Extração de glicosídeos feniletanóides de Cistanche Tubulosa por extração de homogeneização por cisalhamento de alta velocidade

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Wenjing Pei e Ruili Guo

Fundo:

Cistanche tubulosaé uma conhecida medicina tradicional chinesa originária de Xinjiang. É amplamente distribuído no norte da África, Índia, etc. Objetivo: O principal componente bioativo daC. tubulosaé glicosídeos feniletanoides (PhGs). Echinacoside e acteoside são os componentes indicativos para a determinação de PhGs e são usados ​​principalmente para proteção hepática, proteção imunológica, etc. Portanto, é muito importante extrair os PhGs de C. tubulosa. Métodos: Neste estudo, os métodos de extração assistida por ultrassom (UAE), extração assistida por microondas (MAE) e extração de homogeneização por cisalhamento de alta velocidade (HSHE) foram comparados. Além disso, as condições de extração do método HSHE foram otimizadas. Resultados: Os resultados mostraram que o método HSHE foi melhor do que os métodos UAE e MAE, e os parâmetros de extração ideais de HSHE foram uma concentração de etanol de 50 por cento, uma temperatura de extração de 70 graus, uma velocidade de rotação de 16000 rpm, um tempo de extração de 2 min, uma relação sólido-líquido de 1:9 e um ciclo de extração. Os rendimentos de echinacoside e acteoside foram de 1,366 e 0,519%, respectivamente, e as taxas de transferência de echinacoside e acteoside atingiram 87 e 94%, respectivamente. Conclusões: Pode-se concluir que o método HSHE é uma técnica simples, rápida e eficiente para extração de PhGs de C. tubulosa. Destaques: Um método HSHE eficiente e ecologicamente correto foi investigado para a extração de PhGs de C. tubulosa. As condições ótimas do método HSHE para a extração de PhGs de C. tubulosa foram obtidas. Esta pesquisa fornece um novo método para a extração industrial de PhGs deC. tubulosa.

Cistanche tubulosa

Cistanche tubulosaé uma medicina tradicional chinesa comum que se origina em Xinjiang. É amplamente distribuído no norte da África, Península Arábica, Paquistão e Índia e foi registrado oficialmente na Farmacopeia Chinesa em 2010. O principal componente bioativo daC. tubulosaé glicosídeos feniletanoides (PhGs), uma classe de produtos naturais solúveis em água, incluindo echinacoside, acteoside, isoacteoside e 2-acetilacteoside (1, 2). A estrutura dos PhGs consiste em porções de ácido cinâmico e hidroxifeniletila, ambas ligadas a uma -glicopiranose por meio de ligações éster e glicosídicas, respectivamente (3). Estudos farmacológicos mostraram que PhGs de C. tubulosa têm muitas funções medicinais, como efeitos antifadiga (4), neuroprotetores (5-7), protetores do fígado (8-10) e imunoprotetores (11). Portanto, a extração efetiva de PhGs de C. tubulosa é de grande importância para o desenvolvimento e utilização de produtos naturais.

Os atuais métodos tradicionais de extração de PhGs são extração por refluxo a quente, extração assistida por ultrassom (UAE) e extração assistida por micro-ondas (MAE; 12-16). Esses métodos apresentam diferentes desvantagens, como baixa eficiência, longos tempos de extração e altos custos. Comparado com os métodos tradicionais, o método de extração de homogeneização por cisalhamento de alta velocidade (HSHE) é um método de extração novo e emergente e tem as vantagens de tempos de extração mais rápidos, menos desperdício de solvente, maiores rendimentos, dispositivo mais simples e operação mais fácil (17). O princípio de funcionamento do método HSHE é baseado em um cortador interno rotativo acionado por um motor de alta velocidade. Uma poderosa força de cisalhamento é produzida pelos cortadores internos e externos para romper e misturar as amostras. Enquanto isso, o cortador com rotação de alta velocidade causa diferenças de pressão entre as cavidades interna e externa do cortador, resultando em uma transferência de massa entre as amostras e os solventes. Com a combinação de alta força de cisalhamento, força de colisão, pressão e outras forças, um equilíbrio solúvel entre amostras sólidas e solventes pode ser rapidamente alcançado (18). Assim, o processo de extração de HSHE pode ser concluído em poucos minutos e até mesmo em dezenas de segundos (19-22).

Recentemente, o HSHE tem sido explorado na extração de componentes bioativos de vários produtos naturais (23-25). Cheng et ai. usou HSHE para extrair cinco lignanas do fruto de Schisandra Chinensis (26). Os resultados mostraram que as condições ideais eram uma concentração de etanol de 75 por cento, um tempo de extração de 1 min, uma relação sólido-líquido de 1:19, uma tensão de extração de 180 V e uma partícula de amostra tamanho de 120 malhas. O rendimento total das cinco lignanas foi de 13,89 ± 0,014 mg/g nas condições otimizadas. Tang et ai. usaram HSHE para obter óleo bioativo de sementes de perilla (27). As condições ideais foram um tempo de extração de 2 min, uma relação sólido-líquido de 1:10, uma tensão de extração de 150 V e dois ciclos de extração. O rendimento do óleo de semente de perilla atingiu 59,3%. Os resultados acima indicam que HSHE tem as vantagens de tempos de extração curtos, baixos custos e altos rendimentos. No entanto, faltam pesquisas sobre a extração de PhGs por HSHE.

No presente estudo, HSHE foi usado para explorar seu potencial de aplicação na extração de PhGs deC. tubulosa. O rendimento de PhGs foi determinado por HPLC. Os três métodos de extração, HSHE, UAE e MAE, foram comparados nas mesmas condições. Os efeitos da concentração de etanol, temperatura de extração, velocidade de rotação, tempo de extração, razão sólido-líquido e o número de ciclos de extração do rendimento foram investigados. As vantagens e desvantagens deste trabalho e as referências são comparadas e discutidas.

Materiais e métodos

Materiais e Reagentes Químicos

C. tubulosafoi adquirido da Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (Xinjiang, China). Os padrões de echinacoside (purezas maiores ou iguais a 98%) e acteoside (purezas maiores ou iguais a 98%) foram adquiridos da Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd (Xangai, China). O acetonitrilo, metanol e ácido acético eram de grau HPLC (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). O etanol de grau analítico foi adquirido da Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Tianjin, China). Água deionizada foi usada em todos os experimentos.

Análise HPLC

Uma análise de HPLC foi realizada em uma cromatografia líquida Waters e2695 (Waters, Milford, MA) equipada com um Detector UV/Visível 2489 e uma coluna Symmetry C18 (Waters), 250 × 4,6 mm, tamanho de partícula de 5 μm. As concentrações de echinacoside e acteoside foram analisadas pelo método de HPLC. A fase móvel consistia em (1) acetonitrila e (2) uma solução aquosa de ácido acético glacial a 2 por cento. O programa de eluição de gradiente é apresentado na Tabela 1.

O comprimento de onda detectado foi de 330 nm, a taxa de fluxo foi de 1 mL/min, o volume de injeção foi de 10 μL e a temperatura do forno foi ajustada em 30 graus. O pico cromatográfico do analito foi confirmado comparando seu tempo de retenção com o dos padrões. A quantificação foi realizada integrando o pico usando um método padrão externo.

O teste de precisão foi realizado injetando as mesmas amostras de extração cinco vezes. Para o teste de estabilidade, as mesmas amostras foram analisadas em incrementos de 0, 1, 2, 4, 12, 24 e 48 h. Os testes de recuperação de echinacoside e acteoside foram realizados adicionando os padrões nas amostras de extração. Todas as áreas de pico e tempos de retenção de echinacoside e acteoside foram registrados. Os resultados das curvas de calibração para echinacoside e acteoside estão listados na Tabela 2.

Cálculo do Rendimento

Echinacoside e acteoside foram usados ​​como componentes indicativos para a determinação de PhGs. O rendimento de echinacoside ou acteoside foi calculado usando a seguinte equação:

Y=CV/W×100 por cento (1)

onde Y=rendimento de echinacoside ou acteoside ( por cento ); C=concentrações de echinacoside ou acteoside (mg/mL); V=volume da solução de extração (mL); e W=peso do pó de C. tubulosa (mg).

Métodos de extração de PhGs

Os caules de C. tubulosa foram primeiramente moídos por um moedor elétrico (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, China) e filtrados por uma peneira de filtro (aproximadamente 380 μm). Em seguida, o pó de C. tubulosa foi seco em estufa a 70 graus até que o peso fosse constante. Cinco gramas de pó de C. tubulosa foram misturados com o solvente de extração e colocados em um frasco de extração. Depois, a mistura líquida foi pré-aquecida (30-80 graus) por 5 minutos em banho-maria a temperatura constante (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, China).

(a) Método HSHE.—HSHE foi realizado por um sistema FA25 (FLUKO Co., Ltd, Xangai, China), que consistia no cortador rotativo, motor de alta velocidade e controlador. A velocidade de rotação do cortador interno foi regulada na faixa de 10.000 a 28.000 rpm, e os tempos de extração foram ajustados na faixa de 2 a 15 min.

(b) Método dos EAU.— Cinco gramas de amostra seca e 300 mL de metanol foram pesados ​​com precisão e adicionados a um frasco de extração. A garrafa de extração foi imersa em um banho ultrassônico e realizada a uma potência ultrassônica de 300 W por 10 min. A temperatura de extração foi fixada em 30 graus.

(c) Método MAE.— Cinco gramas de amostra seca e 300 mL de metanol foram pesados ​​com precisão e adicionados a um frasco de extração. A garrafa de extração foi colocada no reator de micro-ondas e realizada a 180 W por 10 min. A temperatura de extração foi fixada em 30 graus.

O método HSHE foi comparado com os métodos UAE e MAE com o mesmo solvente de extração, tempo de extração, temperatura de extração, razão sólido-líquido e número do ciclo de extração. A solução de extração foi filtrada por uma membrana de 0.22 μm e analisada via HPLC para determinar as concentrações de echinacoside e acteside. Todos os processos de extração foram repetidos três vezes

Determinação das Taxas de Transferência

Com base no método padrão da 2{10}}15 Farmacopeia da China, os teores de echinacoside e acteoside no pó de C. tubulosa foram determinados (28). Um grama de pó de C. tubulosa e 50 mL de metanol a 50 por cento foram pesados ​​com precisão e adicionados a um balão volumétrico marrom de 50 mL. A mistura líquida foi pesada e embebida por 30 min. Em seguida, o balão volumétrico marrom foi imerso em banho ultrassônico e realizado em potência ultrassônica de 250 W e frequência de 35 kHz por 40 min. A mistura líquida foi pesada novamente e 50 por cento de metanol foi adicionado para suprir a perda de solvente. A solução de extração foi filtrada por uma membrana de 0,22 μm e foi analisada por HPLC para determinar as concentrações de echinacoside e acteoside. Os processos de extração foram repetidos três vezes.

As taxas de transferência de echinacoside ou acteoside foram calculadas usando a seguinte equação:

X= M1/M2 ×100 por cento (2)

onde X=taxa de transferência de echinacoside ou acteside ( percent ); M1=qualidade do echinacoside ou acteoside no extrato (mg); e M2=qualidade de echinacoside ou acteoside em pó de C. tubulosa (mg).

Resultados e discussão

Validação do Método HPLC

Os perfis de HPLC de echinacoside e acteoside de C. tubulosa usando HSHE são mostrados na Figura 1. O RSD das áreas de pico de echinacoside e acteoside foram 1,89 e 1,40 por cento, respectivamente. Os resultados mostraram que o método HPLC tem boa precisão na análise quantitativa do echinacoside e acteside. Em vários momentos (0–48 h), os RSDs das áreas de pico de echinacoside e acteside foram 1,71 e 1,70 por cento, respectivamente, indicando que a amostra estava estável em 48 h. A recuperação de echinacoside e acteoside foi de 99,3 e 99,1 por cento, respectivamente, e seu RSD foi de 0,70 e 0,67 por cento, respectivamente, o que confirmou a confiabilidade do método HPLC.

Comparação dos Diferentes Métodos de Extração

Foi realizada uma comparação do método HSHE com os métodos MAE e UAE quanto aos rendimentos de echinacoside e acteoside, cujos resultados são mostrados na Figura 2. Observou-se que os rendimentos de echinacoside e acteoside obtidos por HSHE foram superiores aos obtidos pelo MAE e pelos Emirados Árabes Unidos. Comparado com MAE, os rendimentos de echinacoside e acteoside obtidos por HSHE foram maiores em 20,5 e 20,8 por cento, respectivamente. E em comparação com os Emirados Árabes Unidos, os rendimentos de echinacoside e acteoside obtidos por HSHE foram maiores em 6,6 e 7,4 por cento, respectivamente. Estes resultados indicam que HSHE pode aumentar significativamente os rendimentos de PhGs.

Otimização do Método HSHE

Os parâmetros de extração de PhGs por HSHE incluem concentração de etanol, temperatura de extração, velocidade de rotação, tempo de extração, razão sólido-líquido e o número de ciclos de extração (26, 29).

Efeito da Concentração de Etanol na Extração de PhGs

A concentração de etanol é um fator importante que afeta os rendimentos de PhGs. Conforme mostrado na Figura 3, os rendimentos de echinacoside e acteoside de C. tubulosa sob diferentes concentrações de etanol foram investigados. Ele revelou que o rendimento de echinacoside aumentou de 0 para 30 por cento e depois diminuiu de 30 para 90 por cento com o aumento das concentrações de etanol. O rendimento de acteósido aumentou de 0 a 70 por cento e depois diminuiu de 70 a 90 por cento com o aumento das concentrações de etanol. Quando a concentração de etanol foi de 50 por cento, a soma dos rendimentos de echinacoside e acteoside foi máxima. As diferentes concentrações de etanol têm diferentes polaridades, o que leva a diferentes solubilidades de echinacoside e acteoside. Assim, a concentração ideal de etanol foi de 50%.

Efeito da velocidade de rotação na extração de PhGs

A Figura 5 mostra os efeitos de diferentes velocidades de rotação nos rendimentos de PhGs. Os rendimentos de echinacoside e acteoside aumentaram com o aumento da velocidade de rotação. O aumento da velocidade de rotação pode aumentar a força de cisalhamento da fresa interna e externa, aumentando assim os rendimentos de PhGs. A velocidade de rotação ideal foi de 16.000 rpm.

Efeito do Tempo de Extração na Extração de PhGs

Os rendimentos de echinacoside e acteoside sob os diferentes tempos de extração são mostrados na Figura 6. Os rendimentos de echinacoside e acteside foram estáveis ​​com o aumento dos tempos de extração. Pode-se, portanto, concluir que os PhGs podem ser completamente extraídos de C. tubulosa em 2 min, e o tempo ideal de extração foi de 2 min.

Efeito da razão sólido-líquido na extração de PhGs

Conforme mostrado na Figura 7, os rendimentos de echinacoside e acteoside sob as diferentes razões sólido-líquido foram discutidos. Os rendimentos de echinacoside e acteoside aumentaram de 1:3 para 1:9 e tornaram-se estáveis ​​de 1:9 para 1:24. Como uma pequena quantidade de solvente de extração não pode dissolver completamente o echinacoside e o acteoside, as taxas de transferência de massa foram reduzidas. A extração excessiva de solventes causava desperdícios desnecessários. Portanto, a relação sólido-líquido ideal foi de 1:9.

Efeito do número de ciclos de extração na extração de PhGs

A Figura 8 mostra os efeitos de vários ciclos de extração nos rendimentos de PhGs. Os rendimentos de echinacoside e acteside aumentaram com o aumento do número de ciclos de extração. No entanto, os tempos de extração aumentaram notavelmente com o aumento dos ciclos de extração e mais energia foi consumida. O número ideal de ciclos de extração foi um.

Comparando o método HSHE com outros métodos de extração para extrair PhGs

Os resultados do método HSHE em comparação com outros métodos de extração para extrair PhGs de C. tubulosa estão listados na Tabela 3. HSHE é mais simples e fácil do que os métodos de acoplamento, como a extração bifásica aquosa assistida por ultrassom e a tecnologia de extração por micro-ondas ultrassônica métodos. Além disso, a pressão de extração do HSHE é menor do que o método de extração de líquido pressurizado, e as condições de operação do primeiro são mais seguras. Mais importante, pode ser visto na Tabela 3 que o HSHE apresenta o menor tempo de extração e o menor consumo de solvente entre todos os métodos de extração. Pode-se concluir que o método HSHE possui muitas vantagens, como alta eficiência, condições de operação amenas, baixos níveis de consumo, equipamentos simples e fácil operação para extração de produtos naturais.

Conclusões

Neste estudo, um método HSHE eficiente e ecologicamente correto foi investigado para a extração de PhGs de C. tubulosa. Comparado com os métodos UAE e MAE, o novo método HSHE produz um maior rendimento de PhGs nas mesmas condições. Em comparação com o método MAE, os rendimentos de echinacoside e acteoside aumentaram 2{10}},5 e 20,8%, respectivamente. E em comparação com os Emirados Árabes Unidos, os rendimentos de echinacoside e acteoside aumentaram 6,6 e 7,4%, respectivamente. Os parâmetros de extração de HSHE de PhGs de C. tubulosa foram otimizados. Sob os parâmetros otimizados, os rendimentos de echinacoside e acteoside atingiram 1,366 e 0,519%, respectivamente, e as taxas de transferência de echinacoside e acteside atingiram 87 e 94%, respectivamente. O método HSHE tem as vantagens de alta eficiência, condições de operação suaves, baixos níveis de consumo, equipamento simples, fácil operação e baixo custo. Esta pesquisa fornece um novo método para a extração industrial de PhGs de C. tubulosa.