Nanofibras de Ácido Oleanólico Estresse Oxidativo Induzido por Partículas Atenuadas em Queratinócitos

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Abstrato:O material particulado no ar (MP) é um dos indicadores de poluição do ar, sendo também o principal fator causador do estresse oxidativo na pele. O ácido oleanólico (OA), um composto terpenoide natural, inibiu efetivamente o envelhecimento cutâneo induzido por PM; no entanto, o OA tem baixa solubilidade em água e absorção pela pele, o que limita sua aplicação em medicamentos e cosméticos. O objetivo deste estudo foi preparar nanofibras de ácido oleanólico (OAnf) e avaliar os efeitos de OA e OAnf em queratinócitos tratados com PM. Os resultados mostraram que (OA dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) atenuou a superprodução de espécies reativas de oxigênio induzidas por PM, ativação de proteína quinase/Jun-amino-terminal quinase (SAPK/JNK) ativada por estresse, e as expressões de inflamação e pele -proteínas relacionadas ao envelhecimento. Além disso, o processo de nanofibra do OA melhorou efetivamente a solubilidade em água do OA em mais de 99,000-vezes alterando suas propriedades físico-químicas, incluindo um aumento da área de superfície, redução do tamanho das partículas, transformação amorfa e formação de ligações de hidrogênio com excipientes. A capacidade de penetração na pele do OAnf foi consistentemente mais de 10-vezes maior do que a do OA. Além disso, quando dissolvido em PBS, OAnf apresentou atividades antioxidantes, anti-inflamatórias e antienvelhecimento superiores no PM -tratados queratinócitos do que OA. Em conclusão, nossos achados sugerem que OAnf pode ser uma formulação antioxidante tópica para atenuar problemas de pele causados ​​por PM.

Palavras-chave:partículas; ácido oleanólico; nalnofibra; antioxidante; anti-inflamatório; anti-envelhecimento

1. Introdução

A poluição do ar é hoje um problema de saúde pública em todo o mundo. Com o desenvolvimento da tecnologia, várias substâncias nocivas, incluindo gases, substâncias químicas, poluentes biológicos e partículas, acumulam-se na atmosfera e afetam gravemente a vida e a saúde das pessoas. O material particulado (PM), um indicador de poluentes atmosféricos, é uma combinação de vários compostos orgânicos, materiais biologicamente derivados e núcleos de carbono particulado[1]. O MP entra nos pulmões por inalação e entra na circulação sanguínea causando danos sistêmicos à saúde, como inflamação de órgãos e doenças cardiovasculares e respiratórias [2,3]. Além disso, o MP pode atravessar a barreira cutânea e acumular-se nos folículos pilosos e até penetrar na derme com contato repetido; portanto, a superexposição da pele ao PM tem sido associada ao envelhecimento extrínseco da pele, alterações na pigmentação, dermatite atópica, acne e psoríase [2,4]. O contato prolongado com PM induz a superprodução de espécies reativas de oxigênio (ROS) nos queratinócitos, o que desencadeia várias vias de sinalização, incluindo a via da apoptose, vias da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPKs) e inflamação. A expressão elevada de ciclooxigenase-2 (COX-2), fator de necrose tumoral (TNF-a) e interleucina-1 (IL-1) é comumente observada em queratinócitos expostos a Além disso, o PM também ativa as metaloproteinases de matriz (MMPs) e resulta na perda de elasticidade da pele e envelhecimento [5].

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Os produtos naturais têm sido usados ​​há muito tempo como ingredientes cosmecêuticos eficazes. O ácido oleano-lico (OA, 3 -hidroxioleano-12-en-28-ácido oico), um composto triterpenóide de cinco anéis, está amplamente presente em plantas, frutas e vegetais [6]. A OA é bem conhecida por seus efeitos protetores hepáticos, como redução do dano hepático agudo induzido por produtos químicos e fibrose/cirrose em doenças hepáticas crônicas [6,7]. Além disso, estudos anteriores revelaram que a OA possui efeitos antioxidantes, anticancerígenos, anti-inflamatórios, antidiabéticos e antimicrobianos [8]Kim et al. revelou que a OA pode diminuir a expressão de citocinas pró-inflamatórias (TNF-a,IL-6) e proteína do envelhecimento da pele (MP-1) em queratinócitos tratados com PM [9]. No entanto, as propriedades físico-químicas do AO dificultam sua dissolução em água, o que limita sua aplicação em medicamentos, alimentos e cosméticos.

Os projetos de formulação de entrega de drogas, como nanocarreadores baseados em polímeros, li. posomes e nanofibras são geralmente usados ​​para melhorar as propriedades físico-químicas dos ingredientes ativos. O encapsulamento de ingredientes ativos com excipientes nessas formulações farmacêuticas pode aumentar sua solubilidade em água e absorção pela pele e diminuir o potencial de toxicidade e irritação da pele. Dentre elas, as nanofibras são uma formulação nanodimensionada emergente, com grande área superficial, baixa densidade e alto volume de poros, já amplamente utilizadas na biomedicina, que podem reduzir o volume de fármacos orais, aumentar a estabilidade dos princípios ativos, controlar liberar, melhorar a biodisponibilidade e fabricar tecidos artificiais [10]. A eletrofiação é uma tecnologia comum usada para produzir nanofibras e é altamente compatível com a produção em massa [1]. Portanto, a preparação de nanofibras usando o processo de eletrofiação pode simultaneamente melhorar a biodisponibilidade. e eficiência de produção de um ingrediente ativo com baixa solubilidade em água. A polivinilpirrolidona (PVPK90) e a 2-hidroxipropil- -ciclodextrina (HPBCD) são compostos aprovados pela FDA para solubilizar e fornecer ingredientes farmacêuticos ativos hidrofóbicos em humanos.colesterol cistancheEstudos anteriores mostraram que nanofibras preparadas com HPBCD e PVPK90 melhoraram significativamente a solubilidade em água e a penetração na pele do resveratrol [12] e do óleo de plai [13]. Assim, o objetivo deste estudo foi usar PVPK90 e HPBCD como transportadores de entrega para preparar as nanofibras de ácido oleanólico (OAnf) e avaliar os efeitos de OA e OAnf em queratinócitos tratados com PM.

Cistanche pode anti-envelhecimento

O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito biológico do AO dissolvido em DMSO na lesão de queratinócitos induzida por PM. Para superar a baixa solubilidade em água do OA, usamos PVPK90 e HPBCD como transportadores de entrega para preparar nanofibras de ácido oleanólico (OAnf) por um processo de eletrofiação e, em seguida, determinamos as mudanças de propriedades físico-químicas entre OA bruto e OAnf para elucidar a melhoria da solubilidade em água e penetração na pele. Para comparar o efeito biológico após o processo de nanofibra de OA, um modelo de dano de queratinócitos induzido por PM foi usado para avaliar a atividade antioxidante, anti-inflamatória e antienvelhecimento de OAnf e OA.

2. Materiais e métodos

2.1.Materiais

O hidrato de ácido oleanólico (OA) foi adquirido da Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd. (Tóquio, Japão). A polivinilpirrolidona (Luviskol" K90 Powder, PVP) foi adquirida de Wei Ming Pharmaceutical Mfg. Co., Ltd. Taipei, Taiwan). Hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HPBCD) foi obtida de Zibo Qianhui (Zibo, China). Metanol e dimetil sulfóxido (DMSO) foram adquiridos da Aencore Chemical (Surrey Hills, Austrália) Todos os produtos químicos ou reagentes para culturas celulares eram de grau biológico, e outros produtos químicos de determinação físico-química eram de grau de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

2.2. Ensaio de Viabilidade Celular

A determinação da viabilidade celular de um ingrediente ativo é um método comum usado para escolher as faixas de concentração adequadas para ingredientes ativos para avaliar sua atividade biológica. Os queratinócitos HaCaT foram adquiridos do Istituto Zooprofilattico Sperimen-tale della Lombardia edell'Emilia Romagna (Brescia, Itália). As células HaCaT foram cultivadas em DMEM (Himedia Laboratories, Mumbai, Índia) contendo 10 por cento de soro fetal bovino (Hazelton Product, Denver, PA, EUA) com 1 por cento de penicilina-estreptomicina (Biological Industries, Connecticut, NE , EUA), e as células HaCaT foram incubadas em uma incubadora (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) com as condições estabelecidas em 37 graus com 5 por cento de COz. Para a preparação das amostras teste, OA e OAnf foram dissolvidos em DMSO e PBS, respectivamente, e então cada amostra foi diluída em DMEM sem soro fetal bovino para determinação da viabilidade celular. As células HaCaT foram semeadas em 96-placas de poço a uma densidade de 1 × 104 células/100 μL/poço por 24h. O meio de cultura foi então removido e as células foram tratadas com diferentes concentrações de OA e OAnf variando de 5 a 80 uM em DMEM sem soro por 24 h. No momento do ensaio, o meio de tratamento foi removido e 150 μL de 0,5 mg/mL de solução de MTT foram adicionados em cada poço. Após 3 h de incubação, a solução de MTT foi removida e os cristais roxos de formazan de cada poço foram dissolvidos em 100 uL de DMSO. A absorbância a 550 nm de cada poço foi então medida usando um espectrofotômetro de microplaca (BioTek uQuant, Winoski, VT, EUA). A viabilidade celular foi calculada pela seguinte fórmula:

2.3.Determinação do teor de espécies reativas de oxigênio (ROS)

PM (Material de Referência Padrão, SRMB1649b) foram adquiridos do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia. Este produto foi coletado em 1976 e 197 em Washington, DC Feito. Um total de 10 mg/mL de PM foi suspenso em PBS e então sonicado por 10 min antes do uso. Um total de 1 × 10 mais queratinócitos HaCaT foram cultivados em 96-placas de poços por 24 h sob condições de 37 graus e 5 por cento de CO2. As células foram tratadas com diferentes concentrações de OA em DMSO, OA em PBS e OAnf em PBS por 24h, respectivamente. Em seguida, eles foram incubados com solução de diacetato de diclorodihidrofluoresceína 20 uM (DCFH-DA; Sigma, Tóquio, Japão) por 30 min. Em seguida, 50 ug/cm² PM foram adicionados em cada poço e incubados por 1 h. Depois disso, as células foram lavadas duas vezes com PBS, e a intensidade de fluorescência de cada amostra foi analisada usando o leitor de placas fluorescentes (excitação: 485 nm; emissão: 528 nm) (BioTek, Winooski, VI, EUA). A seguinte equação foi usada para calcular a porcentagem de inibição de Produção de ROS:

2.4. Análise Western Blot

Um total de 4 × 105 queratinócitos HaCaT foram cultivados em placas de 6-poços por 24h. As células foram então tratadas com OA ou OAnf em meio sem soro por 24h seguido da adição de PM. Após vários pontos de tempo, as células foram lisadas com tampão de RIPAlysis (Merck Millipore, Burlington, MA, EUA), depois centrifugadas a 12,000 rpm por 10 min. Um kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) foi usado para determinar a concentração de proteína. Em seguida, as proteínas foram separadas por eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e depois transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Merck Millipore). As membranas foram bloqueadas por 1 h e lavadas com solução salina tamponada com Tris( TBS) com 1 por cento de Tween-20. As membranas foram incubadas com anticorpos primários a 4 graus durante a noite. Os anticorpos primários usados ​​neste estudo incluíram ciclooxigenase-2 (COX-2), metaloproteinase de matriz-9 (MMP-9), inibidor tecidual de metaloproteínase-1 (TIMP-1), proteína quinase ativada por estresse/Jun-amino-terminal quinase (SAPK/JNK)(Cell Signaling Technology, Danvers,MA, EUA),GAPDH(Santa Cruz Biotecnologia, Dallas,TX, EUA), metaloproteinase de matriz-1 (MMP-1) (Proteintech Group, Rosemont, IL, EUA), p380, proteínas quinases reguladas extracelulares (ERK) e fator nuclear kappa-cadeia leve- potenciador de células B ativadas (NF-kB) (Merck Millipore, Burlington, MA, EUA). Em seguida, os anticorpos secundários foram adicionados por 1 h à temperatura ambiente e reagiram com reagentes de quimilu-minescência aprimorados (ECL; Thermo Fisher Scientific). Anticorpos contra GAPDH foram usados ​​como controles internos. A expressão de cada proteína foi analisada usando um Touch Imager (e-BLOT; Shanghai, China), e a expressão foi quantificada usando ImageJ.

2.5. Preparação de Nanofibras de Ácido Oleanólico (OAnf)

Os OAnfs foram eletrofiados com diferentes proporções de OA:PVP:HBPCD (1:8:5,1:8:10 e 1:8:20). A solução eletrofiada foi preparada como se segue: 25 mg de OA foram dissolvidos em 5 mL de metanol, e HPBCD foi adicionado e agitado com um agitador magnético para obter uma solução límpida; em seguida, adicionou-se imediatamente PVPK90 e agitou-se a mistura durante 1 h.efeitos colaterais do cistanche deserticolaAs nanofibras foram tecidas usando equipamento de eletrofiação FES-COS (Falco Tech Enterprise Co., Taipei, Taiwan) nas seguintes condições: uma seringa de 10 mL com uma agulha de diâmetro interno de 0. 22 mm foi empregado para eletrofiação; a taxa de fluxo foi ajustada para 0,2 mL/h; a tensão aplicada foi fixada em 12 KV; a distância ponta-coletor foi de 10 cm. Após o processo de eletrofiação, as nanofibras foram coletadas usando papel alumínio. As nanofibras recém-sintetizadas foram colocadas em um saco plástico selado e armazenadas em um recipiente à prova de umidade.

2.6. Análise de Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) de Ácido Oleanólico

O sistema de análise HPLC (LaChrom Elite L{{0}}, Hitachi, Tóquio, Japão) consistia em uma bomba L-2130, um amostrador automático L-2200 e um L{{3 }} detector ultravioleta-visível (UV-vis). A coluna de análise foi uma coluna Mightysil RP-18 GP (250×4,6 mm id.,5 um). A fase móvel foi composta por metanol e solução de ácido acético glacial a 0,1 por cento em uma razão fixa (95:5; p/v). A taxa de fluxo da fase móvel foi de 1 mL/min, e o comprimento de onda de detecção do detector UV foi ajustado em 215 nm. O pico de absorção do ácido oleanólico apareceu em 7,5 min. A curva de calibração do ácido oleanólico apresentou um bom linear （r =0.999） dentro do intervalo de 0,01-100 ug/mL.

2.7. Morfologia, Diâmetro da Fibra e Medição do Tamanho da Partícula de OAnf

Diferentes amostras de nanofibras foram plaqueadas com platina com um revestidor de íons (E{{0}}, HITACH, Tóquio, Japão); a condição foi fixada em 10 mA 120 s depois. A morfologia e a forma de cada amostra foram observadas por um microscópio eletrônico de varredura (Hitachi S4700 Hitachi, Tóquio, Japão). O diâmetro de cada amostra foi calculado pelo software image j. Um analisador Zetasizer 3000HS (Malvern, Worcestershire, Reino Unido) foi usado para medir o tamanho de partícula de OAnf. O tamanho de partícula de OA e OAnf foi medido em uma concentração de 1 mg/mL e 0,1 mg/mL, respectivamente.dosagem de cistache redditAlém disso, também observamos a uniformidade da morfologia do OAnf após dissolução em água usando um microscópio eletrônico de transmissão (instrumento TEM,JEM{{0}}EXII,JEOL Co., Tóquio, Japão). A amostra de teste foi ajustada para 1 µg/mL de OA em água desionizada e então gotejada na malha de cobre, e então 0,5 por cento (p/v) de ácido fosfotúngstico foi imediatamente gotejado. Após a secagem, cada amostra foi colocada no TEM para observação.

2.8. Carregamento de Medicamentos e Eficiência de Encapsulamento de OAnf

É muito importante determinar a carga do fármaco e a eficiência de encapsulamento do sistema de entrega para avaliar o desempenho do processo farmacêutico. A carga de droga foi calculada como a porcentagem do teor determinado e o teor teórico do OA contido nas nanofibras de OA. Para determinação de carga de droga, 100 μL de cada amostra foram adicionados a 900 μL de metanol, e a concentração de OA era onde CoA é a concentração de OA de OAnf, WoA é a quantidade teórica de OA adicionada, VoAnf é o volume de solução de OAnf.

A eficiência de encapsulamento indica se as nanofibras encapsularam com sucesso os compostos ativos. As amostras de OAnf foram dissolvidas em água deionizada e adicionadas aos dispositivos de filtro centrífugo (Microcon YM-10,Millipore, Billerica,MA, USA) e depois centrifugadas a 12,00 rpm por 10 min por a centrífuga refrigerada (Centrifuge 5430R, Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). A parte encapsulada foi retida no tubo superior e a parte não encapsulada foi recolhida do tubo inferior devido à diferença de peso molecular. A quantidade de OA não encapsulado foi detectada pelo método HPLC acima mencionado. A seguinte equação foi usada para calcular a eficiência de encapsulamento:

onde AoA é a quantidade teórica de OA (obtida da condição de alimentação) incorporada nas nanofibras e OA Aunentrapped é a quantidade de OA não encapsulado.

2.9. Solubilidade aquosa de OAnf

OA bruto (1 mg) e formulações de diferentes proporções de OAnf (contendo um equivalente de 1 mg de ácido oleanólico) foram dissolvidos em 1 mL de água desionizada, respectivamente, e então sonicados sob um ultrassônico (Branson 5510, Emerson Electric, St. Louis, MO, EUA) por 20 min. Cada amostra foi filtrada através de uma membrana de 0,45 um (Pall Corporation, Washington, NY, EUA) e diluída 10- vezes. As soluções diluídas foram analisadas por HPLC, e a curva padrão foi empregada para determinar a quantidade de ácido oleanólico para comparar sua solubilidade aquosa.

2.10. Determinação da transformação cristalina para amorfa

A difratometria de raios X (Siemens D500, Karlsruhe, Alemanha) foi usada para analisar a forma cristalina do OA, excipientes e OAnf. A análise foi realizada utilizando radiação Cu-Ka filtrada com níquel, utilizando voltagem de 40 kV e corrente de 25 mA. A taxa de varredura foi de 1 grau/min, e a faixa dos ângulos escaneados foi de 5 graus a 50 graus. 2.11. Interação Intermolecular entre OA e Excipientes

A espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e a ressonância magnética nuclear 1H (RMN 1H) são geralmente usadas para confirmar a interação intermolecular entre ingredientes ativos e excipientes. Ácido oleanólico, PVP, HPBCD e formulações de diferentes proporções de OAnf foram, respectivamente, misturados com brometo de potássio (KBr) em uma proporção de volume de 1:9 usando um almofariz e prensados ​​em comprimidos. Cada amostra foi então analisada pelo espectrofotômetro FTIR (espectrofotômetro Perkin-Elmer 200, Perkin-Elmer, Norwalk, CT USA). O alcance de varredura foi de 400-4000 cm-4. Além disso, , cada amostra foi dissolvida em 0,8 mL de DMSO-dg a 99,8 por cento (Merck, St.Louis, MO, EUA) e analisada pelo espectrômetro JEOL Alpha 400 (Nihon Denshi Co., Tóquio, Japão).

2.12. Penetração na Pele Ex Vivo de Ácido Oleanólico e Sua Nanofibra

Este experimento foi realizado de acordo com o protocolo padrão das diretrizes da European Cosmetic Toiletry and Perfumery Association (COLIPA). O sistema de células de difusão Franz pode ser dividido em recipientes de vidro da câmara doadora superior e da câmara receptora inferior. Um total de 1,5 mL de solução tampão compreendendo 0.14MNaCl,2mMK-HPO4, 0.4 mM KH2PO4 (pH7,4) foi colocado na câmara receptora e agitado com uma barra magnética a 600 rpm durante todo o experimento. Pele fresca de flanco de porco foi obtida de um açougue local no mercado e refrigerada durante o período do experimento. Cada amostra de pele foi cortada em pedaços de 2 cm × 2 cm e colocada entre as duas câmaras, com o estrato córneo voltado para cima. A célula de difusão de Franz foi mantida a 32 graus com um banho de água circulante.benefícios do extrato de cistacheEm seguida, 200 μL de 1 mg/mL de OA ou OAnf foram adicionados à câmara doadora por 1,2 ou 4 h. Em seguida, a pele de porco foi removida da célula de difusão de Franz e o estrato córneo foi obtido por stripping 15 vezes. Cada amostra de pele residual foi aquecida a 95 graus com uma almofada de calor, e a epiderme e a derme foram separadas usando um bisturi. Cada amostra foi imersa em metanol e sonicada por 1h para extrair OA, e o teor de ácido oleanólico em cada amostra foi determinado pelo método de HPLC. 2.13. Análise estatística

Todos os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (DP). A significância estatística entre os diferentes grupos foi analisada por análise de variância (ANOVA) com teste post hoc de Tukey.p<0.05 indicated="" statistical="" significance.="">

3.1. O ácido oleanólico pode suprimir a inflamação, o envelhecimento e as vias de sinalização de ROS/MAPKs em danos de queratinócitos induzidos por PM

Para encontrar a faixa de concentração adequada para avaliação da atividade biológica, a citotoxicidade de OA dissolvido em DMSO foi determinada em células de queratinócitos humanos HaCaT usando um ensaio MTT. Conforme mostrado na Figura 1A, 40 e 80 μM de OA foram associados a 32 a 16 por cento de viabilidade celular. OA em menos de 20 μM ainda tinha uma taxa de sobrevivência celular superior a 85 por cento. Esses resultados indicaram que OA em uma concentração de 5-20 μM não tem efeitos citotóxicos em queratinócitos humanos HaCaT (Figura 1A). Assim, OA foi estudado em uma concentração de 5-20 uM para investigar sua atividade antioxidante e antipoluição em danos aos queratinócitos induzidos por PM. Recentemente, muitos estudos demonstraram que o PM é um poluente do ar comum que causa superprodução de ROS e danos subsequentes no sistema da pele por meio de uma série de estresse oxidativo, incluindo peroxidação lipídica, carbonilação de proteínas e mutação de DNA [14-16]Como mostrado em Figura 1B, o tratamento com PM aumentou significativamente a produção de ROS quando comparado com o grupo não tratado (p<0.05).in contrast,="" pretreatment="" with="" oa="" effectively="" decreased="" pm-induced="" ros="" overproduction="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05).there-fore, these="" results="" suggested="" that="" oa="" possessed="" antioxidant="" activity="" to="" prevent="" pm-induced="" oxidative="" stress="" by="" reducing="" the="" ros="" overproduction.="" in="" addition,="" ros="" overproduction="" after="" pm="" exposure="" can="" activate="" the="" phosphorylation="" of="" mapks="" proteins,="" including="" p-erk,="" p-p38,="" and="" p-jnk,="" triggering="" the="" protein="" expressions="" of="" inflammation="" and="" aging[17,18]the="" present="" study="" also="" found="" that="" pm="" treatment="" can="" increase="" the="" expression="" of="" inflam-matory="" proteins="" (cox-2="" and="" nf-kb),skin="" aging-related="" proteins="" (mp-1,mmp-9="" and="" timp-1),and="" phosphorylation="" of="" erk,jnk,="" and="" p38=""><0.05). our="" present="" results="" also="" demonstrated="" that="" oa="" at="" 10="" and="" 20="" um="" significantly="" inhibited="" the="" protein="" expression="" of="" nf-kb="" and="" cox-2="" when="" compared="" with="" the="" pm="" treatment="" group="" (p=""><0.05)(figure 1c)furthermore,="" oa="" pretreatment="" also="" effectively="" reversed="" pm-induced="" alteration="" on="" mmp-1="" and="" timp-1="" expression=""><0.05) but="" had="" no="" effect="" on="" mmp-9(figure="" 1d).="" we="" further="" de-termined="" the="" effects="" of="" oa="" treatment="" on="" phosphorylation="" of="" mapks="" during="" pm="" exposure,="" and="" our="" results="" indicated="" that="" oa="" could="" inhibit="" the="" phosphorylation="" of="" jnk=""><05), but="" had="" no="" effect="" on="" erk="" or="" p38="" (figure="" 1e).="" according="" to="" the="" above="" results,="" when="" dissolved="" in="" dmso,="" oa="" displayed="" good="" skin-protective="" activity="" and="" could="" ameliorate="" pm-induced="" ros="" overproduction,="" jnk="" activation,="" and="" inflammatory="" and="" skin-aging="" protein="" expression="" in="">

3.2. As nanofibras de ácido oleanólico aumentam a solubilidade em água e a penetração na pele do ácido oleanólico bruto, melhorando as propriedades físico-químicas

3.2.1. Morfologia de Superfície do Ácido Oleanólico e Suas Nanofibras

Sob observação SEM, a aparência de HPBCD apresentou um excipiente esférico e poroso, e seu tamanho era de cerca de 20 a 50 μm (Figura 2A). PVPK90 é um excipiente com partículas poligonais irregulares e um tamanho de partícula de mais de 60 um (Figura 2B) .O ácido oleanólico bruto é um pó granular irregularmente redondo com um tamanho de 3-60 um. A Figura 2D-F mostra o diâmetro médio da fibra de diferentes proporções em peso de ácido oleanólico: HPBCD:PVPK90 foram 174,83±19,53nm, 219,23±18,93nm e 403,17±32,99nm, respectivamente. Verificou-se que uma maior proporção de HPBCD(18 :20) levou a OAnf a ter um diâmetro de fibra maior (Tabela 1).

3.2.2. Tamanho de Partícula e Morfologia de OAnf Reconstituído em Água

Para observar a forma e o tamanho das partículas do OAnf (OA:PVP:HPBCD, 1:8:20) dissolvido em água, a imagem do OAnf sob o microscópio eletrônico de transmissão (TEM) mostrou que as partículas de ácido oleanólico eram esféricas e uniformemente dispersas em água (Figura 3). O tamanho de partícula também foi confirmado por um analisador de tamanho de partícula a laser (Tabela 2). Os tamanhos de partículas de OA e OAnf foram 5079,50±384,87 nm e 302,37±11,91 nm, respectivamente. Os índices de polidispersidade (PDI) de OA e OAnf foram 1,63±0,21 e 0,32±0,02, respectivamente. Esses resultados indicam que o processo de eletrofiação reduziu efetivamente o tamanho das partículas de OA com distribuição uniforme de partículas e resultou em aumento da área superficial.

3.2.3. Carregamento de Drogas, Eficiência de Encapsulamento e Solubilidade em Água de Nanofibras de Ácido Oleanólico

Conforme mostrado na Tabela 3, as porcentagens de carregamento de OA em diferentes proporções de excipientes foram 72,36±10,45 por cento, 84,23±3,62 por cento e 98,19±4,82 por cento, respectivamente. Os resultados indicaram que uma proporção mais alta de HPBCD exibiu um melhor efeito de carga do fármaco. A eficiência de encapsulamento de todas as formulações foi superior a 95 por cento, o que indicou que PVPK90 e HPBCD encapsularam efetivamente OA. e 998,7±58,32 ug/mL, respectivamente.cistanche genghis khanEstes resultados mostraram que o aumento de HPBCD na formulação melhorou dramaticamente a solubilidade em água do OA bruto. Por outro lado, a solubilidade em água do OA bruto não pôde ser determinada devido ao fato de estar abaixo do limite de detecção (0,01 ug/mL) no método HPLC. Este resultado indicou que o OAnf 1:8:20 teve uma melhoria de solubilidade em água mais de 1000-vezes quando comparado com OA bruto. Assim, nos estudos seguintes,18:20 OAnf foi usado para determinar a atividade biológica no modelo de dano de queratinócitos induzido por PM.

3.2.4. Alteração cristalina do ácido oleanólico e suas nanofibras

Os padrões de difração de raios-X (XRD) de OA bruto, excipientes e suas nanofibras são mostrados na Figura 4. OA bruto exibiu vários picos de difração característicos de alta intensidade em um ângulo de varredura de 5 graus -20 graus, indicando que OA bruto era um composto cristalino. Por outro lado, os padrões de difração de PVPK90 e HPBCD não possuem picos de difração característicos óbvios. OA foi transformado de cristalino para amorfo (Figura 4). De acordo com esses resultados, podemos concluir que o ácido oleanólico bruto foi encapsulado com sucesso em HPBCD e encapsulado por PVPK90 após o processo de nanofibra.

3.2.5. Formação de Ligações de Hidrogênio Intermoleculares entre Ácido Oleanólico e Excipientes

A interação intermolecular de OA bruto e HPBCD com PVPK90 foi determinada por espectroscopia FTIR, e os resultados são demonstrados na Figura 5. O espectro FTIR mostrou claramente a absorbância de vários grupos funcionais químicos de OA bruto, incluindo uma banda de absorção em 3463 cm{{ 3}} (—— vibração de estiramento OH), 1696 cm-1 (——C=vibração de estiramento O) e 1462 cm-l (— vibração de estiramento CHz)(Figura 5). Quando OA, PVPK90 e HPBCD foram complexados para formar nanofibras, a absorbância desses grupos funcionais químicos obviamente mudou para uma absorção mais baixa. Esses achados foram indicativos de interações de ligações de hidrogênio intermoleculares entre OA e HPBCD com PVPK90. Além disso, o presente estudo também usou 'H NMR para confirmar a interação intermolecular de OA e excipientes. O espectro de 1HNMR de OA bruto (Figura 6C) mostrou um sinal de carboxil a 812 ppm (H28), prótons de dupla ligação a 85,15 ppm (H12), sinal de hidroxi próton a 83,38 ppm (H3) e prótons metil (81 ppm). No entanto , o espectro de HNMR de nanofibras de OA mostrou que o sinal de carboxil de OA desapareceu e os deslocamentos químicos de prótons de dupla ligação, hidroxi e metil foram obviamente movidos para cima (Figura 6). Esses resultados demonstraram a formação de ligações de hidrogênio intermoleculares entre o AO e os excipientes, que apoiaram o encapsulamento bem-sucedido de AO por HPBCD e PVPK90.

3.2.6. Penetração cutânea in vitro de ácido oleanólico bruto e suas nanofibras

A atividade biológica de uma formulação tópica depende principalmente da absorção pela pele. As penetrações cutâneas do OA bruto e suas nanofibras foram determinadas em pele de porco ex vivo. Conforme mostrado na Figura 7, um teor mais baixo de OA（<5 μg/cm2）was="" detected="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" after="" 1,2,="" and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" and="" these="" results="" also="" indicated="" that="" raw="" oa="" could="" not="" penetrate="" the="" skin="" in="" a="" time-dependent="" manner.="" the="" result="" showed="" that="" the="" skin="" absorption="" of="" raw="" oa="" was="" extremely="" poor.="" by="" contrast,="" the="" nanofiber="" formulation="" dramatically="" increased="" the="" content="" of="" oa="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" with="" 19.63="" ug/cm2,31.56="" ug/cm2,and="" 45.27="" ug/cm2="" after="" 1,2,and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" respectively.="" these="" results="" demonstrated="" that="" the="" oanf="" formulation="" significantly="" increased="" skin="" absorption="" when="" compared="" with="" the="" raw="" oa="" topical="" administration=""><>

3.3. Nanofibras de ácido oleanólico em concentrações não citotóxicas tiveram melhor atividade antipoluente, melhorando a atividade antioxidante, anti-inflamatória e antienvelhecimento

Semelhante ao OA dissolvido em DMSO, o OAnf dissolvido em PBS a 40 uM e 80 uM reduziu a viabilidade de células HaCaT para 14,1 por cento e 5,6 por cento, respectivamente (Figura 8A). Portanto, 10 uM de OAnf foram avaliados para maior atividade antioxidante e antipoluição, a fim de entender se OA e suas nanofibras têm a capacidade de inibir a produção excessiva de ROS causada por PM. A Figura 8B mostra que OAnf a 10 uM reduziu notavelmente a superprodução de ROS induzida por PM. Também calculamos a taxa de inibição da produção de ROS para comparar a atividade antioxidante entre OA dissolvido em PBS e OAnf. Dez micromolar OA em PBS resultou em uma inibição de 28,3 por cento da produção de ROS, e OAnf alcançou 97,6 por cento de inibição (Figura 8B). Esses resultados indicaram que OAnf teve melhor atividade antioxidante do que OA em PBS no estresse oxidativo induzido por PM em queratinócitos. Além disso, também comparamos a atividade anti-inflamatória de danos aos queratinócitos induzidos por PM. O pré-tratamento com OA bruto em PBS não pode inibir a expressão de proteína induzida por PM de NF-KB e COX-2 Em contraste, o pré-tratamento com OAnf em PBS diminuiu significativamente a expressão de NF. kB e COX-2 em células tratadas com PM (p<0.05).these results="" supported="" that="" oanf="" in="" pbs="" had="" better="" anti-inflammatory="" activity="" than="" raw="" oa="" in="" pbs="" (figure="" 8c).then,="" we="" also="" compared="" their="" anti-skin-aging="" activity.="" pretreatment="" with="" oa="" in="" pbs="" had="" no="" effects="" on="" pm-induced="" mmp-1="" or="" timp-1="" alteration.="" however,="" oanf="" in="" pbs="" could="" reduce="" the="" expression="" of="" mmp-1="" and="" rescue="" the="" expression="" of="" timp-1="" when="" compared="" with="" the="" pm-induced="" keratinocytes="" damage="" group=""><0.05)(figure 8d).these="" findings="" indicated="" that="" oanf="" possessed="" better="" anti-skin-aging="" properties="" than="" raw="" oa="" in="" pbs.="" finally,="" we="" analyzed="" the="" phosphorylation="" of="" erk,="" jnk,="" and="" p38="" to="" confirm="" the="" regulation="" of="" mapks="" signaling.="" figure="" 8e="" showed="" that="" the="" treatment="" of="" raw="" oa="" in="" pbs="" could="" not="" downregulate="" pm-induced="" phosphorylation="" of="" these="" mapks="" protein.="" however,="" pretreatment="" with="" oanf="" only="" reduced="" pm-induced="" phospho-jnk="" (p-jnk)="" expression="" but="" had="" no="" effect="" on="" p-erk="" and="" p-p38="" (figure="" 8e).the="" percentage="" changes="" of="" protein="" expression="" induced="" by="" oa="" in="" dmso,="" oa="" in="" pbs,and="" oanf="" in="" pbs="" are="" summarized="" at="" table="" 4.="" oanf="" in="" pbs="" markedly="" reversed="" pm-induced="" protein="" alterations,="" which="" was="" barely="" observed="" in="" oa="" in="" the="" pbs="" group.="" in="" addition,="" the="" effects="" of="" oanf="" in="" pbs="" were="" comparable="" to="" the="" equivalent="" amount="" of="" oa="" in="" dmso,="" which="" indicated="" that="" the="" electrospinning="" process="" increased="" the="" water="" solubility="" of="" oa="" without="" altering="" its="" bioactivities.="" accordingly,="" oanf="" effectively="" inhibited="" the="" expressions="" of="" inflammatory="" proteins="" and="" skin-aging="" proteins="" and="" downregulated="" the="" mapks="" signaling="" pathway="" in="" pm-induced="" keratinocytes="">

4. Discussão

Recentemente, o monitoramento da concentração de material particulado no ar tornou-se um dos indicadores mais importantes utilizados para avaliar o índice de qualidade do ar. A pele é o maior órgão imunológico dos seres humanos, e a superexposição ao PM pode prejudicar as funções da pele. Jin et ai. revelaram que vários tipos de MP não apenas permaneceram no estrato córneo da epiderme, mas também penetraram no estrato espinhoso e nos folículos pilosos [14]. Se exposto a PIA excessivo por muito tempo, isso causará disfunção da barreira cutânea e está associado a muitas doenças de pele, como dermatite atópica, psoríase, acne e envelhecimento [19,20]. Dijkhoff et ai. ilustrou claramente que o PM pode desencadear a formação de EROs exógenas e endógenas, resultando na progressão do estresse oxidativo, incluindo peroxidação lipídica, oxidação de proteínas, disfunção mitocondrial, dano ao DNA, ativação da inflamação e aceleração do processo de envelhecimento [15]. Assim, neutralizar a superprodução de ROS induzida por PM é uma boa estratégia e a primeira escolha para evitar danos ao estresse oxidativo durante a superexposição a PM. Estudos anteriores também demonstraram que tratamentos antioxidantes, como difloretohidroxicarmalol [21], dieckol [22], extrato de Opuntia humifusa [23] e extrato de cereja azeda [24] podem efetivamente atenuar a disfunção de queratinócitos induzida por PM. Nossos resultados também descobriram que OA em DMSO pode reduzir a produção de ROS induzida por PM e prevenir os danos causados ​​​​pelo PM. Além disso, o NF-kB é um fator de transcrição ubíquo e induzível que regula a expressão de proteínas pró-inflamatórias, como a COX-2, que desempenha um papel crítico em muitas doenças de pele. Nossos resultados mencionaram que OA pode diminuir a ativação de NF-kB induzida por PM para inibir a expressão da proteína inflamatória COX-2[25]. Além disso, a ativação da sinalização de MAPKs pode aumentar a expressão de AP-1 e leva à regulação transcricional de MPs[18]. Neste estudo, a OA foi capaz de suprimir a expressão da proteína de envelhecimento da pele MP-1 e aumentar a expressão da proteína antienvelhecimento da pele TIMP-1 para prevenir o envelhecimento de queratinócitos induzido por PM. Nossos resultados também demonstraram que o OA inibiu efetivamente a fosforilação de JNK. Portanto, OA pode inibir a inflamação da pele induzida por PM e o envelhecimento pela regulação negativa da via de sinalização ROS/JNK em danos aos queratinócitos induzidos por PM.

Até onde sabemos, a baixa solubilidade em água dos compostos ativos está associada à baixa biodisponibilidade, o que limita sua aplicação nas indústrias de medicamentos, alimentos e cosméticos [26,27]. É bem conhecido que compostos com baixa solubilidade em água têm várias características físico-químicas comuns, como tamanho de partícula excessivamente grande, menor área de superfície, estrutura lipofílica e forma cristalina. Nossos resultados também indicaram que o OA bruto tinha essas propriedades físico-químicas, incluindo um tamanho de partícula grande (5079,50±384,87 nm), um pó granular irregular de 3-60 um com menor área de superfície (Figura 2C) e uma forma cristalina óbvia. Esses resultados indicaram que a solubilidade em água do OA foi inferior a 0,01 ug/mL e pode ser classificado como um composto ativo praticamente insolúvel de acordo com a classificação de solubilidade em água da Farmacopeia dos Estados Unidos (USP)[29]. Se esses inconvenientes não puderem ser resolvidos, as atividades da OA na pele seriam muito limitadas. O presente estudo usou com sucesso PVPK90 e HPBCD como transportadores usando um processo de eletrofiação para preparar OAnf. A melhoria da solubilidade em água é o principal índice usado para confirmar a formulação farmacêutica ideal, e nossos resultados demonstraram que OA:PVPK90:HPBCD em 1:8:20 teve a melhor solubilidade em água. OA dependendo da relação HPBCD. Da mesma forma, estudos anteriores também revelaram que uma proporção maior de ciclodextrina aumenta a capacidade de encapsulamento da formulação e resulta em um aumento significativo na solubilidade em água e na atividade biológica da curcumina [30], resvera-trol [12], timol [31] , e difenoconazol[32]. Além disso, o presente estudo também comparou as propriedades físico-químicas de OA bruto e suas nanofibras para elucidar os mecanismos de melhoria da solubilidade em água de nanofibras de OA.OA produzidos neste estudo foram todos os filamentos com um nano-tamanho uniforme. Os resultados da análise de tamanho de partícula também mencionaram que OAnf reconstituído em água exibiu partículas nanométricas com homogeneidade de distribuição superior. Esses resultados indicaram que o OAnf tinha uma área superficial maior do que o OA bruto. Além disso, a formação de pontes de hidrogênio intermoleculares entre compostos ativos e carreadores também poderia contribuir para a melhoria da solubilidade em água. O espectro de FTIR e HNMR de OAnf demonstrou que OA bruto foi efetivamente encapsulado em HPBCD e formou uma estrutura de nanofibra estabilizada com PVPK90 através da formação da ligação de hidrogênio intermolecular entre OA e HPBCD/PVPK90. A forma cristalina transformada numa forma amorfa do composto activo foi também um indicador de melhoria da solubilidade em água. O padrão DRX do OAnf mostrou que a estrutura cristalina do OA bruto foi transformada em uma estrutura amorfa após a formação das nanofibras. Este resultado semelhante também foi observado em vários compostos ativos carregados em nanofibras [12,30]. Em conjunto, a formulação de nanofibra melhorou efetivamente a solubilidade em água do OA bruto através da melhoria das propriedades físico-químicas, incluindo redução do tamanho das partículas, aumento da área de superfície, formação de ligações de hidrogênio com transportadores e transformação amorfa.

As formulações tópicas contendo antioxidantes são eficazes para entrega à epiderme e derme para neutralizar o estresse oxidativo induzido por PM, inflamação e envelhecimento da pele [33]. Com base no conhecimento da absorção pela pele, o estrato córneo é o fator limitante da taxa que limita a penetração na pele e a absorção de compostos ativos, resultando em uma diminuição da atividade biológica [34]. O resultado da penetração cutânea in vitro indicou que o OAnf passou pelo estrato córneo com mais facilidade e rapidez do que o OA bruto e permaneceu na epiderme e derme em grandes quantidades. Este resultado confirmou que o OAnf pode efetivamente melhorar a absorção da OA crua pela pele. Em seguida, a fim de determinar se o OAnf tinha melhor atividade antipoluição do que o OA bruto, neste estudo, um modelo de dano de queratinócitos induzido por PM foi usado para comparar suas atividades biológicas. Nossos resultados demonstraram que OAnf em PBS teve melhores efeitos antipoluição do que OA cru, incluindo redução da superprodução de ROS, diminuição da expressão de proteínas inflamatórias (COX-2 e NF-kB) e proteína de envelhecimento da pele (MP-1), expressão de proteína anti-envelhecimento aumentada (TIMP-1) e fosforilação de JNK regulada negativamente. Portanto, OAnf pode ser uma formulação tópica como agente antioxidante para prevenir danos aos queratinócitos induzidos por PM.

Em resumo, OAnf melhorou suas propriedades físico-químicas para resolver a baixa solubilidade em água do OA bruto e também melhorou significativamente a absorção cutânea do OA bruto. OAnf teve melhores atividades antioxidantes, anti-inflamatórias e anti-envelhecimento em danos aos queratinócitos induzidos por PM. Consequentemente, sugerimos que o OAnf possa ser usado como um produto para cuidados com a pele ou como uma formulação farmacêutica para prevenir danos à pele induzidos por PM no futuro.

Este artigo foi extraído de Antioxidants 2021, 10, 1411. https://doi.org/10.3390/antiox10091411 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants