NGF modula o metabolismo do colesterol e estimula a secreção de ApoE nas células gliais, conferindo neuroproteção contra o estresse oxidativo - Parte 2

2.6. A secreção de ApoE mediada por NGF pelo U373 protege as células neuronais do insulto oxidativo

O acúmulo de evidências destaca que a ApoE aumenta a resiliência neuronal aos insultos oxidativos, prevenindo assim a apoptose e a neurodegeneração [17,18,37]. Nesse contexto, avaliamos se a secreção de ApoE induzida por NGF pelas células U373 poderia proteger os neurônios N1E-115 do estresse oxidativo. N1E-115 totalmente diferenciados foram pré-tratados com rotenona, que induz estresse oxidativo ao inibir o complexo mitocondrial I.

A apoptose é um processo de autodestruição e é uma forma importante para as células manterem a homeostase do corpo por meio da autodestruição programada sob certas circunstâncias. A apoptose desempenha diferentes papéis em diferentes fases da vida.

Estudos recentes mostraram que existe uma certa relação entre apoptose e memória. Já sabemos que a memória é um processo neural complexo no cérebro, envolvendo conexões e coordenação entre múltiplas regiões cerebrais. A apoptose pode desempenhar um papel neste processo neural.

Por um lado, a apoptose pode estabilizar a estrutura da rede dos neurônios, eliminando neurônios e sinapses desnecessários, tornando as conexões dos neurônios mais refinadas, melhorando assim a qualidade e a eficiência da memória. Por outro lado, a apoptose excessiva também pode levar à redução do número de células cerebrais, o que pode afetar negativamente o armazenamento e a captura de memórias.

Portanto, mantendo níveis adequados de apoptose, podemos melhorar a memória através de uma série de comportamentos e habilidades, como ler, aprender, fazer exercícios e ajustar nossa mentalidade. Esses comportamentos e habilidades podem promover o crescimento e a conexão das células cerebrais e melhorar a qualidade e a eficiência da memória, estimulando as conexões e a coordenação entre os neurônios cerebrais.

Concluindo, a relação entre apoptose e memória é complexa. Somente mantendo a apoptose adequada podemos estimular o nosso cérebro e melhorar a nossa memória através de uma série de comportamentos e habilidades. Deste ponto de vista, precisamos melhorar a nossa memória. Cistanche deserticola pode nos ajudar significativamente a melhorar a nossa memória, porque Cistanche deserticola também pode regular o equilíbrio dos neurotransmissores, como aumentar os níveis de acetilcolina e fatores de crescimento. Estas substâncias são importantes para a memória. É muito importante para aprender e aprender. Além disso, a carne da carne também pode melhorar a fluidez do sangue e promover o transporte de oxigênio, o que pode garantir que o cérebro receba nutrientes e energia suficientes, melhorando assim a vitalidade e a resistência do cérebro.

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Após 16 h de exposição à rotenona, os neurônios N1E-115 foram cultivados em meio fresco (Ctrl), meio condicionado de células U373 (U373-Ctrl), meio condicionado de U373 pré-tratado com NGF por 48 h (U373-NGF), ou meio condicionado de U373 silenciado por ApoE pré-tratado com NGF por 48 h (U373-siRNA ApoE NGF). O pré-tratamento com rotenona diminuiu fortemente o número de N1E-115 cultivados no meio de controle, indicando que a administração deste pesticida impacta gravemente a sobrevivência de N1E-115.

A citotoxicidade da rotenona também determinou intensa retração de neuritos, conforme observado pelo comprimento das neurites. O dano às neurites provocado pelo tratamento com rotenona foi particularmente evidente na avaliação de células portadoras de neurites, uma vez que o número de N1E-115 com neurites diminuiu para 50%. Resultados semelhantes foram obtidos quando células N1E-115 foram cultivadas em meio condicionado U373-Ctrl, sugerindo que a presença de sobrenadante derivado de astrócitos não estimulados não é suficiente para proteger as células neuronais da toxicidade mediada pela rotenona. Por outro lado, a aplicação de meio condicionado derivado de U373 tratado com NGF preveniu eficazmente a morte neuronal, bem como a redução nas células portadoras de neurites e no comprimento das neurites causada pela administração de rotenona (Figura 5).

Mais importante ainda, o meio condicionado derivado de células U373 silenciadas por ApoE perdeu completamente os efeitos benéficos induzidos pelo meio condicionado U373-NGF, indicando que a neuroproteção é impulsionada pela liberação de ApoE mediada por NGF no meio de cultura. Notavelmente, o meio condicionado de U373 tratado com NGF transfectado com siRNA mexido reteve totalmente os efeitos protetores exercidos pelo meio condicionado U373-NGF, demonstrando que a perda de neuroproteção observada no meio condicionado de células silenciadas por ApoE é efetivamente dependente de ApoE regulação negativa (Figura S3C).

Figura 5. Efeitos do meio condicionado U373 no estresse oxidativo em neurônios. Imagens representativas em campo claro e avaliação quantitativa da morfologia neuronal de N1E-115. As células foram previamente tratadas (+) ou não (-) com rotenona (0,1 µM) por 16 h, e depois cultivadas em DMEM fresco (Ctrl), em meio condicionado derivado do controle U373 (U{{ 9}}Ctrl), U373 pré-tratado com NGF (U373-NGF) e U373 pré-tratado com NGF silenciado para apoE (U373-siRNA ApoE NGF) por 48 h. n=5 experimentos diferentes. Os dados representam médias ± DP. A análise estatística foi avaliada por meio de ANOVA unidirecional, seguida pelo teste post hoc de Tukey. ** p < 0.01, *** p < 0,001.

Para fortalecer os resultados obtidos no meio condicionado, realizamos co-culturas U373/N1E115. Para começar, as células U373 foram pré-tratadas ou não com NGF durante 48 h. Além disso, células N1E-115 diferenciadas foram pré-tratadas ou não com rotenona por 16 h. Posteriormente, o meio U373 foi substituído por meio fresco contendo 00,5% de FBS, e as lamelas semeadas com N1E-115 foram transferidas para a camada U373 para preparar co-culturas (Figura 6A).

O dano oxidativo provocado pelo tratamento com rotenona afetou consideravelmente as células portadoras de viabilineurita e o comprimento da neurita do controle N1E-115 e N1E-115 co-cultivados com astrócitos U373-Ctrl (Figura 6B). Consistente com experimentos em meio condicionado, as células N1E-115 cocultivadas com células U373-NGF foram protegidas contra danos oxidativos, enquanto o silenciamento de ApoE em U373 aboliu a neuroproteção sustentada pelo NGF.

Figura 6. A secreção de ApoE pelas células U373 tratadas com NGF proporciona neuroproteção contra o estresse oxidativo. (A) Esquema representativo de coculturas astrócito-neurônio configuradas conforme descrito na seção Materiais e Métodos. As células portadoras de neurites, o comprimento das neurites e o número de células foram avaliados horas após o estabelecimento da co-cultura. (B) Imagens representativas em campo claro e avaliação quantitativa da morfologia neuronal de células N1E-115, previamente tratadas (+) ou não (-) com rotenona (0,1 μM) por 16 h.

N1E-115 foram então mantidos em DMEM fresco (Ctrl) ou co-cultivados com controle U373 (U373-Ctrl), U373 pré-tratado com NGF (U373-NGF) e U373 pré-tratado com NGF silenciado para ApoE (U373-siRNA ApoE NGF) por 48 h. n=5 experimentos diferentes. Os dados representam médias ± DP. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA unidirecional, seguida do teste post hoc de Tukey. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

3. Discussão

Desequilíbrios nas vias de sinalização das neurotrofinas, bem como alterações no metabolismo do colesterol cerebral, estão fortemente associados a doenças neurológicas e neurodegenerativas, como síndrome de Rett, DH, doença de Alzheimer (DA) e doença de Parkinson (DP) [2,38,39] . Neste contexto, a investigação fundamental sobre a actividade biológica das neurotrofinas é fundamental para dissecar os mecanismos moleculares que ligam o metabolismo do colesterol e a fisiopatologia cerebral. Durante os últimos anos, um estudo interessante relatou um papel do BDNF na regulação do metabolismo do colesterol em astrócitos [38].

Apesar desta noção, nenhuma informação está disponível sobre o suposto envolvimento do NGF na regulação do colesterol astrocítico. Portanto, neste trabalho, focamos no papel prospectivo exercido pelo NGF na regulação do metabolismo do colesterol, com particular referência à influência da secreção de ApoE na diferenciação e sobrevivência neuronal. U373, a linhagem celular de astrocitoma usada como modelo experimental de astrócitos humanos, mantém o potencial de responder totalmente ao NGF, pois expressa níveis apreciáveis ​​de TrkA e p75NTR.

Os principais resultados indicaram que o NGF regula positivamente os níveis das principais proteínas envolvidas na biossíntese do colesterol (HMGCR), no tráfego intracelular (NPC1) e na secreção (ABCA1). Esses eventos são acompanhados por um aumento simultâneo de ApoE e colesterol leino no meio de cultura, sugerindo que o NGF aumenta a biossíntese e a extrusão do colesterol das células gliais. Foi relatado que o NGF induz a expressão da proteína ApoE aumentando sua transcrição [40]. No entanto, não observamos nenhuma alteração significativa na expressão intracelular da ApoE. Esta aparente inconsistência pode ser explicada uma vez que o acúmulo de ApoE não pode ser apreciado devido ao seu efluxo aumentado de UIn tratada com NGF
Na tentativa de dissecar melhor os mecanismos moleculares, tratamos o U373 com o LM11A-31 e descobrimos que o modulador p75NTR só foi capaz de imitar o aumento na expressão de HMGCR mediado por NGF. O envolvimento do p75NTR na modulação dos níveis de HMGCR é consistente com dados anteriores obtidos em outros tipos de células, mostrando que este receptor controla a transcrição de enzimas colesterogênicas [41]. No entanto, o LM11A-31 não induziu nenhuma alteração nas demais proteínas analisadas neste estudo, incluindo ABCA1, nem nos níveis de colesterol e ApoE no meio de cultura, indicando que a modulação seletiva do p75NTR não é suficiente para promover o colesterol extrusão através de partículas ricas em ApoE observadas em células tratadas com NGF. Estes resultados levam-nos a supor que o NGF governa o metabolismo do colesterol nas células gliais através do envolvimento dos receptores p75NTR e TrkA.

É bem conhecido que a ligação da neurotrofina aos receptores Trk ativa o ERK1/2, regulando assim várias vias envolvidas na diferenciação, proliferação e sobrevivência celular [2,38]. Curiosamente, foi observado que a ativação de ERK1/2 também regula a expressão de ABCA1 e ApoE em diferentes tipos de células [38,42,43]. Esses achados, juntamente com a evidência de que o eixo BDNF/TrkB/ERK promove a extrusão de ApoE e a expressão de ABCA1 em células gliais [38], sugerem que uma via de transdução de sinal envolvendo o eixo TrkA/ERK pode explicar uma parte dos efeitos exercidos pelo NGF. em nosso estudo.

Embora nenhuma alteração tenha sido observada no crescimento de neuritos, o emprego de meio condicionado U373- e o estabelecimento de experimentos de co-cultura indicaram que o aumento da secreção de ApoE pelas células gliais mediada por NGF é determinante para prevenir os resultados prejudiciais induzidos por oxidação estresse nas células neuronais. Para induzir a citotoxicidade, empregamos rotenona, um pesticida comumente usado em pesquisas pré-clínicas para induzir espécies reativas de oxigênio (ROS) derivadas de mitocôndrias e subsequente apoptose (44).

Nossos resultados destacam que o NGF estimula a secreção de ApoE pelas células gliais, o que é necessário para garantir os efeitos neuroprotetores contra a administração de rotenona em células N1E-115 diferenciadas. O papel da ApoE na prevenção do estresse oxidativo está bem documentado. Por exemplo, a depleção de ApoE em modelos de camundongos exacerba a lesão oxidativa no tecido cerebral [45,46]. Consequentemente, a administração de ApoE exógena protege contra danos oxidativos irreversíveis do tratamento com peróxido de hidrogênio, neutralizando a toxicidade secundária do glutamato [18]. Além disso, as lipoproteínas contendo ApoE são eficazes na atenuação da apoptose induzida pela retirada do suporte trófico nos neurônios ganglionares da retina [47].

Em nosso estudo, o emprego da rotenona sugere que a neuroproteção mediada pela ApoE, promovida por células gliais estimuladas por NGF, pode ser relevante no contexto de condições neurodegenerativas como a DP. Notavelmente, a rotenona reproduz a degeneração neuronal dopaminérgica semelhante à observada na DP, tanto em modelos animais quanto em culturas de células, incluindo neurônios derivados de N1E-115- [48–50]. Coerentemente, nossos resultados apoiam evidências anteriores mostrando que a ApoE provoca neuroproteção após a administração de 6-hidroxidopamina (6-OHDA), outra neurotoxina capaz de induzir um fenótipo semelhante à DP (51). Coletivamente, nosso estudo demonstra que o NGF é um modulador crucial do metabolismo do colesterol e da extrusão de ApoE das células gliais. Mais importante ainda, o aumento na secreção de ApoE promovido por esta neurotrofina é necessário para assegurar a neuroproteção contra a citotoxicidade da rotenona.

O BDNF é a neurotrofina mais abundante no cérebro adulto. Apesar desta evidência, foi demonstrado que o NGF pode desempenhar um papel crucial não só durante o desenvolvimento, mas também no sistema nervoso central adulto. Por exemplo, o NGF influencia a atividade do hipocampo e, como consequência, a memória espacial e a aprendizagem [52]. Outras descobertas sugerem que o NGF exibe um efeito neuroprotetor nos neurônios dopaminérgicos nigroestriatais e que essa atividade pode estabelecer a base para novas abordagens terapêuticas baseadas em NGF para DP (53).

De acordo com esta noção, foi demonstrado que a produção de NGF é profundamente regulada nos astrócitos durante a idade adulta e exerce ações modulatórias na neuroinflamação, lesão cerebral e neurodegeneração [54–56]. Neste contexto, seria interessante avaliar, em estudos futuros, se estes efeitos poderiam ser mediados, pelo menos em parte, pela modulação do colesterol glial promovida pelo NGF. O presente trabalho apresenta algumas limitações que deverão ser superadas nas próximas investigações experimentais; por exemplo, seria importante dissecar melhor os mecanismos moleculares que ligam o tratamento com NGF e o metabolismo do colesterol nas células gliais.

Uma compreensão ampla é útil para identificar alvos moleculares específicos passíveis de manipulação farmacológica que poderiam ser empregados em contextos neurodegenerativos. Além disso, embora as células U373 e N1E-115 sejam amplamente utilizadas como linhas celulares gerenciáveis ​​para reproduzir respectivamente características astrocíticas e neuronais [27–29,57], essas descobertas devem ser confirmadas em culturas celulares primárias. Embora devam ser feitos mais esforços para fortalecer o envolvimento da sinalização da neurotrofina na homeostase do colesterol cerebral, este trabalho demonstra pela primeira vez que o NGF pode exercer indiretamente a neuroproteção, influenciando o metabolismo do colesterol glial.

4. Materiais e Métodos

4.1. Cultura de células

Células de neuroblastoma N1E-115 e células U373 foram cultivadas a 5% de CO2 em DMEM com alto teor de glicose (Merck Life Science, Milão, Itália), com 10% (v/v) de soro bovino fetal (FBS) (Merck Life Science , Milão, Itália) e adicionado de solução de penicilina/estreptomicina.

Para induzir a diferenciação neuronal, as células N1E-115 foram semeadas com 30% de confluência e foram trocadas para DMEM com 0,5% de FBS por 96 h.

Para induzir a diferenciação neuronal, as células N1E-115 foram semeadas com 30% de confluência e foram trocadas para DMEM com 0,5% de FBS por 96 h.

As coculturas de astrócitos-neurônios foram preparadas de acordo com o protocolo descrito por Ioannou e colegas, com modificações (59). Espaçadores de parafina foram pressionados sobre lamínulas para garantir aderência; usamos espaçadores em lamelas neuronais para prevenir eficientemente danos mecânicos quando as células foram colocadas uma de frente para a outra. As lamínulas foram então esterilizadas em etanol e revestidas com poli-D-lisina (Merck Life Science, Milão, Itália). N1E-115 foram semeados nas lamelas revestidas na densidade desejada e, uma vez prontos para a co-cultura, uma pinça estéril foi usada para levantar as lamelas com neurônios N1E-115 e colocá-las voltadas para baixo em { {10}}poços semeados com astrócitos U373.

Os pré-tratamentos em células N1E-115 foram realizados administrando 00,1 µM de rotenona (Sigma-Aldrich, Milão, Itália, R8875) por 16 h. As células controle receberam DMSO (diluição 1:1000 em meio de cultura celular) como veículo. Células U373 foram tratadas com NGF (Alomone Labs, Jerusalém, Israel, N-245) na dose de 100 ng/mL por 48 h em todos os experimentos.

4.2. Preparação de lisado e análise de Western Blot

As células U373 foram sonicadas (ciclo de trabalho 20%, saída 3) em tampão de amostra (0,1Tris-HClisHCl contendo 10% de SDS, coquetel inibidor de protease, pH 6,8) para obter um lisado total, como descrito anteriormente [ 60,61]. Tampão Laemmli foi adicionado e as amostras foram desnaturadas a 95 ◦C por 5 min. Extratos de proteínas (vinte microgramas de proteínas) foram resolvidos em SDS-PAGE, e a transferência para membrana de nitrocelulose foi realizada usando um sistema de transferência turbo trans-blot (Biorad Laboratories, Milão, Itália), como relatado anteriormente (62).

Posteriormente, a membrana foi incubada à temperatura ambiente durante 1 h com leite em pó desnatado a 5% em solução salina tamponada com Tris (Tris-HCl 25 mM, NaCl 138 mM, KCl 27 mM, 0,05% Tween{ {10}}, pH 6,8) e sondados durante a noite a 4 ◦C com os seguintes anticorpos primários: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA, sc-271708, diluição 1:500), anti- TrkA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA, sc-118, diluição 1:500), anti-SREBP-1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA, sc-8984 , diluição 1:1000), anti-SREBP-2 (Abcam, Cambridge, Reino Unido, ab30682, diluição 1:1000), anti-HMGCR (Abcam, Cambridge, Reino Unido, ab242315, diluição 1:1000), anti-LDLr (Abcam, Cambridge, Reino Unido, ab30532, diluição 1:500),anti-NPC1 (Novus Biologicals, Centennial, CO, EUA, NB400-148, diluição 1:3000 ), antiABCA1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA, sc-58219, diluição 1:400), anti-ApoE (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA, sc-53570, diluição 1 :400), antivinculina (SigmaAldrich, Milão, Itália, V9264, diluição 1:10.000) e anti- -actina (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA, sc-47778, diluição 1 :10.000).

As membranas foram sucessivamente incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com anticorpos secundários anti-murganho ou anti-coelho conjugados com HRP (Bio-Rad Laboratories, Milão, Itália). Os anticorpos ligados às proteínas foram visualizados por clareza ECL Western blotting (Bio-Rad Laboratories, Milão, Itália, # 1705061) e a quimiluminescência foi registada através do sistema ChemiDoc MP (Bio-Rad Laboratories, Milão, Itália). A análise densitométrica derivada de Western blots foi então realizada utilizando o software ImageJ versão 1.52t (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA) para Windows. Vinculina ou -actina foram usadas como proteínas de manutenção, que serviram como controles internos para carga de proteína. Os cálculos densitométricos foram obtidos como unidades arbitrárias, derivadas da razão entre a intensidade da banda proteica e a respectiva proteína doméstica.

4.3. Coloração com óleo vermelho O

Células U373 foram semeadas em lamelas revestidas com poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, P6282-5MG) em placas de 6-poços, e a coloração com óleo vermelho O foi realizada conforme relatado anteriormente (60). Resumidamente, as células foram fixadas em paraformaldeído (solução a 4%) durante 10 min e enxaguadas suavemente três vezes com PBS. As células fixadas foram incubadas com isopropanol a 60% durante 5 min e depois lavadas com água destilada. Posteriormente, as células foram sondadas com 1 mL de solução de trabalho Oil Red O (Sigma-Aldrich, O1391-250ML) por 15 min à temperatura ambiente, colocando a placa de poço 6-em um agitador rotador orbital. Após a incubação com a solução corante, os poços foram lavados três vezes com água destilada para eliminar o excesso de corante.

As lamínulas foram finalmente montadas com meio de montagem Fluoroshield (Sigma-Aldrich, F6182), e a autofluorescência Oil red O foi visualizada via microscopia confocal (TCS SP8; Leica, Wetzlar, Alemanha). As imagens foram capturadas usando Leica TCS SP8 equipado com ampliação de 63× e Software Leica LAS X (Milão, Itália). A quantificação da coloração Oil red O foi realizada através do software ImageJ para Windows e calculada como intensidade média de fluorescência por área celular.
4.4. Coloração Filipina

A coloração com filipina foi realizada utilizando o complexo Filipin (Sigma-Aldrich, F9765). A solução estoque de filipina (10 mg/mL em PBS) sempre foi preparada imediatamente antes do uso. As células foram fixadas em paraformaldeído (solução a 4%) durante 10 min e lavadas com PBS. U373 foram então corados com 1 mL de solução de trabalho de Filipina (0,05 mg/mL em PBS) por 1 h no escuro, em temperatura ambiente. Posteriormente, as células foram lavadas três vezes com PBS e as lamelas foram montadas com meio de montagem Fluoroshield e imediatamente analisadas através de microscopia confocal usando um conjunto de filtros UV (excitação de 340-380 nm). As imagens foram adquiridas com ampliação de 40X. A quantificação da filipina foi calculada como intensidade média de fluorescência por área celular usando o software ImageJ para Windows.

4.5. Quantificação de Colesterol

A quantificação do colesterol foi realizada utilizando um ensaio colorimétrico (Cholesterol Quantitation Kit, MAK043, Sigma-Aldrich, Milão, Itália) seguindo as instruções do fabricante.

4.6. ELISA
Os níveis de ApoE no meio de cultura foram avaliados utilizando o kit Human Apolipoprotein E ELISA (Abcam, Cambridge, UK, ab108813), de acordo com as instruções do fabricante.

4.7. Imunofluorescência

A imunofluorescência de células U373 foi executada conforme descrito anteriormente (60). U373 foram fixados em paraformaldeído (4% em PBS) e sondados durante a noite com anticorpos primários: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA, sc-271708, diluição 1:100) e anti-TrkA ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA, sc-118, diluição 1:100). Posteriormente, as células foram incubadas durante 1 h com anticorpo secundário de cabra anti-ratinho Alexa Fluor 555 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA, A28180) e com anticorpo secundário de cabra anti-coelho Alexa Fluor 488 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA , A27034). A coloração DAPI foi realizada para visualizar os núcleos e as lamelas foram finalmente montadas com um meio de montagem Fluoroshield. As amostras foram analisadas através de microscopia confocal, conforme descrito acima.

4.8. Silenciamento de ApoE

O silenciamento de mRNA de ApoE foi realizado em células U373 usando siRNA de ApoE (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA, sc-29708) de acordo com as instruções do fabricante. A transfecção foi estabelecida em uma placa de cultura de tecidos de 6-poços onde 100,{4}} células por poço foram semeadas em meio de crescimento livre de antibióticos DMEM suplementado com 10% de FBS por 24 h. Para cada poço, meio de transfecção de siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA, sc-36868) ​​foi adicionado à solução de reação de transfecção de siRNA, preparada usando duplex de siRNA e reagente de transfecção de siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA, sc29528). As células foram então lavadas uma vez com Meio de Transfecção de siRNA e cobertas com a mistura de transfecção previamente preparada. Posteriormente, a placa de cultura foi incubada por 7 horas a 37 ◦C em uma incubadora com 5% de CO2.

Meio de crescimento DMEM com 20% de FBS e antibióticos (2- vezes a concentração normal) foi adicionado à mistura de transfecção em cada poço com uma proporção de 1:1. As células foram incubadas durante 18 h e depois o meio foi descarregado e substituído por meio de crescimento normal fresco; 24 horas após esta última etapa, as células estavam prontas para serem utilizadas em novos experimentos. A eficiência do silenciamento da ApoE foi avaliada por RT-qPCR em células U373 e por ELISA no sobrenadante celular; O siRNA de ApoE preveniu eficientemente a indução de ApoE por NGF se comparado ao siRNA embaralhado (mRNA de ApoE: diminuição de 83%; ELISA de ApoE: diminuição de 78%). Notavelmente, a expressão de ApoE após silenciamento de siRNA foi inferior aos níveis de expressão basal observados no controle U373 (mRNA de ApoE: diminuição de 72%; ELISA de ApoE: diminuição de 58%) (Figura S 3A, B).

4.9. Extração de RNA e PCR em tempo real

A análise de mRNA foi realizada conforme relatado anteriormente [22,63]. Resumidamente, o RNA total das células U373 foi extraído com o reagente TRI (Merck Life Science, Milão, Itália) de acordo com as instruções do fabricante. O tratamento com DNAse (Ambion, Thermo Fisher Scientific, Milão, Itália) foi realizado e depois o RNA foi purificado usando um kit de limpeza de RNA (Zymo, Itália). O RNA foi sucessivamente transcrito reversamente em cDNA através de um kit de células de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (Applied Bio-System, Foster City, CA, EUA) e usado para análise de qPCR.

Os primers usados ​​​​em qRT-PCR para apoE foram: direto 5 0 -GGGTCGCTTTTGGGATTACCTG-30 e reverso 50 -CAACTCCTTCATGGTCTCGTCC3 0. Primers usados ​​em qRT-PCR para gapdh (escolhido como gene de referência) foram: direto 50 - GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-30 e reverso 50 -ACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-30. A produção do amplicon correto foi avaliada pela avaliação da curva de fusão. Cada amostra biológica foi analisada em triplicado com o reagente SYBR green IQ (Bio-Rad Laboratories, Milão, Itália) e utilizando o sistema de detecção CFX Connect (Bio-Rad Laboratories, Milão, Itália).

4.10. Avaliação quantitativa da morfologia neuronal

A morfologia neuronal em células N1E-115 foi estimada pela captura de imagens com um microscópio invertido. A análise morfométrica foi realizada através do software ImageJ para Windows, e foram estimados o número de células totais (expresso como variação percentual do controle), comprimento médio de neuritos (expresso como percentual do controle) e células portadoras de neuritos. Para células portadoras de neurites, a percentagem foi calculada dividindo o número de células diferenciadas pelo número total de células por campo. N1E-115 eram devas diferenciados quando possuíam pelo menos uma neurite a com comprimento igual ou maior que o diâmetro do soma. A avaliação morfológica foi realizada em pelo menos cinco experimentos independentes, nos quais foram analisadas pelo menos três imagens.

4.11. Análise Estatística

Todos os resultados apresentados neste estudo foram expressos como média ± DP (desvio padrão, a distribuição normal dos dados foi verificada pelo teste de Shapiro-Wilk. Quando dois grupos experimentais foram comparados, foram aplicados testes não pareados. Porém, quando três ou mais grupos foram comparados, foram aplicados testes não pareados. foram comparados, foi empregada análise de variância (ANOVA) unidirecional seguida de teste post hoc de Tukey. Nos experimentos com rotenona, onde duas variáveis ​​estavam presentes, foi utilizada ANOVA bidirecional seguida de pós-teste de Bonferroni. p < 0.05 foram considerados estatisticamente diferentes. A análise estatística foi realizada utilizando o GraphPad Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA, EUA) para Windows.

Contribuições do autor:

Conceituação, MS; metodologia, MS e MC; validação, MS e MC; análise formal, MS, MC, DP e MP; investigação, MC, NM, LL, MP e DP; recursos, MS e VP; curadoria de dados, MS e MC; redação – preparação do rascunho original, MS e MC; redação – revisão e edição, MP, LL, DP, NM e VP; visualização, MS, MC e MP; supervisão, MS; administração de projetos, MS; aquisição de financiamento, MS Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento:

Esta pesquisa foi financiada pelos Fundos para Pesquisa Departamental 2021 (Universidade de Molise) para MS, e pela chamada da Fundação Jerome Lejeune para sessão de subsídios 2021a, #2043 para MS

Declaração do Conselho de Revisão Institucional:

Não aplicável.

Declaração de consentimento informado:

Não aplicável.

Declaração de disponibilidade de dados:

Não aplicável.

Agradecimentos:

Agradecemos a Claudia Tonini pela ajuda na dosagem de colesterol

Conflitos de interesse:

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Referências

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