Adesivos de microagulhamento de glutationa inodoros para clareamento da pele

Abstrato:

A glutationa é uma substância antienvelhecimento natural que previne a oxidação de tióis de proteínas de espécies reativas de oxigênio. Na indústria farmacêutica, a glutationa reduzida (GSH) tem sido amplamente utilizada para o clareamento da pele devido à sua capacidade de inibir a tirosinase.

No entanto, sua baixa permeabilidade e mau cheiro limitam seu uso em aplicações na pele. Aqui, relatamos um adesivo de microagulha (MN) dissolvido carregado com GSH preparado com ácido hialurônico (HA) que permite maior permeação na pele e reduz o odor fétido do GSH. HA foi selecionado para preparar soluções inodoras de GSH e usado para fabricações de MN como um transportador de GSH. Arranjos de MN carregados com GSH (GSH-MN) preparados a partir de solução formadora de MN contendo até 10% de GSH mostraram boa uniformidade de padrão e propriedades mecânicas apropriadas para inserção na pele. Os GSH-MNs com uma capacidade de carga de 17,4% dissolvem-se em 10 minutos após a inserção na pele suína e liberam o GSH carregado sem serem oxidados. Esta nova abordagem combina biopolímeros funcionais para reduzir o odor característico de GSH e a administração transdérmica avançada baseada na tecnologia MN para aumentar a permeação da pele sem dor. Acreditamos que esta técnica pode expandir a aplicação do GSH em muitos campos cosmecêuticos.

Para clareamento, descobrimos que Cistanche tem um efeito de clareamento muito bom, e o extrato de glicosídeos totais de feniletanol de Cistanche tem um efeito de regulação negativa significativo na atividade da tirosinase, a principal enzima limitante da síntese de melanina da pele. O efeito ativo pode reduzir o conteúdo de grânulos de melanina na pele (Yang Jianhua, et al. West China Pharmaceutical Journal, 2010, 25(05):533-535); estudaram os cinco principais monômeros de glicosídeos de feniletanol em Cistanche deserticola e o benzeno de Cistanche deserticola purificado O efeito dos glicosídeos de etanol totais no conteúdo de grânulos de melanina em melanócitos de pele humana em cultura primária demonstrou ter um efeito inibitório significativo na síntese de melanina da pele; o espectro ultravioleta de glicosídeos de feniletanol de Cistanche deserticola foi digitalizado e descobriu-se que ele pode efetivamente absorver a irradiação ultravioleta nas regiões UVA e UVB (Yang Jianhua, et al. West China Pharmaceutical Journal, 2011, 26(3):{{9 }}); a atividade antioxidante dos glicosídeos de feniletanol de Cistanche deserticola foi investigada, e os resultados mostraram que todos eles tinham forte liberdade de eliminação Base ativa, tem efeito clareador.

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Palavras-chave:

Glutationa; administração transdérmica de fármacos; ácido hialurônico; microagulha; Clareamento da pele.

1. Introdução

A glutationa, um tripeptídeo tiol natural de -glutamil-cisteinil-glicina, desempenha um papel vital nas reações redox celulares e está envolvida na inibição da síntese de melanina, proteção contra espécies reativas de oxigênio e desintoxicação celular [1,2]. Enquanto a glutationa está presente nas formas oxidada e reduzida dentro do corpo, a glutationa reduzida (GSH) é um composto com alto grau de utilidade biológica [3,4].

Por exemplo, sua capacidade de suprimir a síntese de melanina através da inibição da tirosinase permite que seja usado como um agente de clareamento da pele em cosmecêuticos [5-7]. Além disso, o GSH pode ser usado como reforço imunológico, antídoto para envenenamento por metais e tratamento de doenças como fibrose, glaucoma e artrite [8-11]. Infelizmente, sua baixa biodisponibilidade e odor desagradável limitam o uso de GSH em clínicas, apesar de suas muitas aplicações terapêuticas.

Peptídeos medicinais são comumente administrados por vias parenterais usando agulhas hipodérmicas. No entanto, esta via requer atenção médica para cada administração de dose e tem pouca adesão do paciente devido à dor sentida durante a injeção [12,13]. Embora aplicações tópicas tenham sido usadas para fornecer GSH através da pele, seu odor desagradável e incapacidade de passar pelo estrato córneo (SC, a barreira mais externa da pele) limitam seu uso [14].

Recentemente, um sistema minimamente invasivo de entrega transdérmica usando microagulhas (MNs) tem recebido grande atenção dos médicos, particularmente para a entrega de agentes bioativos, como peptídeos e proteínas que são instáveis ​​ao pH gastrointestinal e suscetíveis à degradação enzimática [15].

Para superar as limitações associadas aos métodos existentes de entrega de GSH, imaginamos um adesivo MN de dissolução rápida preparado pela desodorização de biopolímeros para melhorar a eficácia do GSH e a adesão do paciente. A alta biocompatibilidade e as propriedades físico-químicas ajustáveis ​​de biopolímeros como o ácido hialurônico (AH) os tornam candidatos adequados como materiais MN [16,17]. Além disso, biopolímeros com grupos multifuncionais podem interagir com moléculas por meio de interações iônicas reversíveis, ligações de hidrogênio e forças de van der Waal, contribuindo assim para sua alta capacidade de carga e boas propriedades adsorventes [18]. Uma vez que a cinética de liberação de drogas carregadas em MNs pode ser controlada por meio da dissolução ou da taxa de degradação dos polímeros usados, as plataformas MN dissolvidas podem ser aplicadas para a liberação sustentada e de longo prazo de drogas por meio de vias transdérmicas [19-22].

Aqui, relatamos uma nova abordagem para a entrega transdérmica eficiente e inodora de GSH usando a dissolução de adesivos MN preparados a partir de biopolímeros desodorizados. Após a triagem de vários biopolímeros para formulações inodoras de GSH, o HA foi selecionado como material para o MN e usado para a fabricação de patches de MN carregados com GSH. A quantidade de GSH carregada nos HA MNs foi determinada como tendo efeitos anti-melanogênicos ótimos e menor citotoxicidade, conforme confirmado por estudos de citotoxicidade e inibição da tirosinase. As matrizes HA MN carregadas com GSH (GSH-HA MN) foram avaliadas quanto à sua textura uniforme, geometria, resistência mecânica desejada e habilidades de penetração na pele. Após a aplicação de adesivos GSH-HA MN em tecido de pele animal, suas habilidades de dissolução e padrões de liberação de drogas foram estudados.

2. Materiais e métodos

2.1. Materiais

Glutationa reduzida (GSH), gelatina (de pele suína), 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- brometo de difeniltetrazólio (MTT) , e o ácido kójico (KA) foi adquirido da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA), o hialuronato de sódio (100 k, HA) foi adquirido da SNVIA (Busan, Coréia). O sulfato de condroitina (CS) foi adquirido da Wako Chemicals (Osaka, Japão). O hormônio estimulador de melanócitos (-MSH) foi adquirido da TOCRIS (Bristol, Reino Unido) e um kit de detecção de apoptose usando anexina V marcada com FITC (isotiocianato de fluoresceína) foi adquirido da BD Biosciences (Bedford, MA, EUA). Um pré-polímero líquido (Sylgard 184A) e um agente de cura (Sylgard 184B) para a moldagem de polidimetilsiloxano (PDMS) foram adquiridos da Dow Corning (Midland, MI, EUA). Todos os produtos químicos foram utilizados sem purificação adicional. A pele suína (pêlos removidos) foi adquirida em um açougue local e mantida a -20 ◦C até ser utilizada em experimentos.

2.2. Cultura de células

Queratinócitos humanos (células HaCaT) e linhas celulares de melanoma derivadas de camundongos (B16F10), que foram utilizadas para estudos in vitro, foram obtidas da ATCC (Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em meio DMEM livre de GSH (Hyclone, Logan, UT, EUA), suplementado com 10 por cento de soro bovino fetal (FBS, Hyclone), 2 mM de glutamina (Sigma-Aldrich), 100 U/mL de penicilina (Hyclone), e 100 ug/mL de estreptomicina (GenDEPOT, Barker, TX, EUA) a 37 ◦C em atmosfera umidificada com 5 por cento de CO2.

2.3. Testes de odor

O método de pontuação do cheiro foi realizado para avaliar o efeito redutor dos biopolímeros no odor GSH [4]. A quantidade de biopolímero (hialuronato de sódio, gelatina e sulfato de condroitina) foi fixada em 10 por cento em peso na solução total e o GSH foi misturado em diferentes concentrações (1,0 por cento, 2.{ {9}} por cento, 2,5 por cento e 5,0 por cento em peso) em água desionizada (Di). Após 30 minutos de mistura, um painel de teste de 10 voluntários cheirou uma solução contendo uma mistura de biopolímero e GSH. A solução de GSH sem biopolímero foi usada como referência para comparar o odor sulfuroso das amostras misturadas.

Cada voluntário foi solicitado a indicar sua percepção do odor da solução misturada usando a seguinte 5-escala de pontos: 1: sem odor, 2: odor reconhecível, 3: odor facilmente perceptível, 4: odor forte e 5: odor intenso .

2.4. Medições de cromatografia gasosa (GC)

Com base nos resultados da pontuação, a quantidade de H2S liberado foi quantificada para todas as formulações de GSH-HA por cromatografia gasosa (Shimadzu, Tóquio, Japão) usando um detector fotométrico de quadro pulsado (PFPD) [23,24]. Soluções de 1 por cento, 2,5 por cento e 5 por cento (em peso) de GSH foram misturadas com 10 por cento (em peso) de HA e 1 mL foi injetado em um frasco de vácuo marrom de 10 mL. O frasco foi armazenado em estufa a 40 ◦C por 1 hora e depois retirado. O gás gerado (100 µL) foi coletado com uma seringa e injetado em um Shimadzu GC equipado com um PFPD. A separação dos principais compostos sulfurosos foi realizada em uma coluna de vidro de 30 m × 0,25 mm di (DB-1, J&W) a 90 ◦C e um fluxo de arraste (nitrogênio) de 1 mL/min. As temperaturas de detecção e injeção foram de 250 e 150 ◦C, respectivamente. A quantidade de H2S foi medida usando as amostras padrão. A sensibilidade do PFPD foi de 10 ppb para H2S. Os dados de todas as amostras foram confirmados como estando no intervalo da curva padrão.

2.5. Testes de citotoxicidade

A citotoxicidade do GSH foi avaliada usando um ensaio de MTT e coloração de anexina V-FITC. Em resumo, as células HaCaT (número de células: 1 × 104 ) foram tratadas com 0.1, 0.25, {{10}}.5 , e 1.0 mg/mL de GSH em meio DMEM. Após 24, 48 e 72 h de tratamento, 50 µL de solução de MTT foram adicionados à célula e incubados por 1 h antes de aspirar o meio. Depois disso, 100 µL de dimetil sulfóxido (DMSO) foi adicionado e as porcentagens de células viáveis ​​foram calculadas medindo a absorbância de 540 nm usando um leitor MULTISKAN GO (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). A apoptose foi medida por coloração simultânea com anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI). Células HaCaT (1 × 106 ) foram tratadas com 0,1, 0,25, 0,5 e 1,0 mg/mL de GSH. Após 72 h de tratamento, as células foram colhidas, tripsinizadas, lavadas com PBS frio e coradas com tampão de ligação 1X contendo solução de anexina V-FITC e PI. Posteriormente, as células foram incubadas à temperatura ambiente por 15 minutos no escuro. As células coradas foram analisadas por citometria de fluxo em 1 h. As células apoptóticas e vivas foram analisadas usando um citômetro de fluxo Becton Dickinson FACSscan e o software BD FACSDiva (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).

2.6. Determinação do conteúdo de melanina celular e atividade da tirosinase

O efeito clareador proposto do GSH foi avaliado medindo sua capacidade de inibir a atividade da tirosinase. Em resumo, células de melanoma B16F10 derivadas de camundongos foram semeadas em uma placa de cultura de 6-poço em uma concentração de 5.0 × 104 células/poço e permitidas para anexar durante a noite. As células foram tratadas com {{10}} (em branco), 0.1, 0.25, 0,5 e 1,0 mg/mL de GSH e 10 µM de ácido kójico ( KA) como controle positivo por 4 h, e posteriormente estimulado com -MSH (1 µM) por 72 h para induzir a atividade da tirosinase. Após a remoção do meio, as células foram dissolvidas em 500 µL de NaOH 1N e incubadas por 1 h a 60 ◦C para solubilizar a melanina. O teor de melanina foi determinado pela medição da absorbância a 405 nm. Para a atividade da tirosinase, as células foram lisadas em 100 µL de tampão fosfato de sódio 50 mM (pH 6,5) contendo 5 µL de Triton X a 1 por cento-100 e 5 µL de fluoreto de fenilmetilsulfonil 0,1 mM. Após centrifugação a 10,000 g (30 min, 4 ◦C), os sobrenadantes com 20 µL de l-3,4-diidroxifenilalanina (l-DOPA) foram carregados em um {{ 44}}placa de poços e a absorbância foi medida a 492 nm a 37 ◦C.

2.7. Fabricação de Patches GSH-MN

As matrizes GSH-MN em forma de bala (10 × 10 MNs/cm2 ) foram fabricadas com um molde PDMS reutilizável pela fundição de solvente de uma solução aquosa de 10 por cento HA soluções com diferentes concentrações de GSH (0 por cento, 1,0 por cento, 2,5 por cento e 5,0 por cento em peso). Os moldes PDMS negativos com cavidades em forma de bala foram replicados a partir de matrizes metálicas MN fabricadas por microusinagem [16]. As soluções formadoras de MN (350 µL de soluções HA ou HA/GSH) foram pipetadas no molde PDMS e secas a 40 ◦C por 12 h após a desgaseificação sob vácuo. As matrizes de MN secas foram cuidadosamente retiradas do molde. A morfologia das matrizes MN fabricadas foi caracterizada usando microscopia digital (AM413ZT, Dino-Lite, Taiwan) e óptica (Eclipse TS100, Nikon, Japão). Os HA MNs contendo 0, 1, 2,5 e 5 mg/mL de GSH foram referidos como GSH0-HA MN, GSH1-HA MN, GSH2.5-HA MN e GSH5-HA MN, respectivamente.

2.8. Testes de Fratura

Um único HA MN e HA MNs carregados com GSH (GSH0-HA MN, GSH1-HA MN e GSH2.5-HA MN) foram fixados usando cola de cianoacrilato (Loctite 4{{ 7}}1, Loctite Corp, Dublin, Irlanda) para prender o pino de montagem colocado na garra inferior da máquina de teste universal (UTM, A&D 5000H, A&D Sales Corp, Daegu, Coréia). A garra superior do testador mecânico foi movida axialmente para baixo em direção à ponta MN a uma taxa de 0,1 mm/min. A força de escoamento foi medida em função da taxa de deslocamento da sonda e expressa em Newtons (N).

2.9. Teste de Inserção na Pele

O teste de inserção na pele foi realizado para verificar a capacidade de penetração dos MNs, a provável extensão da distorção e possível deflexão do tecido durante sua inserção. Os GSH0-HA MN, GSH1-HA MN e GSH2.5-HA MNs foram fixados com cola de cianoacrilato à superfície metálica por meio de fixação com a alça superior do UTM e inseridos com uma força de 10 mm/min em pele suína excisada (3 × 3 cm2, ~ 2 mm de espessura) colocada na base do testador mecânico [25]. A pele suína foi utilizada após a remoção da camada gordurosa subdérmica com bisturi.

2.10. Teste de Dissolução

GSH2.5-HA MN foi aplicado em pele suína (3 × 3 cm2) em vários pontos de tempo predeterminados (3, 5, 7 e 10 min). Após a remoção dos patches MN, a altura dissolvida das pontas MN foi medida usando um microscópio óptico (Eclipse TS100, Nikon, Tóquio, Japão).

Para confirmar a marca de punção de GSH2.5-Padrões HA MN, 0.5 mg de corante (rodamina B) foi adicionado a 1 mL de soluções mistas de GSH a 2,5 por cento (em peso) para preparar os MNs . Posteriormente, a fabricação da matriz MN usando uma solução misturada com corante foi fabricada usando o mesmo método descrito acima. A marca de perfuração formada a partir das matrizes de MN, sua posição durante a translação na pele suína e o grau de deflexão do tecido foram analisados ​​em um microscópio digital (AM413ZT, Dino-Lite, Taiwan). Qualquer alteração na morfologia do MN após a inserção foi examinada em um microscópio óptico.

2.11. Capacidade de carga e eficiência de encapsulamento

Para determinar a quantidade de GSH carregada nos HA MNs, as pontas MN do GSH{{0}}HA MN e GSH2.5-HA MN, respectivamente, foram cortadas e totalmente dissolvidas em PBS (pH 7,4 ) por 24h. A quantidade de GSH nas pontas MN foi determinada analisando 10 µL de solução de amostra usando cromatografia líquida de alta performance (HPLC, e2695, Waters, EUA) em uma coluna SunFire C18 (100Å, 5 µm, 4,6 × 250 mm, Águas). O HPLC foi operado usando água acetonitrila (5:95) e 0,1 por cento de ácido trifluoroacético (TFA) como fase móvel com uma taxa de fluxo de 0,8 mL/min. Com base nos dados de HPLC, a capacidade de carregamento (LC) e a eficiência de encapsulamento (EE) foram calculadas usando as seguintes equações: Capacidade de carregamento ( percent )=men mtot × 100 (1). Eficiência de encapsulamento (por cento)=homens min × 100 (2)

onde men representa a quantidade de droga encapsulada em pontas MN, most é a massa total de pontas MN e min representa a quantidade de droga em soluções formadoras de MN [26].

2.12. Testes de permeação da pele GSH in vitro

Para investigar a cinética de permeação ex vivo através da pele do GSH reduzido liberado do GSH2.5-Padrões HA MN, testes de células de Franz de difusão estática foram realizados para calcular a taxa de liberação de GSH dependente do tempo através do GSH2.{ {5}}HA MNs e sua difusão através da pele junto com uma solução de referência GSH-HA. Os patches de GSH2.5-HA MN e 350 µL GSH2.5-solução de HA usados ​​para fabricações de MN foram aplicados em pele de rato excisada Sprague-Dawley (SD) (~ 2 mm de espessura) colocados entre as câmaras doadoras e receptoras na célula de difusão de Franz, respectivamente. Depois de inserir os adesivos GSH2.5-HA MN na pele do rato, um adesivo hidrocolóide (NeoDerm Roll, EVERAID, Yangsan, Coréia) foi aplicado ao suporte MN durante a administração do medicamento. A câmara receptora com um braço lateral foi preenchida com 22 mL de tampão PBS fresco (pH 7,4) e mantida a 37 ◦C [27]. Um mililitro da amostra foi retirado em cada ponto de tempo (0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36 e 48 h) da câmara do receptor da célula de Franz e recarregado com uma quantidade igual de PBS fresco (pH 7,4 ). Os adesivos GSH2.5-HA MN foram removidos da pele do rato após 1 h. A quantidade de GSH que foi liberada da ponta MN e permeou a pele do rato foi analisada por HPLC usando o protocolo descrito acima. O GSH foi detectado medindo a absorbância a 385 nm e a concentração da droga foi expressa em mg.

2.13. Análise Estatística

Todos os resultados são expressos como média ± desvio padrão (DP) e analisados ​​pelo teste t de Student. O nível de significância foi estabelecido em p < 00,05.

3 Resultados e discussão

3.1. Testes de triagem para selecionar polímeros desodorizáveis

Com base na intensidade do odor, a análise de pontuação foi realizada usando uma escala de 1 a 5 para avaliar a liberação de H2S da autodegradação de GSH livre e formulações de biopolímero GSH. O experimento foi realizado incluindo 10 voluntários saudáveis ​​selecionados aleatoriamente de ambos os sexos. Um odor forte foi associado a uma maior quantidade de H2S liberado e vice-versa. Todas as concentrações (1.0–5.0 por cento em peso) de gelatina (4,75 ± 0,2) e CS-GSH (3,25 ± 0,95) as formulações tiveram pontuação mais alta, enquanto HA-GSH (1,5 ± 0,35) teve pontuação mais baixa do que GSH sozinho (2,75 ± 0,61; Figura 1a). As altas pontuações para as formulações de gelatina-GSH e CS-GSH em comparação com o GSH sozinho foram devidas aos seus odores característicos, além do odor do H2S liberado.

Posteriormente, com base nos escores de odor, a estimativa quantitativa do H2S liberado (em ppm) foi realizada por GC para a formulação de GSH-HA em diferentes concentrações. A quantidade de H2S liberada foi de no mínimo 1,0 por cento e 2,5 por cento (0,55 ± 0.01 e {{13} },49 ± 0.03 ppm) e um máximo de 5,0 percent (1.03 ± 0.{{27} }1 ppm) de GSH na formulação. Em todas as concentrações, os valores foram inferiores aos de GSH sozinho (00,59 ± 0.03, 00,75 ± 0,04 e 1,15 ± 0,05 para 1,0%, 2,5% e 5% de GSH, respectivamente; Figura 1b). A razão para este resultado foi que o Na plus substituído em HA reage com o grupo tiol de GSH através da fórmula de reação mostrada na Figura Suplementar S1. Foi confirmado que a redução do odor foi causada pela diminuição da produção de H2S (Figura complementar S1) [28,29]. Esses resultados mostram que o HA tem um melhor efeito desodorante em comparação com a gelatina e o CS, razão pela qual foi selecionado para a fabricação de MNs no presente estudo. Uma vez que a capacidade de desodorização máxima de HA para H2S liberado foi observada com as formulações de 1,0%, 2,5% e 5,0% de GSH-HA (Figura 1b), essas três concentrações foram selecionadas para a fabricação de MNs.

3.2. Efeito do GSH na citotoxicidade e na atividade da tirosinase

O ensaio MTT foi usado para determinar se GSH é citotóxico para HaCal. Uma análise do classificador celular ativado por fluorescência (FACS) foi realizada usando anexina V, que especificamente e ventos fortes para a superfície celular PI para confirmar se a morte celular apoptótica ou necrótica foi observada (30Ireatment with GSH0 .2-1.0 mg/mL não alterou significativamente a proporção de células viáveis ​​em 72 em comparação com células tratadas com veículo (Figura 2a). Nenhum efeito citotóxico de GSH nas células HaCaT foi confirmado por fluxo análise de citometria usando anexina V. A exposição de células HaCaT a 0, 0.1, 0.25, 0.5ou 1 mgmL de GSH por 72 h resultou na indução de apoptose dependente da concentração (Figura 2b,c) A exposição ao GSH não causou um aumento significativo nas células apoptóticas (7,90 mais 1.02-13,99 mais 0,37 por cento ) e diminuição na proporção de células vivas (88,38 mais 1,02-80,81 mais 0,67 por cento ) em comparação com células tratadas com veículo (4,85 mais 0,72 por cento e 90,47 mais 0,93 por cento para apoptóticos e células vivas, respectivamente; Figura 2b,c). Esses resultados sugerem que o GSH não é tóxico para os queratinócitos humanos e pode ser usado com segurança na pele humana.

A tirosinase é a enzima responsável pela síntese de melanina. Os efeitos clareadores do GSH foram avaliados medindo a taxa de inibição da produção de melanina e a atividade da enzima limitante da taxa de tirosinase na melanogênese. Células B16F10 foram pré-tratadas com 10 uM KA e GSH (0,1–1,0 mg/mL) por 4 h e depois estimuladas com -MSH (1 µM) por 72 h. O tratamento com GSH inibiu significativamente a produção de melanina induzida por -MSH (Figura 3a). Com esta descoberta, a atividade da tirosinase induzida por -MSH (345,60 ± 18,29 por cento sem tratamento com GSH) foi significativamente reduzida para 207.34 2020 ± 2,78 por cento no tratamento de 1 mg/mL de GSH (Figura 3b).

3.3. Fabricação de HA MNs carregados com GSH e suas propriedades mecânicas

Para fornecer GSH através da pele de maneira minimamente invasiva, selecionamos o HA como um material MN com base em sua capacidade de reduzir o H2S, o que foi confirmado por testes de pontuação e dados de cromatografia gasosa (Figura 1). As soluções formadoras de MN contendo HA e GSH foram usadas para a preparação de matrizes HA MN carregadas com GSH (GSH-HA MN). As matrizes foram preparadas por meio de um método de fundição de solvente usando um molde PDMS com cavidades em forma de bala. As matrizes GSH-MN (100 MNs/cm2) exibiram um padrão uniforme com uma altura de 770 ± 5 µm, um diâmetro de base de 172,25 ± 2,5 µm e um diâmetro de ponta de 7,8 ± 2,5 µm com um ângulo de 40 ± 2,5◦ (Figura 4a). A geometria do MN foi determinada para garantir a penetração da camada SC e entrega transdérmica de GSH com dano vascular ou neuronal mínimo para evitar dor e sangramento capilar no local de aplicação. As características uniformes dos MNs GSH-HA foram obtidas quando os MNs foram preparados usando soluções formadoras de MN contendo 2,5 por cento de GSH, mas alguns MNs dobrados foram observados quando preparados com uma alta concentração (5 por cento) de GSH (Figura complementar S2).

As propriedades mecânicas de GSH-HA MNs foram examinadas em um modo de compressão. Um único MN afixado com uma cola de cianoacrilato na superfície inferior do UTM foi comprimido axialmente por uma placa de metal plana presa usando a garra superior da máquina a uma taxa de 0,1 mm/min (Figura 4a–c) . A força de escoamento, ou a força necessária para um material perder sua elasticidade, foi determinada como 0,25, 0,39 e 0,4{{1{{17 }}}} N com um desvio de ±0.03 para GSH0-HA MNs, GSH1-HA MNs e GSH2.5-HA MNs, respectivamente (Figura 4d). A força de inserção encontrada foi 0,36 ± 0.003, 0,39 ± 0,015 e 0,37 ± 0,005 para GSH0-HA MNs, GSH{{30 }}HA MNs e GSH2.5-HA MNs, respectivamente. Tanto a força de cedência quanto a força de inserção foram suficientes para a inserção de MNs na pele suína sem qualquer fratura, distorção ou deflexão do tecido.

3.4. Testes de dissolução in vitro dos MNs GSH-HA

O tempo de dissolução de um biopolímero determina o padrão de liberação do fármaco e o início da ação de qualquer formulação. Para prever o tempo necessário para a liberação de GSH, um único MN (GSH, 5-HA) foi inserido na pele suína, que é estruturalmente semelhante à pele humana. A análise microscópica mostrou a dissolução dependente do tempo dos MNs. Após a aplicação de GSH-MNs na pele por 12 min, as pontas de MN foram completamente dissolvidas, iniciando seu padrão de liberação rápida (Figura 5a,b). Para confirmar a penetração na pele dos patches GSH 5-HA MN, os patches MN (1,5 x 1,5 cm) carregados com corante rodamina foram aplicados à pele suína com uma força de inserção de 20 N por 1 min. Após a remoção dos patches MN carregados com corante, observamos uma matriz de pontos de corante correspondentes a cada agulha, confirmando a inserção dos GSH 5-HA MNs na pele (Figura 5c).

A capacidade de carga refere-se à quantidade máxima de fármaco que pode ser submetida a um transportador de entrega e determina sua eficiência de carga. A capacidade de carga dos emplastros GSH-HA MN é definida como a massa da droga carregada (GSH) nas pontas MN dividida pela massa total das pontas GSH-HA MN. Para verificar a eficiência do carregamento, pontas de MN carregadas com GSH foram cortadas e dissolvidas em PBS (pH 7,4), e a quantidade de GSH carregada nas pontas foi analisada por HPLC. A quantidade de carregamento de GSH em 100 dicas de MN foi {{10}},29 ± {{20}}.03 mg e 0,56 ± 0,03 mg para os patches GSH1-HA MN e GSH2.5-HA MN, respectivamente. Dada a massa total de pontas GSH-MN (100 MNs, 2 ± 0,2 mg), a capacidade de carga foi de 11,26 ± 1,24 por cento e 21,33 ± 1,13 por cento, enquanto a eficiência de encapsulamento foi de 8,36 ± 0,92 por cento e 6,34 ± 0,34 por cento para GSH1-HA MN e GSH2.5-HA MNs, respectivamente (Tabela 1). Valores semelhantes entre a razão de peso HA:GSH (10:1 ou 10:2,5) em soluções formadoras de MN e a capacidade de carregamento de GSH em manchas MN sugerem a distribuição uniforme de GSH na mancha MN.

3.5. Teste de Permeação da Pele Ex Vivo de Adesivos GSH-HA MN

Para estimar o início, bem como a duração da liberação de GSH de GSH,5-HA MNs, o estudo de células de Franz foi realizado por 48 h colocando a pele de um rato SD sob condições fisiológicas simuladas (Figura 6). Os GSH 5-HA MNs mostraram uma cinética de liberação linear relativamente rápida para o início12 h seguido por uma taxa lenta de liberação ao longo do tempo.

A quantidade de GSH permeada na pele após a aplicação de MN foi de ~1,4 mg nas 12 horas iniciais do experimento e atingiu ~1,6 mg em 48 horas. Foi entregue uma quantidade de GSH maior que a quantidade carregada em ponteiras MN. Esta quantidade não inclui apenas o GSH carregado no GSH2.5-HA MN dicas, mas também o GSH incorporado na camada de base como um reservatório de drogas. Em contraste, a solução de GSH-HA foi entregue lentamente em pequenas quantidades (~0,2 mg) devido à fraca permeação de GSH na pele. Como a entrega transdérmica do hormônio de crescimento humano usando MNs preparados por carboximetilcelulose e trealose demonstrou um tmax curto (~ 30 min) após a aplicação de MN e exibiu perfis farmacocinéticos semelhantes aos da injeção SC [19], o adesivo GSH-HA com água rápida as propriedades de absorção seriam aplicáveis ​​para entrega sistêmica de GSH. Com base no estudo in vitro, o tratamento com 1 mg/mL de GSH inibiu significativamente a produção de melanina e a atividade da tirosinase. Considerando o pequeno volume (~150 µL/cm2 ) de fluido intersticial na pele [31], GSH administrado localmente por adesivos HA MN (1,6 mg GSH/1 cm2 adesivo MN) poderia atuar como um agente antioxidante durante o processo de dissolução do MN. Uma vez que a cinética de liberação de GSH carregado em MNs pode ser controlada pela densidade de reticulação do material MN [32,33], uma plataforma MN expansível seria benéfica para a entrega eficaz de GSH com efeitos colaterais mínimos.

4. Conclusões

Com base na capacidade de desodorização (valor da pontuação) e nos resultados do GC, selecionamos HA para desenvolver adesivos MN biodegradáveis ​​para entrega transdérmica inodora de GSH. HA mascarou o mau cheiro de GSH de forma mais eficiente do que gelatina e CS. O patch HA-MNs (GSH2.5-HA) teve durabilidade suficiente para penetrar na pele sem ser danificado. A liberação de GSH dos patches HA-MNs (GSH1-HA e GSH2.5-HA) foi uniforme ao longo de um determinado período, conforme demonstrado pelos respectivos experimentos. Os estudos citotóxicos e inibidores da tirosinase mostraram que uma concentração de GSH de 1 mg/mL é segura e eficaz para fins de clareamento da pele. Ao todo, a viabilidade dos adesivos HA MN desenvolvidos como uma plataforma promissora para entrega transdérmica de GSH ou drogas com propriedades organolépticas nocivas ou inaceitáveis ​​foi demonstrada com base em dados experimentais reivindicados neste estudo.

Materiais Suplementares:

Figura S1: O efeito do hialuronato de sódio na redução do odor, Figura S2: Imagens de matriz GSH5 -HA MN.

Contribuições do autor:

Conceituação, YL, Y.-SJ e SYY; Metodologia, YL, SHK, K.-YS e SK; Curadoria de dados, CK e HL; Redação—rascunho original, YL, SK, SYY; revisão e edição, SK, Y.-SJ, K.-YS e SYY; Supervisão, SYY Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento:

Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiada pelo Ministério da Ciência e TIC (NRF-2018R1A4A1025623) e pelo Programa Nacional de Iniciativa de Pesquisa Criativa por meio da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF). financiado pelo Ministério da Ciência, TIC e Planejamento Futuro (NRF-2017R1D1A3B03035360).

Conflitos de interesse:

SYY é um inventor de uma patente licenciada para a empresa (SNVIA) desenvolvendo produtos cosméticos GSH inodoros. Este potencial conflito de interesses é administrado pela Pusan ​​National University.

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Yechan Lee 1, Sujeet Kumar 1, Sou Hyun Kim 2, Keum-Yong Seong 1, Hyeseon Lee 1, Chaerin Kim 1, Young-Suk Jung 2,* e Seung Yun Yang 1,*

1 Departamento de Ciência de Biomateriais, Instituto de Convergência de Vida e Indústria, Pusan ​​National University, Miryang 50463, Coréia.

2 Faculdade de Farmácia, Universidade Nacional de Pusan, Busan 46241, Coréia.

Recebido: 31 de dezembro de 2019; Aceito: 22 de janeiro de 2020; Publicado: 27 de janeiro de 2020

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