, as bmMSCs foram danificadas pelo reagente oxidativo H2O2, as bmMSCs danificadas foram então tratadas pelo acteosídeo e seus derivados. Os valores de A490nm foram usados ​​para avaliar os efeitos citoprotetores relativos. Como visto na Tabela 2, cada acteosídeo e seus derivados aumentaram de forma dependente da dose os valores de A490nm. No entanto, na mesma concentração, o poliumósido deu os maiores valores de A490nm.

3. Discussão

A ação antioxidante de compostos fenólicos naturais é conhecida por estar envolvida na transferência de elétrons (TE) [18,19]. Assim, alguns ensaios de redução de metais baseados em ET têm sido amplamente utilizados para avaliar os níveis antioxidantes de fenólicos, como os ensaios FRAP e CUPRAC. As diretrizes do ensaio FRAP devem ser cumpridas com um pH inferior a 3,6. Tal ambiente ácido suprimiu com sucesso a ionização de H+ dos fenólicos; assim, o ensaio FRAP é considerado um mero processo ET [20,21]. A eficácia do acteosídeo e seus derivados no ensaio FRAP implica que, quando o acteosídeo e seus derivados atuam comoantioxidantes, eles podem usar a via ET para exercer sua ação antioxidante.

Além disso, também realizamos um ensaio CUPRAC em tampão pH 7,4. Como visto em Supl. 1, o acteosídeo e seus derivados aumentaram de forma dose-dependente suas porcentagens de poder redutor de Cu2 mais, indicando que poderiam permanecer com potencial ET em pH fisiológico. No entanto, seus potenciais ET diminuíram na seguinte ordem: acteoside > forsythoside B > poliumosside (Tabela 1). Essa dinâmica sugere claramente que a fração apiosil no forsythoside B e a fração ramnosyl no poliumoside reduziram o potencial de ET.

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Para testar a possibilidade de que ET ocorra durante seus processos de eliminação de radicais, um radical livre centrado em oxigênio PTIO· foi introduzido no estudo. Evidências de voltametria cíclica revelaram que a eliminação de PTIO· abaixo de pH 5.0 é uma reação de elétron-redox [22]. A observação de que o acteosídeo e seus derivados podem eficientemente sequestrar o radical PTIO· em pH 4,5, sugere a possibilidade de ET durante seus processos de eliminação de radicais. Obviamente, esta descoberta apoia ainda mais os resultados acima mencionados dos ensaios FRAP e CUPRAC, e resultados anteriores de que um elétron doador (e) é uma característica de fenólicos.antioxidantes[23]. Em pH fisiológico 7,4, no entanto, o ensaio de eliminação de PTIO não é meramente uma via ET, mas também inclui uma via de transferência de prótons (H plus). Durante o processo, foi sugerido que o PTIO aceitasse H plus dos fenólicos para produzir o pico do produto ([PTIO-H] plus) [16]. Como a transferência de H+ é sempre acompanhada por ET em mecanismos escalonados ou síncronos [24], o produto realista (ou final) é uma molécula [PTIO-H] [22]. A eliminação de PTIO· a pH 7,4 (Supl. 1) implica que o acteósido e os seus derivados possuem também um potencial de transferência de H+. Os valores de IC50 (Tabela 1) indicaram que o

os potenciais de transferência H+ relativos estavam em ordem decrescente de acteósido > forsitósido B > poliumósido. Claramente, as porções apiosil e ramnosil também enfraqueceram o potencial de transferência de H+ durante o processo antioxidante.

Como discutido anteriormente, durante o processo antioxidante dos fenólicos, a ET é geralmente acompanhada pela transferência de prótons (H mais ) para formar vários mecanismos antioxidantes [24], como a transferência de átomos de hidrogênio (HAT) [23,25-27], elétrons sequenciais -transferência de prótons (SEPT) [26,27], transferência sequencial de um único elétron com perda de prótons (SPLET) [26] e transferência de elétrons acoplados a prótons (PCET) [24–26,28].

Por exemplo, ABTS plus ·-scavenging, uma reação dominada pela transferência de um único elétron (SET) [29], também provou ser afetada pelos níveis de H+ recentemente [30]. ABTS plus ·-scavenging é, portanto, um ensaio antioxidante baseado em múltiplas vias [21,31]. O fato de que o acteosídeo e seus derivados podem eliminar radicais ABTS plus · indica que sua ação antioxidante também pode ser mediada por múltiplas vias. Esta hipótese é ainda confirmada pela evidência do ensaio de eliminação de DPPH·, uma reação que compreende as múltiplas vias HAT, ET, SEPT e PCET [26,32]. No entanto, a análise quantitativa baseada nos valores de IC50 (Tabela 1) revelou que nos aspectos ABTS multi-vias mais ·-scavenging e DPPH·-scavenging, o acteosídeo foi superior ao seu apiosídeo forsythoside B e ramnosídeo poliumósido. Assim, pode-se deduzir que as porções apiosil e ramnosil eventualmente impedem potenciais de múltiplas vias (especialmente ET e H plus -transfer) durante o processo de eliminação de radicais livres. Conforme observado pelos autores e outros [14,26], durante o processo antioxidante, uma reação RAF também pode ocorrer. Para verificar a possibilidade de RAF, no entanto, trêsfenilpropanóideglicosídeosjuntamente com o ácido cafeico foram estudados usando análise UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS. Descobriu-se que o ácido cafeico produz um produto dimérico, enquanto trêsfenilpropanóideglicosídeosnão produziu pico de produto RAF.

Essa descoberta sugere claramente que trêsfenilpropanóideglicosídeosnão podem sofrer a via RAF para exercer sua ação antioxidante. Uma vez que três glicosídeos fenilpropanóides podem ser considerados como ésteres de ácido cafeico (Figura 1), tal diferença entre ácido cafeico e ésteres de ácido cafeico também indica que uma porção enorme pode dificultar a geração de RAF.

Tomados em conjunto, do ponto de vista de eliminação de radicais livres, o acteosídeo e seus derivados podem passar por múltiplas vias para exercer sua ação antioxidante. Essas vias antioxidantes pelo menos estão envolvidas na transferência de ET e H plus (mas não RAF). Nossos achados são parcialmente apoiados pelo estudo teórico de que o acteosídeo poderia exercer a ação antioxidante pela via SPLET. No processo, o acteosídeo pode primeiro desprotonar (transferência de H+) para produzir ânion. Acredita-se que a desprotonação ocorra nas porções de catecol com acidez fraca. Posteriormente, o ânion doou elétrons para dar origem à forma do radical fenoxi [33]. Os radicais fenoxi com conjugação pu, no entanto, são estáveis ​​até certo ponto. É claro que, a este respeito, é necessário mais trabalho experimental no futuro.

Vale ressaltar que o estresse oxidativo celular também pode se originar de metais de transição (especialmente Fe2 plus). O íon Fe2 mais, no entanto, pode transformar a molécula de H2O2 em radicais · OH mais nocivos através da reação de Fenton (Fe2 mais mais H2O2 ● Fe3 mais mais ·OH mais OH.). Portanto, a atenuação dos níveis de Fe2 plus pode efetivamente inibir os radicais ·OH para liberar o estresse oxidativo celular. De fato, quelante de ferro por fenólicos naturaisantioxidantesagora foi desenvolvido em uma terapia eficaz para algumas doenças de estresse oxidativo [34,35].

No presente estudo, o acteosídeo e seus derivados foram sugeridos como eficazes quelantes de Fe2 plus pelas mudanças na espectroscopia e nas cores da solução (Figura 2). No entanto, o acteosídeo é inferior aos dois glicosídeos na quelação de Fe2 plus e o forsythosídeo B com porção apiosil é inferior ao poliumosídeo com porção ramnosil. Com base na comparação de suas conformações preferenciais (Figura 1, à direita), propõe-se que a porção apiosil (ou ramnosil) pode auxiliar o ligante principal (fenilpropanóidegrupo) na quelação de Fe2 plus. Tal efeito sinérgico, sem dúvida, fortalece a capacidade quelante de Fe2 plus e aumenta os picos de UV-vis. No entanto, o ramnosil é mais eficaz que o apiosil em sua capacidade quelante de Fe2 mais. A diferença pode ser atribuída ao fato de que o ramnosil ocorre na forma hexocíclica (isto é,/-L-ramnopiranosil), enquanto o apiosil está na forma pentacíclica (isto é, -D-apiofuransil). Uma forma hexocíclica é conhecida por ser maior e mais estável. Assim, o ramnosil hexocíclico é mais eficaz em comparação com o apiosil pentacíclico na sua capacidade quelante de Fe2 mais.

Para testar se o acteosídeo e seus derivados podem eliminar ROS, realizamos um ensaio de auto-oxidação de pirogalol. Como visto em Supl. 1, todos poderiam eliminar eficientemente o ·O2. radical, uma ROS típica que ocorre nas células. No entanto, a bioatividade relativa diminuiu na ordem poliumósido > forsitósido B > acteósido. Essa ordem também é paralela à dos efeitos citoprotetores (Tabela 2). Essa descoberta indica que o efeito geral da fração ramnosil ou da fração apiosil é aumentar os efeitos de eliminação de ROS ou os efeitos citoprotetores.

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4. Materiais e Métodos

4.1. Produtos químicos e animais

Acteoside (número CAS: 61276-17-3, 97 por cento), forsythoside B (número CAS: 81525-13-5, 97 por cento) foram obtidos de BioBioPha (Kunming, China, Supl. 3). O poliumosídeo (número CAS: 94079-81-9, 97 por cento ) foi isolado por nossa equipe da erva tradicional chinesa Callicarpa pei HT Chang (suppl. 3). O DPPH·, (o)-6-hidroxil-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido carboxílico (Trolox), 2,9-dimetil{{ 16}},10-fenantrolina (neocuproína), 2,4,6-tripiridiltriazina (TPTZ) e pirogalol foram adquiridos da Sigma-Aldrich Shanghai Trading Co. (Xangai, China). (NH4)2ABTS [2,2→-azinobis (3-etilbenzeno-tiazolina-6-sal de diamônio de ácido sulfônico)] foi obtido da Amresco Chemical Co. (Solon, OH, EUA). O radical PTIO· foi adquirido da TCI Development Co., Ltd. (Xangai, China). O ácido cafeico foi adquirido do Instituto Nacional para o Controle de Produtos Farmacêuticos e Biológicos (Pequim, China). O meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), soro fetal bovino (FBS) e tripsina foram adquiridos da Gibco (Grand Island, NY, EUA). O kit de ensaio de anexina V/iodeto de propídio (PI) foi adquirido da Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Todos os outros reagentes foram de grau analítico.

Ratos Sprague-Dawley (SD) de 4 semanas de idade foram obtidos do Centro Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Guangzhou. O protocolo deste experimento foi realizado sob a supervisão do Comitê Institucional de Ética Animal da Guangzhou University of Chinese (número de aprovação 20170306A).

4.2. Ensaios de Redução de Metais (FRAP & CUPRAC)

Os ensaios de redução de metal incluem o ensaio de poder redutor de Fe3 plus e o ensaio de poder redutor de Cu2 plus. O ensaio redutor de Fe3 plus foi estabelecido por Benzie e Strain e é formalmente denominado FRAP [20]. O protocolo experimental deste ensaio foi descrito em um relatório anterior [9]. Resumidamente, o reagente FRAP foi preparado recentemente misturando 10 mM TPTZ, 20 mM FeCl3 e tampão acetato 0,25 M na proporção de 1:1:10 em pH 3,6. A amostra de teste (x=4–20 L, 0,05 mg/mL) foi adicionada a (20 . x) L de etanol a 95 por cento seguido por 80 L de reagente FRAP. Após uma incubação de 30-min à temperatura ambiente, a absorbância foi medida em 595 nm usando um leitor de microplacas (Multiskan FC, Thermo Scientific, Xangai, China). O poder redutor relativo da amostra foi calculado usando a seguinte fórmula:

onde Amax foi a absorbância máxima da mistura de reação com a amostra, e Amin é a absorbância mínima no teste. A é a absorbância da amostra.

O poder redutor de Cu2 plus também pode caracterizar o nível antioxidante e, portanto, é denominado CUPRAC. Este ensaio foi realizado de acordo com um método publicado anteriormente [36]. Resumidamente, 12 L de solução aquosa de CuSO4 (10 mmol/L), 12 L de solução etanólica de neocuproína (7,5 mmol/L) e (75 . x) L de solução tampão CH3COONH4 (0). 1 mol/L, pH 7,5) foram adicionados a poços com diferentes volumes de amostra (0,05 mg/mL, 4-20 L). A absorbância a 450 nm após 30 min foi medida usando o leitor de microplacas acima mencionado. A potência relativa do CUPRAC foi calculada usando a fórmula para FRAP. Amax foi a absorbância máxima da mistura de reação com o sample, e Amin é a absorbância mínima no teste. A é a absorbância da amostra.

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