Parte 1:Acteosídeo neutraliza processos catabólicos induzidos por interleucina-1 -através da modulação de proteínas quinases ativadas por mitógenos e da via de sinalização celular NFκB

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Hyangi Lim, 1 Do Kyung Kim, 1 Tae-Hyeon Kim, 1 Kyeong-Rok Kang

A osteoartrite (OA) é a doença articular degenerativa mais comum com dor articular crônica causada pela degeneração progressiva da cartilagem articular nas articulações sinoviais.Acteosídeo, um glicosídeo cafeoilfeniletanoide, possui várias atividades biológicas, como efeito antimicrobiano, anti-inflamatório, anticancerígeno, antioxidante, citoprotetor e neuroprotetor. Além disso, a administração oral deacteósidoem alta dosagem não causa genotoxicidade. Portanto, o objetivo do presente estudo é verificar os efeitos anticatabólicos daacteósidocontra a osteoartrite e sua via de sinalização anticatabólica.Acteosídeonão diminuiu a viabilidade de células de fibroblastos L929 de camundongo usadas como células normais e condrócitos primários de ratos.Acteosídeoneutralizaram a perda de proteoglicanos induzida por IL-1 -nos condrócitos e cartilagem articular suprimindo a expressão e ativação de uma enzima de degradação da cartilagem, como metaloproteinase de matriz- (MMP-) 13, MMP-1 e MMP{ {6}}. Além disso, o acteosídeo suprimiu a expressão de mediadores inflamatórios como óxido nítrico sintase induzível, ciclooxigenase-2, óxido nítrico e prostaglandina E2 nos condrócitos primários de ratos tratados com IL-1 . Subsequentemente, a expressão de citocinas pró-inflamatórias foi diminuída por acteosídeo nos condrócitos primários de ratos tratados com IL-1 . Além disso, o acteosídeo suprimiu não apenas a fosforilação de proteínas quinases ativadas por mitógenos em condrócitos primários de ratos tratados com IL-1, mas também a translocação de NFκB do citosol para o núcleo através da supressão de sua fosforilação. A administração oral de 5 e 10mg/kg de acteosídeo atenuou a degeneração progressiva da cartilagem articular no modelo de camundongo osteoartrítico gerado pela desestabilização do menisco medial. Nossos achados indicam queacteósidoé um potencial agente ou suplemento anticatabólico promissor para atenuar ou prevenir a degeneração progressiva da cartilagem articular.

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1. Introdução

A osteoartrite (OA) é a doença articular degenerativa mais comum com dor articular crônica causada pela degeneração progressiva da cartilagem articular nas articulações sinoviais [1]. Devido ao aumento da expectativa de vida, a prevalência de OA com perda de mobilidade e dor articular crônica causada pela degeneração progressiva da cartilagem articular nas articulações sinoviais é estimada em 18% e 9,6% em mulheres após a menopausa e em homens, respectivamente [2 ]. Embora a prevalência mundial de OA 2 Oxidative Medicine and Cellular Longevity aumente anualmente, a etiologia fisiopatológica da OA ainda é desconhecida. Pode ser causada por fatores de risco muito complexos e multifatoriais, como envelhecimento, sexo, herança genética, lesão articular traumática e carga mecânica articular grave. Além disso, as relações neuropatológicas entre a degeneração progressiva da cartilagem articular e o desenvolvimento de dor articular crônica são desconhecidas [3]. Assim, o objetivo do manejo clínico de pacientes com OA é a manutenção da mobilidade corporal e da função articular mecânica por meio do alívio da dor articular crônica, usando abordagens farmacológicas e não farmacológicas e cirurgia de substituição articular. A demanda pelo desenvolvimento de intervenção ou suplementação efetiva, com segurança biológica de longo prazo, para prevenir ou atenuar a OA para manter a qualidade de vida por meio da manutenção da função mecânica articular na população idosa é crescente.

Conforme mostrado na Figura 1, o acteosídeo (CAS No. 61276-17-3; C29H36O15) é um glicosídeo cafeoilfeniletanoide isolado de várias plantas herbáceas, como cloretos de Verbascum [4], Buddleja globosa [5] e Plantago australis [6]. Acteoside tem várias atividades biológicas como antimicrobiana [5], anti-inflamatória [7], anticancerígena [8], antioxidante [9], citoprotetora [9] e efeito neuroprotetor [10]. Além disso, a administração oral de acteosídeo em alta dosagem não causa genotoxicidade [11].

Assim, levantamos a hipótese de que o acteosídeo com segurança biológica antiinflamatória tem efeitos anticatabólicos associados à proteção da cartilagem articular contra a degeneração progressiva da cartilagem articular através da supressão de fatores catabólicos, como as citocinas pró-inflamatórias, mediadores inflamatórios e enzimas de degradação da cartilagem nas articulações sinoviais. . Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos anticatabólicos induzidos por actosídeos e sua via de sinalização celular tanto in vitro, usando condrócitos primários isolados da cartilagem articular da articulação do joelho de rato, quanto in vivo, usando um modelo animal OA gerado por cirurgia desestabilização do menisco medial na articulação do joelho de camundongos.

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2. Métodos

2.1. Cultura de células. Condrócitos primários de ratos foram isolados da cartilagem articular de articulações do joelho de ratos (5-dia de idade; Sprague-Dawley), de acordo com o protocolo (CIA- CUC2019-A0027) aprovado pelo Instituto Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Chosun, Gwangju, República da Coréia. Condrócitos primários isolados de rato foram mantidos em meio de Eagle modificado/mistura de nutrientes F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Life Technologies , Grand Island, NY, EUA), antibióticos (50U/mL de penicilina e 50ug/mL de estreptomicina) e 50ug/mL de ácido ascórbico. A linha de células L{15}} de fibroblastos de camundongo normal foi adquirida da American Type Culture Collection (ATCC). De acordo com as instruções fornecidas pela ATCC, as células L{16}} foram cultivadas no meio mínimo essencial de Eagle, contendo 10% de FBS, e foram cultivadas em uma incubadora umidificada a 37 graus com 5% de CO2.

2.2. Ensaio de Viabilidade Celular. O ensaio de sal dimetiltiazolil difeniltetrazólio (MTT) foi realizado para avaliar a viabilidade de células de fibroblastos de camundongo da linhagem L929 usadas como células normais e condrócitos primários de ratos tratados com acteosídeo. Resumidamente, células L929 e condrócitos primários de rato foram cultivados a uma densidade celular de 8×105 células/mL em placas de cultura por 24h e depois tratados com 2,5, 5, 10, 25, 50 e 100μM de acteosídeo por 24h. Após o tratamento com solução de MTT, tanto as células L929 quanto os condrócitos foram cultivados por 4h. Após a incubação, os cristais de MTT formados foram suspensos completamente em dimetilsulfóxido e medidos quanto à absorbância em 570 nm usando um espectrômetro (espectrofotômetro de microplacas Epoch, BioTek®, Winooski, VT, EUA) para avaliar a viabilidade celular.

2.3. Ensaio de células vivas/mortas. A sobrevivência celular foi realizada usando o kit de ensaio Cell Live/Dead (Molecular Probes, Carlsbad, CA, EUA), que é composto de calceína-AM verde para marcação de células vivas (com fluorescência verde) e homodímero de etídio-1 para marcação de células mortas células (com fluorescência vermelha). Resumidamente, tanto as células L929 quanto os condrócitos primários de rato foram cultivados a uma densidade celular de 8×105 células/mL em lâminas de câmara (sistema Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide™; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) por 24h e depois tratados com 50 e 100μM de acteosídeo por 24h. Após o cultivo, foi realizado um ensaio de sobrevivência celular de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, as células coradas foram fotografadas usando um microscópio de fluorescência (Eclipse TE200; Nikon Instruments, Melville, NY).

2.4. Ensaio de azul de dimetilmetileno (DMMB). O ensaio de DMMB foi realizado para avaliar a alteração do conteúdo de proteoglicanos em condrócitos primários de ratos tratados com acteosídeo por 21 dias na presença ou ausência de IL-1 . Para manter as características dos condrócitos primários de rato por 21 dias, os condrócitos primários de rato (2 × 106 células) foram suspensos em 1 mL de alginato a 1,2 por cento e então encapsulados por gotejamento da suspensão de células/alginato em uma solução de 105mM CaCl2. Os condrócitos primários de rato encapsulados em alginato foram cultivados por 24h em DMEM/F12 (contendo 10 por cento de FBS, 50U/mL de penicilina, 50ug/mL de estreptomicina e 50ug/mL de ácido ascórbico) e depois adaptados por 24h em DMEM/F12 contendo 1 por cento mini-insulina-transferrina-selênio (mini-ITS) e ácido ascórbico 50ug/mL. Posteriormente, os condrócitos foram tratados com 50 ou 100μM de acteosídeo na presença ou ausência de 1ng/mL de IL-1 por 21 dias. No dia 21, os condrócitos primários de rato foram coletados para avaliação do teor de proteoglicano usando o ensaio DMMB, conforme descrito anteriormente [12]. Além disso, para quantificar o conteúdo de proteoglicanos por célula e avaliar a proliferação de condrócitos primários de rato, o número de células foi medido por ensaio de DNA usando PicoGreen (Molecular Probes, Carlsbad, CA), de acordo com as instruções do fabricante.

2.5. Cultura de Órgãos Ex Vivo de Tecidos de Cartilagem Articular de Rato. Tecidos de cartilagem articular foram isolados das articulações do joelho de 5-ratos Sprague-Dawley de um dia de idade e então cultivados em DMEM/F12 suplementado com 10% de FBS. Em seguida, a cartilagem articular

amostras foram tratadas com 100μM de acteosídeo nopresença ou ausência de 10ng/mL de IL-1 por 7 dias. Ao final do período de cultivo, as amostras foram coletadas e fixadas em paraformaldeído a 4% por 72h para análise histológica.

2.6. Análise Histológica. A análise histológica usando safranina-O e coloração fast green foi realizada para verificar a perda de proteoglicanos na cartilagem articular tratada com 100μM de acteosídeo na presença ou ausência de 10ng/mL IL-1 por 7 dias. Resumidamente, amostras fixas de cartilagem articular foram descalcificadas em ácido etilenodiaminotetracético e então incluídas em parafina. Em seguida, os blocos de parafina preparados contendo cartilagem articular foram fatiados em série com 5μm de espessura e colocados em lâminas. A coloração com Safranina-O e Fast Green foi subsequentemente realizada para avaliar a perda de proteoglicanos na substância fundamental da cartilagem articular. Além disso, coloração de hematoxilina e eosina foi realizada para observar a morfologia geral da cartilagem articular.

2.7. Blotting Ocidental. Western blotting foi realizado para investigar a expressão de fatores catabólicos, incluindo MMP-13, MMP-1, MMP-3, sintase de óxido nítrico induzível (iNOS) e ciclooxigenase-2 (COX -2) e a alteração de moléculas de sinalização celular, como proteínas quinases ativadas por mitógenos e fator nuclear-kappa B (NFκB). Resumidamente, os condrócitos primários de ratos foram tratados com 50 ou 100μM de acteosídeo na presença ou ausência de 10ng/mL de IL-1 por 24h. Em seguida, os condrócitos primários de rato foram colhidos por centrifugação e lisados ​​usando tampão de lise (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Além disso, para verificar a translocação nuclear de NFκB, condrócitos primários de ratos foram tratados com 50 ou 100μM de acteosídeo na presença ou ausência de 10ng/mL de IL-1 por 24h. Em seguida, as frações citosólica e nuclear foram extraídas com os reagentes de extração nuclear e citoplasmática NE-PER™ (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de proteína total extraída de condrócitos primários de rato foi determinada usando um kit de ensaio de proteína de ácido bicinconínico (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Além disso, o meio condicionado foi coletado para detectar os níveis de enzimas de degradação da cartilagem secretadas pelos condrócitos. Quantidades iguais de proteína e meio condicionado foram submetidas a eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e depois transferidas para membranas de nitrocelulose. Posteriormente, Western blotting foi realizado usando anticorpos primários direcionados contra MMP-13, MMP-1, MMP-3, iNOS, COX-2, phosphoERK1/2, total-ERK1 /2, fosfop38, p38 total, JNK de fósforo, JNK total, fosfoNFκB, NFκB total, -actina e lamina B. As bandas imunorreativas foram visualizadas usando um sistema de quimioluminescência aprimorado (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) de acordo com instruções do fabricante e, em seguida, fotografado por um dispositivo Microchemi (DNR Bioimaging Systems, Jerusalém, Israel).

2.8. Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa (qPCR) e PCR Quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR). Condrócitos primários de rato foram tratados com 50 ou 100μM de acteosídeo na presença ou ausência de 10ng/mL de IL-1 por 24h. Em seguida, o RNA total foi isolado dos condrócitos primários de rato usando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração total de RNA foi medida usando um NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA). Para sintetizar o cDNA, 1ug ​​de RNA foi transcrito reverso usando um sistema de transcrição reversa-PCR ThermoScript (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A qPCR do cDNA foi realizada usando 2× TOPsimple™ DyeMIX-Taq (Enzynomics, Seul, República da Coréia) e primers específicos em um dispositivo TaKaRa PCR Thermal Cycler (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japão). Em seguida, os produtos de PCR foram submetidos a eletroforese em gel de agarose para determinar os níveis de expressão dos genes alvo. A gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi usada como controle endógeno. Além disso, para qRT-PCR, o cDNA foi amplificado usando um sistema Eco™ Real-Time PCR (illumine Inc., San Diego, CA, EUA). -Actina foi usada como controle endógeno. As sequências dos primers usados ​​na qPCR e qRT-PCR estão resumidas nas Tabelas 1 e 2, respectivamente.

benefício do cistanche (acteoside): melhorar a imunidade

3. Resultados

3.1. Acteoside não afeta a viabilidade da célula L929 e dos condrócitos primários do rato. A linha celular de fibroblastos de camundongo L929 usada como células normais foi tratada com 2,5, 5, 10, 25, 50 e 100μM de acteosídeo por 24h. Em seguida, o ensaio MTT foi realizado para avaliar a citotoxicidade do acteosídeo em células L929. Conforme mostrado na Figura 2(a), as viabilidades relativas das células L929 foram determinadas como 94:8±8 por cento, 93:6±7 por cento, 100 ± 5 por cento, 103:9± 5 por cento, 126:1±8 por cento e 122:7±4 por cento a 2,5, 5, 10, 25, 50 e 100μM de acteosídeo, respectivamente, em comparação com o controle (100:02 ± 3 por cento). Além disso, para verificar a citotoxicidade do acteosídeo em condrócitos primários de rato, o ensaio de MTT foi realizado conforme mostrado na Figura 2(b). As viabilidades de condrócitos primários de rato tratados com 2,5, 5, 10, 25, 50 e 100μM de acteosídeo foram determinadas como 114 ± 4 por cento, 117:8±6 por cento, 123:9±5 por cento, 132:6±4 por cento, 153:1±7 por cento e 142:1±6 por cento, respectivamente, em comparação com o controle (100:4±5 por cento). Além disso, para confirmar o efeito do acteosídeo na viabilidade de ambas as células L929 e condrócitos primários de rato, um ensaio Cell Live/Dead foi realizado como mostrado na Figura 2(c). O número de células mortas coradas como fluorescência vermelha não aumentou para células L929 e condrócitos primários de rato tratados com 50 e 100μM de acteosídeo por 24h. Esses dados demonstraram consistentemente que a dosagem definida de acteosídeo não afetou a viabilidade de células L929 e condrócitos primários de ratos. Assim, actosídeos 50μM e actosídeos 100μM, que são doses não tóxicas tanto em células L929 quanto em condrócitos primários de ratos, foram usados ​​para verificar seus efeitos anticatabólicos em estudos in vitro usando condrócitos primários de ratos.

3.2. Acteoside neutraliza IL-1 -perda de proteoglicano induzida em condrócitos primários de rato. Condrócitos primários de rato incorporados em grânulos de alginato foram tratados com 50 e 100μM de acteosídeo na presença ou ausência de 1ng/mL de IL- 1 por 21 dias. Em seguida, foi realizado um ensaio de DMMB para avaliar a alteração no teor de proteoglicanos, conforme mostrado na Figura 3(a). Os teores relativos de proteoglicanos foram determinados como 88:3±18:1 por cento e 86:8±16:3 por cento nos condrócitos primários de rato tratados com 50 e 100μM de acteosídeo, respectivamente, em comparação com o controle (103:8± 32:3 por cento). Embora os conteúdos relativos de proteoglicanos tenham diminuído pelo acteosídeo, esses resultados não foram significativos. No entanto, o conteúdo relativo de proteoglicano diminuiu significativamente em 37:1 ± 14:7 por cento nos condrócitos primários de rato tratados com 1ng/mL de IL-1, mas 50 e 100μM de acteosídeo reduziram significativamente o conteúdo de proteoglicano em 57 ± 12:4 por cento e 64 ± 14:5 por cento, respectivamente, na presença de 1ng/mL de IL-1. Posteriormente, para verificar se o acteosídeo suprime a perda de proteoglicanos induzida por IL-1 -, a cartilagem articular dissecada das articulações do joelho de ratos foi tratada com 100μM de acteosídeo na presença ou ausência de 10ng/mL de IL-1 por 7 dias. Posteriormente, as avaliações histológicas usando coloração H&E e safranina-O e coloração verde rápido foram realizadas conforme mostrado na Figura 3(b). A alteração morfológica não foi observada pela coloração H&E; no entanto, safranina-O e coloração verde rápido revelaram que o proteoglicano corado como a cor vermelha não se alterou nas cartilagens articulares tratadas com 100μM de acteosídeo em comparação com o controle. No entanto, a perda severa de proteoglicanos foi induzida por 10ng/mLIL-1 na cartilagem articular, e 100μM de acteosídeo suprimiu significativamente a perda de proteoglicanos na cartilagem articular tratada com 10ng/mL de IL- 1. Coletivamente, esses dados mostram consistentemente que o acteosídeo tem um efeito anticatabólico que retarda a degeneração da cartilagem articular ao neutralizar a perda de proteoglicanos induzida por IL{53}}.

3.3. Acteoside tem um efeito anticatabólico que suprime a expressão e ativação de MMP em condrócitos primários de ratos tratados com IL-1 . Para investigar se o efeito anticatabólico induzido por acteosídeos está associado à supressão da expressão e ativação de MMP, condrócitos primários de ratos foram tratados com 50 e 100μM de acteosídeos na presença ou ausência de 10ng/mL de IL-1 por 24h. A partir daí, as alterações nas MMPs foram investigadas. Conforme mostrado na Figura 4(a), embora a expressão de enzimas de degradação de cartilagem, como MMP-13, MMP-1 e MMP-3 tenha sido significativamente aumentada no meio condicionado de rato primário condrócitos tratados com 10ng/mL de IL-1 , foi diminuído por acteosídeo de maneira dose-dependente. Além disso, os resultados de qPCR (Figura 4(b)) e qRT-PCR (Figura 4(c)) revelaram que IL-1 aumentou significativamente os níveis de mRNA de MMPs como MMP-13, MMP{ {22}} e MMP-3 nos condrócitos primários de rato. No entanto, eles diminuíram de forma dose-dependente nos condrócitos primários de ratostratado com 50 e 100μM de acteosídeo. Além disso, 50 e 100μM de acteosídeos suprimiram efetivamente a ativação de MMPs nos condrócitos primários de ratos tratados com 10ng/mL de IL-1 (Figura 4(d)). Tomados em conjunto, esses dados indicam consistentemente que o acteosídeo tem um efeito anticatabólico que suprime a expressão e a ativação de enzimas que degradam a cartilagem.

3.4. Acteoside suprime a expressão e produção de mediadores inflamatórios catabólicos induzidos por IL1 - e citocinas pró-inflamatórias em condrócitos primários de ratos. Para determinar se o acteosídeo tem um efeito preventivo contra a OA, condrócitos primários de ratos foram tratados com 50 e 100μM de acteosídeo na presença ou ausência de 10ng/mL de IL-1 por 24h. A partir daí, foram investigadas as alterações nos mediadores inflamatórios, fatores catabólicos representativos como iNOS, COX-2 e PGE2. Os níveis de mRNA de iNOS, COX-2 e PTGS-2 foram significativamente aumentados por IL-1 nos condrócitos primários de ratos.

No entanto, eles diminuíram de forma dependente da dose nos condrócitos primários de rato tratados com acteosídeo (Figura 5(a)). Além disso, o acteosídeo não apenas suprimiu a expressão de iNOS e COX-2 nos condrócitos primários de ratos tratados com IL-1 (Figura 5(b)), mas também diminuiu significativamente a produção relativa de NO e PGE2 como mostrado nas Figuras 5(c) e 5(d), respectivamente. Esses dados sugerem que o acteosídeo suprime a expressão de citocinas pró-inflamatórias induzidas por mediadores inflamatórios que atuam como fatores catabólicos para induzir a degeneração progressiva da cartilagem articular. Portanto, para investigar a alteração da expressão de citocinas pró-inflamatórias por 50μM de acteosídeo nos condrócitos primários de rato tratados com 10ng/mL de IL- 1, uma matriz de citocinas foi realizada conforme mostrado na Figura 6. Acteoside suprimiu a expressão de neutrófilos induzidos por citocinas quimioatraente- (CINC-) 2, CINC-3, fator neurotrófico ciliar (CNTF), fractalcina (CX3CL1), IL-1 , IL- 1 , leptina, proteína quimioatraente de monócitos{{22} } (MCP-1), proteína inflamatória de macrófagos (MIP-) 3 e -nervofator de crescimento (NGF) nos condrócitos primários de rato tratados com IL-1 em comparação com IL-1 sozinho. Tomados em conjunto, esses dados sugerem consistentemente que o acteosídeo previne a degeneração progressiva da cartilagem articular através da supressão de mediadores inflamatórios e citocinas pró-inflamatórias contra os efeitos catabólicos induzidos por IL-1 -em condrócitos primários de ratos.

3.5. Acteoside suprime a fosforilação de MAPK e NFκB em condrócitos primários de ratos tratados com IL-1 . Para investigar as vias de sinalização celular associadas aos efeitos anticatabólicos induzidos por actosídeos contra a alteração da citocina pró-inflamatória IL-1 de MAPK e NFκB, condrócitos primários de ratos foram tratados com 50 e 100μM de acteosídeos na presença ou ausência de IL{{8 }} por 24h. Em seguida, a proteína total foi extraída e submetida a eletroforese no gel SDS-PAGE para realizar o Western blot. Conforme mostrado na Figura 7, MAPK como ERK1/2, p38 e JNK foram significativamente fosforilados nos condrócitos primários de rato tratados com IL-1 , enquanto 50 e 100μM de acteosídeo não induziram significativamente a fosforilação de MAPK em comparação com o controle em condrócitos primários de ratos. No entanto, 50 e 100μM de acteosídeos, de forma dose-dependente, suprimiram a fosforilação de MAPK induzida por IL-1 -em condrócitos primários de ratos. Além disso, a fosforilação de NFκB nos condrócitos primários de ratos tratados com 10ng/mL de IL-1 foi gradualmente diminuída por acteosídeo de maneira dose-dependente. Esses dados indicam que as vias de sinalização celular MAPK e NFκB estão intimamente envolvidas com os efeitos anticatabólicos induzidos por acteosídeos contra IL-1 em condrócitos primários de ratos.

3.6. Acteoside suprime a translocação de NFκB do citosol para o núcleo através da supressão de IL-1 -fosforilação induzida de NFκB em condrócitos primários de rato. Para investigar se o acteosídeo suprime a translocação de NFκB do citosol para o núcleo, condrócitos primários de rato foram tratados com 50 e 100 ug/mL de acteosídeo na presença ou ausência de 10 ng/mL de IL-1 . Conforme mostrado na Figura 8(a), NFκB foi significativamente translocado para o núcleo do citosol dos condrócitos primários de rato tratados com 10ng/mL de IL-1. No entanto, foi significativamente inibido pelo acteosídeo de maneira dose-dependente. Além disso, embora o nível de NFκB tenha sido aumentado na fração nuclear extraída dos condrócitos primários de rato tratados com 10ng/mL de IL-1, ele foi diminuído de forma dose-dependente pelo acteosídeo, conforme mostrado na Figura 8(b). O nível de NFκB foi diminuído na fração citosólica extraída dos condrócitos primários de ratos tratados com 10ng/mL de IL-1 , mas foi aumentado de forma dose-dependente pelo acteosídeo. Tomados em conjunto, esses dados indicam consistentemente que os efeitos anticatabólicos induzidos por actosídeos contra IL-1 estão envolvidos na supressão da translocação do citosol para o núcleo na modulação da via de sinalização NFκB em condrócitos primários de ratos.

3.7. Acteoside Atenua a Degeneração Progressiva da Cartilagem Articular em Animais com OA da Articulação do Joelho Induzida por DMM Cirúrgico. Para elucidar os efeitos anticatabólicos induzidos por acteosídeos in vivo, animais induzidos por OA gerados pelo DMM cirúrgico realizado na articulação do joelho de camundongos BALB/c foram administrados oralmente 5 e 10mg/kg de acteosídeo resolvidos em 5 por cento de etanol em dias alternados durante 8 semanas. Em seguida, as articulações do joelho foram avaliadas histologicamente usando safranina-O e coloração verde rápido, como mostrado na Figura 9. A perda de proteoglicano e lesão da superfície da cartilagem articular foram significativamente aumentadas na articulação do joelho dissecada de animais com OA induzida por DMM. No entanto, a administração oral de acteosídeo suprimiu a perda de proteoglicanos e menor lesão da cartilagem articular em comparação com apenas o veículo. Além disso, a pontuação de classificação de Mankin foi significativamente aumentada no grupo de animais OA (n =5, 3± 0:7) veículo fornecido apenas em comparação com Naïve (n =5, 0 :67 ± 0:5). No entanto, a administração oral de 5 e 10mg/kg de acteosídeo no grupo de animais OA (n=5) diminuiu a pontuação de classificação de Mankin em 2±0:7 e 1:67±0:5 , respectivamente, em comparação com apenas o veículo. Em conjunto, esses dados indicam que a administração oral de acteósido atenua a degeneração progressiva da cartilagem articular em articulações sinoviais com condições catabólicas.

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