NGF modula o metabolismo do colesterol e estimula a secreção de ApoE nas células gliais, conferindo neuroproteção contra o estresse oxidativo - Parte 1

Abstrato:

O colesterol desempenha um papel crucial no cérebro, onde a atividade astrocítica regula particularmente o metabolismo. Na verdade, os neurônios adultos suprimem a biossíntese do colesterol e importam este esterol através de partículas ricas em ApoE secretadas pelos astrócitos. Evidências recentes sugerem que o fator de crescimento nervoso (NGF) pode exercer atividade neurotrófica influenciando o metabolismo celular.

Os neurônios são as unidades básicas que constituem o cérebro humano. Através das conexões entre os neurônios, eles formam o nosso córtex cerebral, que carrega todos os nossos conhecimentos e memórias. Portanto, os neurônios estão intimamente relacionados à capacidade de memória.

A principal função dos neurônios é transmitir informações. Cada neurônio possui uma sinapse, que conecta os dendritos e axônios de outros neurônios. Quando um neurônio recebe um sinal, ele passa o sinal para os neurônios aos quais está conectado. Essa sinalização, chamada transmissão neuronal, é um dos processos-chave na formação, armazenamento e recuperação da memória.

Ao manter o nosso cérebro saudável, podemos promover o bom funcionamento dos nossos neurônios através do exercício. O exercício físico melhora a circulação sanguínea e o fornecimento de oxigênio ao cérebro, aumentando assim o número e as conexões dos neurônios. Ao mesmo tempo, diversas atividades sociais e de aprendizagem podem formar novos neurônios em novas áreas cerebrais e aumentar a plasticidade cerebral.

Quando temos mais neurônios ativos, nossa memória fica mais forte. A sincronia entre os neurônios do córtex cerebral torna-se mais uniforme, facilitando o armazenamento e a recuperação de informações, melhorando nossas habilidades cognitivas. Além disso, um grande número de neurônios e conexões entre neurônios também melhorarão nossa velocidade de reação e capacidade de tomada de decisão.

Portanto, manter neurônios saudáveis ​​e melhorar a memória andam de mãos dadas. Podemos melhorar nossa memória promovendo neurônios saudáveis, concentrando-nos em exercícios físicos, em uma variedade de atividades sociais e de aprendizagem e em hábitos alimentares. Vamos trabalhar juntos para apoiar a saúde do nosso cérebro! Percebe-se que precisamos melhorar nossa memória. Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória porque Cistanche deserticola é um material medicinal tradicional chinês com muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. A eficácia da carne picada vem de uma variedade de ingredientes ativos que ela contém, incluindo ácido carboxílico, polissacarídeos, flavonóides, etc. Esses ingredientes podem promover a saúde do cérebro por meio de vários canais.

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No entanto, o efeito do NGF na homeostase do colesterol glial ainda não foi elucidado. Este projeto visa avaliar se o NGF poderia influenciar o metabolismo do colesterol nas células gliais. A linhagem celular derivada de astrócitos U373 foi utilizada como modelo experimental para atingir esse objetivo. A análise de imunotransferência e ELISA mostrou que as proteínas e enzimas pertencentes à rede de metabolismo do colesterol aumentaram após o tratamento com NGF nas células gliais. Além disso, o NGF aumentou significativamente a secreção de ApoE e a quantidade de colesterol extracelular no meio de cultura.

Experimentos de cocultura e meio condicionado U373- demonstraram que o tratamento com NGF neutralizou eficientemente a citotoxicidade mediada pela rotenona em células neuronais N1E-115. Por outro lado, a neuroproteção mediada pelo tratamento com NGF foi suprimida quando N1E-115 foi co-cultivado com células U373 silenciadas por ApoE. Estes dados sugerem que o NGF controla a homeostase do colesterol nas células gliais. Mais importante ainda, o NGF exerce neuroproteção contra o estresse oxidativo, provavelmente associado à indução da secreção glial de ApoE.

Palavras-chave:

ApoE; astrócito; colesterol; diferenciação; fator de crescimento nervoso; metabolismo; neurônio; espécies que reagem ao oxigênio; rotenona.

1. Introdução

O cérebro é caracterizado pela maior quantidade de colesterol em todo o corpo [1]. A concentração excepcional deste esterol no sistema nervoso central (SNC) justifica-se pelo facto do colesterol estar envolvido em vários processos biológicos fundamentais. É digno de nota que uma quantidade significativa de colesterol é integrada nas membranas plasmáticas dos astrócitos e neurônios, onde define uma morfologia celular adequada e o correto funcionamento dos receptores de membrana e da neurotransmissão sináptica [2].
O colesterol também é essencial para formar novas membranas necessárias para o crescimento de neuritos, sinaptogênese e liberação de neurotransmissores, sendo portanto crucial na diferenciação e maturação neuronal [3–7].

Essencialmente, todo o colesterol no cérebro deriva da biossíntese de novo in situ. Especificamente, a barreira hematoencefálica (BHE) impede a captação de colesterol proveniente de lipoproteínas transportadas pela circulação sistêmica [8]. Por esta razão, as células nervosas desenvolvem uma rede reguladora exemplar para gerir de forma independente a sua própria procura deste lípido. Um modelo bem aceito estabelece que após a embriogênese, durante o período pós-natal, a biossíntese de colesterol cai drasticamente nos neurônios, na tentativa de economizar a energia empregada para a geração dos potenciais de ação.

Conseqüentemente, os astrócitos atendem às duvidosas necessidades neuronais de colesterol, cuja síntese se torna particularmente pronunciada [1,9,10]. A entrega do colesterol produzido pelos astrócitos aos neurônios implica um mecanismo elegante de transporte horizontal, que envolve proteínas e partículas críticas. Especificamente, a exportação de colesterol começa nos astrócitos, onde o colesterol neo-sintetizado é carregado em partículas nascentes de lipoproteínas contendo apolipoproteína E (ApoE). Evidências acumuladas indicam que a lipidação de partículas ricas em ApoE é mediada pelo transportador A1 de ligação ao ATP (ABCA1) [11]. Posteriormente, uma vez liberada no espaço extracelular, a lipoproteína contendo ApoE é captada pelos neurônios através de endocitose mediada por receptor, receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLr) e proteína 1 relacionada ao LDLr (LRP1) [12].

De acordo com o papel fundamental do colesterol derivado de astrócitos na homeostase neuronal, resultados experimentais indicaram que o colesterol contido em lipoproteínas ricas em ApoE aumenta significativamente a diferenciação dendrítica e a função sináptica [13,14]. O meio condicionado de acordenastrócitos dos astrócitos da doença de Huntington (HD), que secretam apenas uma quantidade modesta de colesterol ligado à lipoproteína ApoE, afeta gravemente o crescimento de neuritos e a atividade sináptica nos neurônios HD (15).

A ação neurotrófica de partículas contendo ApoE derivadas de astrócitos é ainda sustentada pelo impacto da deficiência de ApoE, que dificulta marcadamente a neurogênese adulta no hipocampo [16]. O crosstalk de colesterol entre astrócitos e neurônios também é crítico na neuroproteção contra o estresse oxidativo. Por exemplo, alguns relatórios mostram que a ApoE impede o dano oxidativo e a apoptose induzida pela exposição ao peróxido de hidrogênio [17,18].

A partir destas observações, a manutenção da homeostase do colesterol no cérebro é necessária para garantir o funcionamento das células nervosas, e as vias metabólicas subjacentes à regulação deste lípido devem ser finamente controladas para preservar a ocorrência de vários processos neurofisiológicos.

Nos últimos anos, as neurotrofinas surgiram como atores essenciais no metabolismo celular [2,19–22]. As neurotrofinas pertencem a uma pequena família de fatores de crescimento que têm um papel incontestável no desenvolvimento, sobrevivência e plasticidade neuronal [23]. Mais recentemente, estas moléculas sinalizadoras também foram reconhecidas como moduladores cruciais do metabolismo celular, incluindo o metabolismo do colesterol [2,22].

Evidências experimentais destacam que o fator de crescimento nervoso (NGF), o membro protótipo da família das neurotrofinas, estimula a biossíntese do colesterol nas células neuronais e nos hepatócitos [24,25]. Curiosamente, esses eventos envolvem, pelo menos em parte, o receptor de neurotrofina de baixa afinidade p75NTR, que provoca a ativação da proteína 2 de ligação ao elemento regulador de esterol (SREBP-2) e, por sua vez, induz a transcrição de substâncias relacionadas ao colesterol. genes [25]. A atividade do NGF no metabolismo do colesterol não se restringe à biossíntese, pois também promove a captação de colesterol aumentando a expressão de LDLr nos neurônios [26].

Apesar desta informação, o conhecimento sobre a possível contribuição do NGF na regulação da homeostase do colesterol ainda parece particularmente limitado. Notavelmente, faltam estudos sistemáticos que avaliem o papel desempenhado pelo NGF na regulação do metabolismo do colesterol nas células astrocíticas. Considerando que o colesterol produzido pelos astrócitos é essencial para garantir a fisiologia neuronal, é importante compreender se pode influenciar o metabolismo do colesterol nas células gliais, bem como o transporte intercelular do colesterol, cuja regulação peculiar é imperativa para garantir a saúde cerebral.

Com base neste trabalho, pretende-se explorar o envolvimento prospectivo do NGF na modulação do metabolismo do colesterol nas células gliais, bem como o seu impacto na diferenciação neuronal e na sobrevivência neuronal sob condições de stress oxidativo.

2. Resultados

2.1. U373 Expressa Ambos os Receptores NGF TrkA e p75NTR

O NGF foi inicialmente identificado como um fator de crescimento com tropismo específico para células neuronais. No entanto, o acúmulo de evidências demonstra que essa neurotrofina também induz efeitos biológicos em diversas células e tecidos não neuronais [22]. A atividade do NGF é assegurada pela sua ligação ao receptor de alta afinidade TrkAd ao receptor de baixa afinidade p75NTR [2].

Assim, verificamos inicialmente se as células U373 expressam receptores de NGF. Notavelmente, U373 é uma linhagem celular de astrocitoma amplamente utilizada como modelo de cultura de células de astrócitos, já que vários relatórios indicaram que eles reproduzem as propriedades morfológicas, metabólicas e funcionais dos astrócitos [27–29]. De acordo com dados publicados [30], a análise de imunofluorescência mostrou que as células U373 expressam tanto TrkA quanto p75NTR em níveis apreciáveis ​​(Figura S1A). Estes resultados também foram confirmados por análise de Western blot, sugerindo que as células U373 têm potencial para responder totalmente ao NGF.

Como a administração de NGF pode afetar os níveis de expressão de seus receptores, alterando potencialmente o equilíbrio entre as vias de sinalização induzidas por TrkA e/ou p75NTR [31–33], a expressão de ambos os receptores também foi verificada após 48 horas de tratamento com NGF. No entanto, não foram observadas alterações na quantidade de proteína tanto de TrkA como de p75NTR após a estimulação com a neurotrofina (Figura S1B).

2.3. NGF aumenta a secreção de colesterol em U373 no meio de cultura

Os resultados obtidos levaram-nos a estudar se os efeitos mediados pelo NGF poderiam refletir a modulação do teor de colesterol. A coloração com Oil Red O foi realizada para visualizar lipídios neutros, incluindo ésteres de colesterol. O tamanho e o número de gotículas lipídicas encontradas nas células U373 foram semelhantes aos relatados para astrócitos primários [34,35].

Porém, não foram observadas alterações no tratamento com NGF (Figuras 2A e S2A, B). Da mesma forma, não foram detectadas alterações na quantidade de colesterol livre, avaliada pela coloração filipina (Figuras 2B e S2C). A falta de efeitos significativos nos níveis de colesterol intracelular foi ainda sustentada pelo ensaio enzimático de colesterol, que destacou que o NGF não alterou o conteúdo de colesterol total, colesterol livre e ésteres de colesterol (Figura 2C).

Por outro lado, a quantidade de colesterol (livre, ésteres e total) aumentou acentuadamente no meio de cultura de NGF tratado com U373- (Figura 2D). Quando avaliados como um todo, esses dados indicam que o NGF promove a extrusão do colesterol, aumentando o efluxo mediado por ABCA1-de partículas contendo ApoE.

Figura 1. O NGF modula a expressão das principais proteínas envolvidas na homeostase do colesterol em células U373 e aumenta a secreção de ApoE n no meio de cultura U373. (A – G) Western blot representativo e análise densitométrica de SREBP-1, SREBP-2, HMGCR, LDLr, NPC1, ABCA1 e ApoE em células U373 tratadas com veículo (Ctrl) e NGF (100 ng /mL) por 48 horas. n=6 experimentos diferentes.

Actina e vinculina foram utilizadas como controles de carga. (H) Quantificação dos níveis de ApoE (µg/mL) por ensaio ELISA em meio de cultura U373 tratado com veículo e NGF. n=3 experimentos diferentes. Os dados representam médias ± DP. A análise estatística foi avaliada por um único teste de Studet não pareado. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

2.4. p75NTR está parcialmente envolvido nos efeitos mediados pelo NGF na rede de proteínas do colesterol

Descobertas experimentais mostram que o NGF afeta o metabolismo do colesterol nas células do fígado através da ativação de seu receptor de baixa afinidade p75NTR [25]. Para testar se esta via de sinalização também pode ser preservada em células astrocíticas, tratamos o U373 com LM11A-31, um pequeno ligante que atua como um modulador específico de p75NTR. Este composto não ativa o TrkA, mas, semelhantemente ao NGF, provoca a indução de vias de sinalização a jusante do p75NTR [36]. LM11A-31 imitou o aumento de HMGCR mediado por NGF (Figura 3A).

Porém, não foram observadas alterações nas demais proteínas envolvidas no metabolismo do colesterol (Figura 3B-D), nem na quantidade de ApoE extracelular (Figura 3E) e colesterol (total, livre e ésteres) liberados no meio de cultura (Figura 3F ). Coletivamente, estes resultados indicam que a expressão de HMGCR induzida por NGF é mediada pela atividade de p75NTR, enquanto os efeitos sobre NPC1, ABCA1, secreção de ApoE e extrusão de colesterol são provavelmente dependentes de outras vias de transdução, possivelmente envolvendo TrkA.

Figura 2. Efeitos do NGF nos lipídios neutros e no conteúdo de colesterol. (A) Células U373 foram tratadas com veículo (Ctrl) ou NGF (100 ng/mL) por 48 h e depois coradas com Oil Red O para visualizar o conteúdo intracelular de lipídios neutros. n=3 experimentos diferentes. (B) Imagem representativa da coloração de filipina realizada em células U373 tratadas com veículo (Ctrl) e NGF (100 ng/mL) por 48 h. n=3 experimentos diferentes. (C) Quantificação dos níveis de colesterol intracelular (colesterol total, colesterol livre e ésteres de colesterol) em células U373 tratadas com veículo e NGF. n=3 experimentos diferentes. (D) Quantificação do colesterol (colesterol total, colesterol livre e ésteres de colesterol) no meio de cultura de células U373 tratadas com veículo (Ctrl) e NGF (100 ng/mL) por 48 h. n=3 experimentos diferentes. Os dados representam médias ± DP. A análise estatística foi realizada por meio do teste t de Student não pareado. **p<0.01.

Figura 3. Efeitos da modulação p75NTR por LM11A-31 no metabolismo e secreção do colesterol. (A – D) Western blot representativo e análise densitométrica de HMGCR, ABCA1, NPC1 e ApoE em células U373 tratadas com veículo (Ctrl) e LM11A-31 (00,1 μM) por 48 h. n=4 experimentos diferentes.

A vinculina serviu como uma proteína doméstica para normalizar a carga proteica. (E) Quantificação da quantidade de ApoE (µg/mL) por ensaio ELISA em meio de cultura de células U373 tratadas com veículo e LM11A-31-. n=3 experimentos diferentes. (F) Quantificação de colesterol (colesterol total, colesterol livre e ésteres de colesterol) no meio de cultura de células U373 tratadas com veículo (Ctrl) e LM11A-31 (00,1 μM) por 48 h. n=3 experimentos diferentes. Os dados representam médias ± DP. A análise estatística foi realizada utilizando um único teste de Studet não pareado. *** p < 0.001.

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