O embaralhamento da frequência optogenética das oscilações teta do hipocampo dissocia a recuperação da memória de trabalho dos códigos espaçotemporais do hipocampo, parte 3

A estimulação optogenética dos neurônios MS leva à sincronia teta não fisiológica

Surpreendentemente, estimulações optogenéticas de 8 Hz associadas à estimulação das oscilações teta levaram à diminuição do desempenho quando aplicadas durante a codificação ou recuperação da memória episódica na tarefa NPOR, bem como recuperação da memória de trabalho espacial na tarefa DNMTS. Para entender melhor os efeitos da estimulação teta na fisiologia do hipocampo, analisamos o bloqueio de fase da oscilação teta antes e durante as estimulações optogenéticas de 8 Hz (Fig. Complementar 7a) e descobrimos que tal estimulação levou ao aumento da sincronia de fase entre as épocas de estimulação (Fig. Complementar 7b). Além disso, analisamos a correlação cruzada das oscilações teta através do CA1 dorsal (~ 1 mm de distância entre os eletrodos ao longo do eixo septotemporal (Fig. Complementar 7c) e descobrimos que a estimulação dos ritmos teta a 8 Hz levou a um aumento da correlação cruzada entre esses dois eletrodos ( Figura Complementar 7d).

A genética é a ciência que estuda a herança e a variação genética, e a memória é um aspecto de grande preocupação. Então, o que a genética tem a ver com memória? Este artigo explorará questões relacionadas à memória de uma perspectiva genética.

Em primeiro lugar, sabemos que os genes genéticos são a base para o desenvolvimento físico e intelectual humano, e a superioridade desses genes afetará a memória das pessoas. As pesquisas mais recentes mostram que o QI e a memória das pessoas são afetados por fatores genéticos. A pesquisa mostra que os genes genéticos desempenham um papel crucial na inteligência e na memória. Portanto, algumas pessoas nascem com memórias mais fortes, enquanto outras precisam trabalhar muito e treinar para melhorar a memória.

Em segundo lugar, os factores ambientais também são factores importantes no desenvolvimento da memória. Não precisamos apenas do apoio dos genes genéticos, mas também de melhorar a nossa memória através de formação científica e de bons hábitos de vida. Por exemplo, podemos insistir em fazer exercício todos os dias, dormir o suficiente, seguir os princípios de adequação das refeições, etc., o que pode ajudar a melhorar a função cerebral e a memória.

Finalmente, as pessoas comuns não enfatizam demais a influência dos fatores genéticos no desenvolvimento da memória. Como os factores genéticos não são absolutos, a memória e a inteligência das pessoas ainda podem melhorar, melhorando os seus esforços e treino. Devemos sempre manter uma atitude de aprendizagem positiva e contínua e explorar e desenvolver constantemente o nosso potencial de memória. Acredito que só assim poderemos nos tornar mais inteligentes e ter um maior sentimento de realização. Resumindo, a relação entre genética e memória é muito estreita, mas não devemos enfatizar demasiado os factores genéticos, mas devemos melhorar constantemente a nossa memória e inteligência através do auto-aperfeiçoamento e do treino.

Percebe-se que precisamos melhorar nossa memória. Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória porque Cistanche deserticola é um material medicinal tradicional chinês com muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. A eficácia da carne picada vem dos vários ingredientes ativos que contém, incluindo ácidos, polissacarídeos, flavonóides, etc. Esses ingredientes podem promover a saúde do cérebro de várias maneiras.

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Discussão

Within the septohippocampal system, the exact causal relationships between (1) MS activity, (2) hippocampal oscillations, (3) hippocampal neuron activity, and (4) behavior, including memory, remain an active area of research. In particular, whether and how the MS supports encoding of place and time in the hippocampus, as well as its specific contribution to memory function, remain unclear. Here, we leveraged more recent techniques that allowed us to record >1000 neurônios enquanto realiza estimulação optogenética de neurônios MS com resolução inferior a um segundo para controlar ritmos teta e avaliar seu papel na fisiologia e memória do hipocampo. É importante ressaltar que, usando uma opsina excitatória e estímulos embaralhados ou de 8 Hz, fomos capazes de abolir ou estimular o teta do hipocampo de forma consistente e robusta, respectivamente.

Em comparação com a inibição da MS usando uma opsina inibitória ou compostos farmacológicos (por exemplo, muscimol), nossa abordagem permite uma comparação dentro do sujeito de dois estados opostos (teta estimulado vs abolido), enquanto mantém os níveis de atividade nas células MS-PV. Combinamos uma tarefa de rastreamento linear que, juntamente com abordagens teóricas da informação, nos permitiu desembaraçar códigos espaciais e temporais do hipocampo. Este método alivia a necessidade de limiares arbitrários, permitindo uma abordagem padronizada para análise de imagens de cálcio. Embora uma grande parte dos neurônios piramidais CA1 expressasse uma mistura de códigos espaço-temporais, concentramos nossas análises em neurônios ajustados especificamente ao local, tempo ou distância percorrida.

Embora a codificação espacial tenha sido extensivamente investigada em CA1, os códigos temporais e de distância ganharam recentemente mais interesse. Os códigos temporais28,35–37 e de distância37 foram extraídos por meio de fixação de pistas visuoespaciais ou extraídos analiticamente usando modelos lineares generalizados em paradigmas de realidade virtual26,27,38. Aqui, propomos uma abordagem para desembaraçar códigos espaciais, temporais e de distância usando uma abordagem teórica da informação que, juntamente com nossa tarefa de cuedalternação, permite a análise de códigos espaço-temporais e multiplexados do mundo real em animais em movimento livre. Uma grande quantidade de neurônios piramidais CA1 codifica informações multiplexadas de localização, distância e tempo, conforme relatado anteriormente, além de sinais de movimento próprio, como aceleração, velocidade e orientação60.

Descobrimos que o embaralhamento de frequência e as estimulações optogenéticas de 8 Hz aboliram drasticamente ou estimularam os ritmos teta, respectivamente, e levaram à diminuição da atividade geral em uma subpopulação de células piramidais CA1, embora não causassem mudanças significativas na atividade celular local, semelhante a relatórios anteriores usando inibição farmacológica , 46,47 ou estimulação optogenética9,48 de EM ou entradas septais para o hipocampo. Como os neurônios MS são conhecidos por serem os principais impulsionadores das oscilações do hipocampo, esperávamos que a estimulação MS estivesse associada à interrupção da atividade celular no tempo ou à distância em condições de ritmos teta reduzidos, mas nenhuma alteração ocorreu quando o teta foi abolido ou estimulado. Além disso, a estimulação das oscilações do hipocampo para 8 Hz não levou a alterações na qualidade dos códigos espaciais conforme relatado anteriormente e não alterou os códigos temporais conforme observado em nosso paradigma comportamental.

Embora tenha sido relatado que as células do tempo (mas não do local) poderiam depender diretamente das entradas do córtex entorrinal medial (MEC)61, evidências experimentais recentes sugerem que as lesões do MEC não levam a quaisquer alterações na fisiologia das células temporais do hipocampo62. Notavelmente, uma investigação mais recente descobriu que a estimulação optogenética do MS não interrompeu os códigos espaciais das células da grade no córtex entorrinal, sugerindo ainda que a atividade do MS não está diretamente envolvida nos códigos espaciais dentro da formação do hipocampo. Juntamente com os nossos resultados, isto indica que os códigos temporais podem ser o resultado de cálculos dependentes de MS dentro do córtex entorrinal63 (1) ou ser gerados intrinsecamente dentro do próprio hipocampo (2).

Embora estudos iniciais tenham descoberto que a EM desempenhou um papel essencial na manutenção das células do tempo e no apoio à memória de trabalho36, evidências experimentais recentes mostram que a contribuição exata das células do tempo para o desempenho da memória de trabalho pode ser menor do que se pensava anteriormente62. Como os neurônios MS-PV provavelmente mantêm níveis de atividade significativos durante a estimulação optogenética de alteração de frequência (em contraste com as abordagens de inibição), nossos resultados apoiam fortemente o papel da atividade septal precisamente cronometrada no apoio à memória de trabalho, como hipotetizado anteriormente. Embora tenhamos observado redução no desempenho da memória ao usar a estimulação optogenética durante a recuperação, a estimulação durante a fase de codificação das tarefas DNMTS não foi associada à redução da memória na tarefa DNMTS. O ritmo das oscilações teta a 8 Hz durante a fase de codificação ou recuperação da tarefa NOPR levou a uma recuperação de memória prejudicada. Nossas análises eletrofisiológicas revelam ainda que tal estimulação fez com que regiões distantes do CA1 dorsal fossem arrastadas na mesma fase, com bloqueio de fase não fisiológico. Embora não tenhamos investigado diretamente a relação causal entre mudanças de fase e desempenho da memória, o tempo de pico e a precessão de fase também foram associados à função alterada da memória de trabalho, apesar de deixar a codificação do local intacta . Além disso, o bloqueio de fase dos neurônios piramidais às taoscilações já foi demonstrado ser um preditor do desempenho da memória .

Notavelmente, uma limitação da nossa abordagem para estabelecer propriedades de ajuste temporal e de distância é que ela requer quatro vezes mais amostragem do que uma trilha linear regular, o que aumenta as chances de fotodegradação ao adicionar condições de estimulação à linha do tempo experimental. Embora tenhamos descoberto que os códigos espaciais não foram afetados por estímulos optogenéticos na mesma sessão, hardware de imagem mais recente que inclui sensores com sensibilidade aumentada poderia ajudar a prevenir o fotobranqueamento e permitir sessões de gravação mais longas, amostrando assim células temporais e de distância junto com estímulos. Descobrimos também que o conjunto de neurônios que codificam significativa e especificamente apenas uma variável é pequeno em comparação com o número de neurônios conjuntivos, tornando os requisitos de amostragem para esses neurônios altamente específicos muito mais elevados.

Fornecemos evidências experimentais de que a manipulação do MS não altera a velocidade locomotora e que, inversamente, a velocidade locomotora dita a frequência teta. Embora os códigos de local e tempo tenham sido preservados durante nossas estimulações de EM, uma porção (~6%) das células foi diretamente modulada e poderia explicar os prejuízos de memória observados em nossos ensaios comportamentais. Foi relatado anteriormente que os interneurônios PV no hipocampo fazem parte de um microcircuito essencial na regulação da consolidação da memória , e nossas manipulações optogenéticas podem estar associadas ao silenciamento de uma porção dessas células. Além disso, embora não tenhamos observado mudanças nas bandas de frequência além de teta, não podemos excluir que o tempo de pico do neurônio piramidal CA1 possa ser drasticamente alterado ao embaralhar as oscilações teta, enquanto a estimulação de 8 Hz mostrou não resultar em aumento da atividade do hipocampo , o que poderia explicar os efeitos diferenciais de esses padrões de estimulação no desempenho da memória de trabalho. Os prejuízos de memória que observamos eram provavelmente não colinérgicos: em primeiro lugar, em nossos experimentos imuno-histológicos, não encontramos praticamente nenhuma expressão de ChrimsonR em neurônios ChAT da EM. Em segundo lugar, nossos estímulos optogenéticos não foram associados a alterações nas ondulações do hipocampo, enquanto relatórios anteriores indicam que a estimulação de Os neurônios ChAT estão associados à redução da frequência de ondulação . A transfecção ChrimsonR de neurônios MS VGLUT2 também é improvável, uma vez que a ativação desses neurônios está associada a um aumento direto na atividade locomotora 68, que não observamos.

Embora o arranjo temporal preciso das pontas piramidais CA1 possa explicar, pelo menos parcialmente, os efeitos da estimulação da MS na memória, mecanismos alternativos devem ser levados em consideração. Notavelmente, além do hipocampo e do córtex entorrinal, os neurônios PV da MS projetam-se para o córtex retroesplenial e podem ser responsáveis ​​por alguns dos prejuízos de memória aqui observados.

Em resumo, utilizando imagens de cálcio, optogenética e eletrofisiologia, descobrimos que os ritmos teta podem ser estimulados ou abolidos usando a estimulação do MS. Tal estimulação prejudicou a recuperação da memória episódica e de trabalho. Esses efeitos foram não colinérgicos e não interromperam a atividade de ondulação do hipocampo. Finalmente, embora uma pequena fração de neurônios do hipocampo respondesse diretamente à estimulação optogenética da EM, as células de lugar, tempo e distância não foram interrompidas pelas manipulações das oscilações teta. Juntos, esses resultados sugerem que, embora a entrada de MS no hipocampo desempenhe um papel essencial na memória, os códigos multiplexados nos neurônios piramidais CA1 podem não ser o substrato direto para tais funções.

Métodos

Animais

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animais da Universidade McGill e pelo Conselho Canadense de Cuidados Animais (protocolo 2015-7650). Um total de n=41 machos (n=20) e fêmeas (n=21) com 8–16 semanas de idade, camundongos B6;129P2 PV-Cre (Jackson Laboratory, RRID: IMSR{{ 10}}JAX:017320) foram usados ​​neste estudo. N=5 camundongos foram usados ​​para combinar optogenética com imagens de cálcio; n=3 camundongos foram implantados para exames de imagem de cálcio, optogenética e controles eletrofisiológicos; n=4 camundongos foram utilizados em estudos eletrofisiológicos; n=29 camundongos foram transfectados e implantados para ensaios comportamentais. Os ratos foram alojados individualmente em um ciclo claro/escuro de 12-h a 22 graus e 40% de umidade com comida e água à vontade. Todos os experimentos foram realizados durante a parte clara do ciclo claro/escuro.

Vetores virais adeno-associados

O vírus adeno-associado AAV5.CamKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene # 100834, obtido do Vector Core da Universidade da Pensilvânia) foi utilizado em todos os experimentos de imagem de cálcio. O vírus adeno-associado (AAV) do sorotipo dj (capsídeo híbrido criado a partir de oito sorotipos diferentes de AAV) AAVdj-hSyn-ChrimsonR-tdTomato foi obtido no Vector Core Facility da Oregon Health and Science University em Portland, Oregon. Embora ele seja um gene doméstico, não observamos transfecção em células colinérgicas (ver "Resultados" e Fig. 2b – e). Uma construção eYFP sem a sequência ChrimsonR foi usada como controle (denominado controle YFP neste manuscrito).

Procedimentos cirúrgicos

Os ratos foram anestesiados com isoflurano (5% de indução, 0 0,5-1% de manutenção) e colocados em uma estrutura estereotáxica (David Kopf Instruments). A temperatura corporal foi mantida com uma almofada térmica, os olhos foram hidratados com gel (Optixcare) e Carprofeno (10 ml/kg) foi administrado por via subcutânea. O crânio foi completamente limpo de todo tecido conjuntivo e pequenas craniotomias foram realizadas com broca dentária para posterior injeção ou implante.

Injeções virais. Todas as injeções virais foram realizadas utilizando uma pipeta de vidro conectada a um injetor Nanoject III (Drummond). 500 nl de AAVdjhSyn-ChrimsonR-tdTomato (ou controle eYFP) foram entregues no MS a uma taxa de 1 nL/s, nas seguintes coordenadas baseadas no atlas estereotáxico de camundongo de referência69 (distância de Bregma em mm): anteroposterior (AP) 0,85, mediolateral (ML) 0, dorsoventral (DV) −4,50 usando um ângulo de 5 graus no plano ML. Após a cirurgia, os animais foram monitorados até a recuperação.

Implante de fibra óptica. Duas semanas após a injeção, os ratos foram anestesiados para implantação seguindo o mesmo procedimento cirúrgico. Uma fibra óptica de 200 μm de diâmetro com ponteira cerâmica (Thorlabs) foi implantada nas mesmas coordenadas. Os implantes foram cimentados no local usando C&B-Metabond® (Patterson dental). Esmalte preto foi aplicado sobre o cimento dentário para bloquear a emissão de luz durante a estimulação optogenética.

Implantes de eletrodos. Um conjunto de 7 microeletrodos de tungstênio (~ 1 MΩimpedância) foi abaixado no CA1 dorsal, abrangendo estrato piramidal (pyr), estrato radiatum (rad) e estrato lacunosummoleculare (lm). Parafusos colocados no osso acima do córtex frontal e do cerebelo serviram como base e referência, respectivamente. Após a colocação do eletrodo, do aterramento e da referência, foi aplicado cimento dentário para fixar o implante permanentemente ao crânio.

Implante para imagem de cálcio. Injetamos o vírus AAV5.CamKII.GCaMP6f (200 nL a 1 nl s-1) no hipocampo CA1 usando as seguintes coordenadas: anteroposterior (AP) − 1,86 mm do bregma, mediolateral (ML) 1,5 mm, dorsoventral (VD) 1,5 mm. Duas semanas após a injeção, os ratos foram anestesiados com isoflurano e o crânio foi limpo. A<2 mm diameter craniotomy was performed in the skull above the injection site. An anchor screw was placed on the posterior plate above the cerebellum. The dura was removed, and the portion of the cortex above the injection site was aspirated using a vacuum pump until the corpus callosum was visible. These fiber bundles were then gently aspirated without applying pressure on the underlying hippocampus, and a 1.8 mm diameter gradient index (GRIN; Edmund Optics) lens was lowered at the following coordinates: AP − 1.86 mm from bregma, ML 1.5 mm, DV 1.2 mm. The GRIN lens was permanently attached to the skull using C&B-Metabond (Patterson Dental), and Kwik-Sil (World Precision Instruments) silicone adhesive was placed on the GRIN to protect it. Four weeks later, the silicone cap was removed and CA1 was imaged using a miniscope mounted with an aluminum base plate while mice were under light anesthesia (<0.5% isoflurane) to allow the visualization of cell activity. When a satisfying field of view was found (large neuronal assembly, visible landmarks), the base plate was cemented above the GRIN lens, the mini scope was removed, and a plastic cap was placed on the base plate to protect the GRIN lens.

Imagens simultâneas de cálcio e registros eletrofisiológicos. Para controlar os efeitos dos implantes GRIN no hipocampo teta, bem como a conversa cruzada entre o mini-scópio e as luzes de excitação optogenética, conectamos microeletrodos de tungstênio às lentes GRIN. Para isso, colocamos lentes GRIN horizontalmente sob um microscópio de baixa ampliação em um ambiente livre de poeira. Um microeletrodo de tungstênio foi colocado suavemente na borda superior da lente GRIN usando um micromanipulador. Usamos o diâmetro conhecido da lente GRIN como unidade de referência para estimar a protrusão desejada do eletrodo (~50 µm, avaliada digitalmente após tirar uma microfotografia da preparação) pelas nossas coordenadas de implantação planejadas. Pequenas quantidades (~50 µL) de supercola foram depositadas na borda superior da lente GRIN com o eletrodo no lugar e deixadas secar por ~10 min, antes de aplicar a próxima camada de cola. Cinco camadas finas foram usadas para manter o eletrodo preso à lente GRIN. Após a implantação desses conjuntos de eletrodos GRIN usando o protocolo descrito acima, os fios salientes foram suavemente dobrados e escondidos sob uma tampa protetora (1–1,5 cm de altura) recuperada da pêra de uma pipeta de sucção manual em substituição ao Kwik-Sil.

Procedimentos comportamentais in vivo

Habituação. Os ratos foram manuseados suavemente por aproximadamente 5 minutos durante uma semana, com habituação progressiva ao procedimento de conexão (fibra óptica, miniscópio e amarras eletrofisiológicas pré-amplificadas). Os animais foram então programados para receber água (2 horas de acesso por dia).

Gravações em miniscópio. Os miniscópios (V3) foram montados usando instruções de código aberto (miniscope.org). Os dados de imagem foram adquiridos usando um sensor de imagem CMOS (Aptina, MT9V032) e multiplexados através de um cabo coaxial leve. Os dados foram adquiridos usando uma caixa de aquisição de dados (DAQ) conectada através de um controlador host USB (Cypress, CYUSB3013). O comportamento animal foi registrado usando uma webcam de consumo (Logitech) montada acima do ambiente. Os dados de cálcio e comportamentais foram registrados usando miniscope.org, software de aquisição personalizada DAQ de origem. O DAQ adquiriu simultaneamente fluxos de imagens comportamentais e celulares a 30 Hz como arquivos.avi não compactados de 1.000 quadros para sessões de gravação de 15-minutos, juntamente com carimbos de data e hora correspondentes para permitir o alinhamento temporal preciso de dados de imagens comportamentais e de cálcio.

Gravações eletrofisiológicas in vivo. Após 1 semana de recuperação pós-cirúrgica e uma semana de habituação à configuração de amarração, foi registrada a LFP de camundongos implantados. Todos os sinais registrados dos eletrodos implantados foram amplificados pelo pré-amplificador Tether antes de serem digitalizados a 22 kHz usando um sistema de gravação digital (Neuralynx, EUA). As gravações de cada sinal de canal foram salvas juntamente com gravações de vídeo e sinais TTL do Diodo Laser para análise posterior.

Estimulação optogenética. A estimulação a laser foi aplicada através de um cabo de fibra óptica (200 μm de diâmetro) usando uma fonte de luz de fibra de diodo laser (Doric Lenses). A intensidade da luz foi calibrada e o comprimento de onda corrigido usando o Power Meter Bundle com o PM100D Console e o S130C Slim Photodiode Sensorlight (Thorlabs). Cada estimulação de estimulação (incluindo 8 Hz) foi realizada usando pulsos quadrados de 5 ms. Para aplicar a estimulação luminosa embaralhada, utilizamos um microcontrolador Arduino para gerar um sinal de oscilação de ruído branco alimentado diretamente na entrada analógica do driver de diodo laser. Para realizar a estimulação de frequência selecionada aleatoriamente, usamos um protocolo padrão de 5 s ON, 5 s OFF, mas para cada época de estimulação, usamos um microcontrolador Arduino para selecionar aleatoriamente uma frequência de estimulação na banda teta. Ao aplicar estimulação optogenética durante o comportamento, um pedaço solto de tubo termorretrátil foi colocado ao redor da junção entre o patchcord e o implante da ponteira do rato para limitar a emissão de luz visível. As intensidades de luz são expressas como potência nominal, medida na ponta do conjunto implante-cordão de fibra óptica (antes da colocação cirúrgica) e corrigidas para o comprimento de onda apropriado.

Ensaios comportamentais

Trilha linear de tom sequencial. Os ratos estavam programados para beber água e só podiam ter acesso à água durante 2 horas por dia, das 18h às 20h. Para desembaraçar os códigos espaciais, temporais e de distância, construímos uma pista linear de 134 cm de comprimento usando tijolos Lego® cinza médio, que permite modificações e implementações fáceis sem o necessidade de modificar permanentemente a estrutura do labirinto. Sensores piroelétricos foram colocados em cada extremidade da pista linear e conectados a um microcontrolador Arduino. Cada detecção acionou um novo tom em sequência, indicando o progresso na entrega da recompensa. Os seguintes tons foram usados ​​​​e emitidos usando alto-falante apiezo: bipes de 1 s a 2.000 Hz, bipes de 250 ms a 3.000 Hz e um tom contínuo a 4.000 Hz. Quando o último tom contínuo foi acionado, uma recompensa (10% de sacarose em água) foi entregue no início da trilha linear na tampa de um tubo Falcon de 15 mL. Mudanças na direção de corrida antes de acionar o próximo tom foram consideradas erros e não acionaram a entrega da recompensa. O desempenho foi medido como o número de tentativas corretas (sem erros) dividido pelo número total de tentativas.

Novo reconhecimento de local de objeto. No primeiro dia, os ratos foram autorizados a explorar livremente um campo aberto cinza escuro de 45 x 45 cm que continha sinais visuais (grandes grades brancas horizontais e verticais) em suas paredes por 10 min. No segundo dia, dois objetos idênticos (base da mão amiga) foram apresentados durante 10 min. No terceiro dia, os ratos puderam explorar o mesmo campo aberto enquanto a localização de um dos dois objetos era deslocada. Para controlar possíveis vieses de preferência espacial, tanto a posição inicial quanto a posição deslocada dos objetos foram randomizadas. Os ratos atribuíram uma ordem de teste aleatória que foi mantida idêntica durante os três dias de teste. O comportamento foi registrado com uma câmera de vídeo (Logitech) e analisado off-line. A análise comportamental foi realizada cegamente ao genótipo e ao tratamento. As explorações de objetos foram definidas como épocas em que os ratos têm o nariz a 1 cm de um objeto. O RI foi calculado da seguinte forma:

Não correspondência atrasada automatizada com a tarefa de amostra. Os ratos foram agendados com água e treinados em um labirinto em T contínuo para uma tarefa atrasada e não compatível com a amostra. Resumidamente, cada ensaio foi dividido em duas fases: amostra e teste. Na fase de amostragem, um braço foi bloqueado e os ratos foram forçados a explorar o braço oposto, onde receberam 50 µL de água com sacarose a 10% como recompensa. Após completar a fase amostral, os camundongos foram submetidos a um atraso (10 s) no compartimento inicial. Então, durante a fase de teste, ambos os braços puderam ser explorados, mas apenas o braço oposto (inexplorado) foi iscado, de modo que os ratos tiveram que alternar locais entre as fases de amostra e teste. Os ratos foram submetidos a 10 tentativas (amostra + teste) por dia, durante 10 dias consecutivos, e a taxa de sucesso diária foi calculada como o número de tentativas corretas dividido pelo número total de tentativas.

Análises histológicas post-mortem

Após a conclusão dos testes comportamentais, os camundongos foram profundamente anestesiados com uma mistura de cetamina/xilazina/acepromazina (100, 16, 3 mg/kg, respectivamente, injeção intraperitoneal) e perfundidos transcardialmente com paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS. Os cérebros foram extraídos e pós-fixados durante a noite em PFA a 4 graus e subsequentemente lavados em PBS por mais 24 horas a 4 graus. Cérebros e seções foram crioprotegidos em uma solução de 30% de etilenoglicol, 30% de glicerol e 40% de PBS até serem usados. Cada cérebro foi então seccionado em 50 µm usando um vibratome: cada seção foi coletada sequencialmente em 4 tubos diferentes de 1,5 mL para permitir diferentes análises. (localização do eletrodo, imunohistoquímica).

Imunohistologia. Utilizando um tubo de secções cerebrais recolhidas (amostragem de 25%) para cada análise, as secções foram lavadas durante 3 x 5 min em PBS para remover a solução crioprotetora. As seções foram incubadas durante a noite com PGT (00,45% de gelatina e 00,25% de Triton em PBS) a 4 graus. Em seguida, as fatias foram incubadas com anticorpos primários: 1:200 de cabra anti-colina-acetil -transferase da Millipore ou IgG1 anti-PVmonoclonal de camundongo 1:500 da Sigma-Aldrich em PGT à temperatura ambiente por 48 h ou 2 h, respectivamente. Após lavagens de 10, 20 e 30 min, as seções foram então incubadas com anticorpos secundários [1:2000 burroanti-cabra acoplado com Alexa 488 ou 1:500 cabra anti-IgG1 de camundongo acoplado a Alexa 488 (Life Technologies)] em PGT para 45 minutos. Após lavagens de 10, 20 e 30 min em PBS, as seções foram então montadas em lâminas de vidro e cobertas permanentemente com meio de montagem Fluoromount que continha DAPI. Apenas camundongos com colocação de implantes confirmada histologicamente foram incluídos neste estudo. Para GRINlenses, a superfície da lente teve que ser<100 µm above stratum pyramidale, and GCaMP6f expression was validated using fluorescence microscopy. Electrophysiological implants had to include at least one microelectrode in CA1 stratum radiatum or stratum pyramidale. Finally, the tips of fiber optics had to be within 100 µm of the MS region, and proper construct expression was assessed using fluorescence microscopy.

Análise de dados

Except for analyses of SWRs and the explicit impact of locomotion on physiological recordings, electrophysiological and calcium imaging analyses were performed only on periods of locomotion (>2 cm s−1 in the open field; >5 cm s−1 na pista linear).

Rastreamento automatizado de comportamento. Para extrair informações sobre posição, velocidade e direção da cabeça dos camundongos, utilizamos o DeepLabCut70,71. Resumidamente, treinamos um modelo para detectar orelhas, nariz, corpo e base da cauda de ratos. A direção da cabeça foi estimada utilizando o ângulo entre cada orelha ou nariz e corpo, dependendo da disponibilidade de medidas. Os dados de localização foram interpolados para a frequência de amostragem de imagens de cálcio usando interpolação linear. A velocidade foi extraída calculando Δd/Δt onde d é a distância e t tempo e posteriormente suavizou o resultado aplicando um filtro gaussiano com sigma=33 ms para remover artefatos de detecção. Sinais de velocidade foram usados ​​para identificar períodos de atividade locomotora e calcular modulação de atividade locomotora de local, tempo e distância especificamente para esses períodos.

Análise de imagem de cálcio. A análise dos dados de imagens de cálcio foi realizada usando MATLAB 2020a e Python 3.8.4. As gravações de vídeo foram analisadas usando o pipeline Miniscope Analysis (https://github.com/etterguillaume/MiniscopeAnalysis). Resumidamente, a correção de movimento rígido (rotação e translação) foi aplicada usando NoRMCorre72, e os vídeos foram amostrados espacialmente (3×) antes da concatenação. Traços de cálcio foram extraídos usando CNMFe51 usando os seguintes parâmetros: gSig=3 pixels (largura do kernel gaussiano), gSiz=20 pixels (diâmetro aproximado do neurônio), modelo de fundo _='anel', algoritmo_espacial='hals', min_corr=0.8 (limite mínimo de correlação de pixels), min_PNR {{17 }} (limiar mínimo da relação pico-ruído).

Os traços de cálcio bruto foram filtrados para remover flutuações de alta frequência e binarizados: Resumidamente, os neurônios foram considerados ativos quando a amplitude do sinal de cálcio normalizado excedeu dois desvios padrão, e a derivada de primeira ordem estava acima de 0 (ver ref. 52 para detalhes adicionais na metodologia52). Para extrair neurônios ajustados a variáveis ​​específicas, localização, tempo e distância foram agrupados (localização: compartimentos de 3 cm; tempo: compartimentos de 1 s; distância: compartimentos de 3 cm). A partir de sinais binarizados, calculamos a probabilidade marginal de as células serem P Að Þ ativas que usamos como proxy para a atividade neuronal. Mais importante ainda, derivamos então a probabilidade de atividade ou a 'probabilidade de estar ativo dado o estado de uma variável' PA j Si usando variáveis ​​agrupadas:

onde M é o número total de estados comportamentais possíveis, e P(Si∩Aj) é a probabilidade conjunta do animal estar na posição I simultaneamente com o nível de atividade j (0 ou 1). Para avaliar a significância do valor MI obtido, geramos então 1000 substitutos embaralhados usando permutações circulares aleatórias. Escolhemos permutações circulares porque elas removem a relação temporal entre a atividade neuronal e o comportamento, ao mesmo tempo que preservam a estrutura temporal dos transientes de cálcio e, assim, levam a resultados mais conservadores (em oposição à randomização completa de cada ponto de dados, o que aumenta o valor de significância dos resultados). Como os substitutos embaralhados não eram sistematicamente distribuídos normalmente, usamos uma abordagem não paramétrica onde o valor p (pN) corresponde ao número de pontos de dados da distribuição embaralhada que é maior que os dados reais para cada compartimento, dividido pelo número de permutações52, 73.

Para determinar a modulação das células por estimulações optogenéticas, utilizamos uma abordagem semelhante, mas calculamos o IM entre a atividade neuronal e os sinais de estimulação binarizados (portanto tratados como um estado comportamental). O mesmo procedimento de embaralhamento circular foi então usado para extrair significância estatística.

where P(S|A) is the posterior probability distribution of states given neuronal activity. Using only epochs with velocity >5 cm s-1, um conjunto de dados de treinamento foi gerado usando 90% dos dados. Os 10% restantes dos dados foram usados ​​para testes. Um erro de decodificação foi calculado usando 50 substitutos inicializados e um conjunto de 160 células usando pontos de dados escolhidos aleatoriamente com substituição. Supõe-se que cada neurônio seja independente um do outro, o que na prática não é o caso e leva a maiores erros de reconstrução, mas diminui o tempo computacional. A probabilidade posterior da população foi derivada da seguinte equação:

Rastreando células ao longo de vários dias. Os neurônios foram rastreados durante vários dias usando CellReg74: https://github.com/zivlab/CellReg (v1.5.3). Resumidamente, as pegadas espaciais foram alinhadas usando alinhamento rígido para corrigir rotações e translações. Após o alinhamento, consideramos que os conjuntos de células candidatos eram o mesmo neurônio se sua distância máxima fosse<12 µm, and used the modeled spatial correlation threshold (usually in the range 0.6–0.8) to determine the identity of cell pairs across days. Finally, we assessed the stability of the spatial representation using pairwise field correlation (Pearson correlation of tuning curves).

Análise eletrofisiológica. A análise dos dados eletrofisiológicos foi realizada utilizando o MATLAB 2020a utilizando tanto o processamento de sinais quanto a caixa de ferramentas wavelet. A convolução wavelet foi aplicada a sinais LFP usando wavelets Morlet complexas ('cmor1–1,5' no MATLAB) quando a precisão no domínio do tempo e da frequência era necessária. A convolução de Fourier da janela móvel (janela de 2 s na banda teta, janela de 5 s na banda gama, passos móveis de 10 ms) foi usada quando a precisão no domínio da frequência foi privilegiada em relação à precisão no domínio do tempo (por exemplo, frequência dominante no toplot ao estimular usando optogenética). A análise das densidades espectrais de potência foi realizada quando os ratos estavam correndo a 5 cm s-1 ou mais, a menos que descrito de outra forma.

Força de oscilação. OS foi calculado como a razão entre a densidade espectral de potência cumulativa em torno da frequência de oscilação de pico ± 1 Hz e a potência cumulativa da banda na banda teta (4–12 Hz). Esta métrica se torna 1 quando toda a densidade espectral de potência cai dentro da frequência de oscilação de pico (por exemplo, 8 Hz se estiver estimulando nessa frequência).

Detecção e análise de cabos de aço. Para monitorar SWRs, os ratos foram autorizados a explorar livremente um campo aberto por 10 min durante a gravação. As estimulações (embaralhadas ou 8 Hz) foram realizadas com paradigma 5 s ON, 5 s OFF. Apenas períodos de repouso tranquilo foram considerados para análise. Para este fim, calculamos a razão z-score da potência teta/delta após a filtragem para cada banda de frequência, realizando uma transformada de Hilbert, e apenas consideramos os períodos onde o valor resultante estava abaixo de 0. Para detectar SWRs, filtramos os sinais LFP no intervalo 150-250. Banda de frequência Hz e posteriormente pontuação z. As ondulações foram detectadas usando a função findpeaks no MATLAB, com os seguintes parâmetros: limite=4 sd,minpeakwidth=0 s, minpeakdistance=0,03 s.

Referências

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