Potencial neuroprotetor de isotiocianatos em um modelo in vitro de neuroinflamação

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Tiziana Latronico1 · Marilena Larocca2 · Serafna Milella1 · Anna Fasano1 · Rocco Rossano2 · Grazia Maria Liuzzi1

Recebido: 10 de julho de 2020 / Aceito: 25 de outubro de 2020 / Publicado online: 16 de novembro de 2020

© O(s) Autor(es) 2020

Função de pó de ervas Cistanche: tem um muito bomefeito neuroprotetor

Abstrato

Os isotiocianatos (ITCs), presentes como precursores de glucosinolatos em vegetais crucíferos, têm demonstradoanti-inflamatório, atividade antioxidante e anticancerígena. Aqui, comparamos os efeitos de três ITCs diferentes na produção de ROS e na expressão de matriz metaloproteinase (MMP)-2 e -9, que representam importantes fatores patogênicos de várias doenças neurológicas. Culturas primárias de astrócitos de ratos foram ativadas por LPS e tratadas simultaneamente com diferentes doses de isotiocianato de alila (AITC), 2-isotiocianato de fenetila (PEITC) e 2-sulforafano (SFN). Os resultados mostraram que SFN e PEITC foram capazes de neutralizar a produção de ROS induzida por H2O2. A análise zimográfica de sobrenadantes de culturas celulares evidenciou que PEITC e SFN foram os inibidores mais eficazes de MMP-9, enquanto apenas SFN inibiu significativamente a atividade de MMP-2. A análise de PCR mostrou que todos os ITCs usados ​​inibiram significativamente a expressão de MMP-2 e MMP-9. A investigação sobre a via de sinalização da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) demonstrou que as ITCs modulam a transcrição de MMP inibindo a atividade da proteína quinase regulada extracelular (ERK). Os resultados deste estudo sugerem que os ITCs podem ser agentes nutracêuticos promissores para a prevenção e tratamento complementar de doenças neurológicas associadas ao envolvimento de MMP.

Palavras-chaveAntioxidante · Anti-inflamatório · Isotiocianato · Metaloproteinases de matriz · Doenças neurodegenerativas

Introdução

A neuroinflamação é uma resposta complexa à lesão cerebral envolvendo uma cascata de eventos bioquímicos que levam à ativação de células residentes do sistema nervoso central (SNC). A ativação aberrante dos astrócitos compromete seu papel neuroprotetor levando à liberação de mediadores inflamatórios, como espécies reativas de oxigênio (EROs), óxido nítrico (NO), citocinas, quimiocinas e metaloproteinases de matriz

(MMP).

As MMPs são uma grande família de endopeptidases neutras dependentes de Zn2 plus que têm como alvos principais os componentes da matriz extracelular (ECM), como fibronectina, colágeno, elastina e laminina (Latronico e Liuzzi 2017).

Tiziana Latrônico

tiziana.latronico@uniba.it

Departamento de Biociências, Biotecnologias e Biofarmacêutica, Universidade de Bari "Aldo Moro",

Bari, Itália

Departamento de Ciências, Universidade de Basilicata, Potenza,

Itália

No SNC, as MMPs estão envolvidas em várias respostas fisiológicas, como morfogênese, renovação e remodelação da MEC, embriogênese e reparo de feridas; no entanto, quando as MMPs escapam dos mecanismos reguladores, tornam-se prejudiciais (Rosenberg 2009; Agrawal et al. 2008).

A este respeito, sabe-se que alterações na expressão e atividade de MMP são eventos patogenéticos chave em vários distúrbios neurológicos (Latronico e Liuzzi 2017; Mastroianni e Liuzzi 2007; Brkic et al. 2015). Evidências experimentais sugerem que entre as MMPs, as gelatinases A (MMP-2) e B (MMP-9) estão particularmente envolvidas na neuroinflamação, uma vez que sua regulação positiva pode comprometer a integridade da barreira hematoencefálica (BHE). Isso leva ao aumento do recrutamento e infiltração de células imunes do sangue periférico no parênquima cerebral, perpetuando o processo inflamatório que é a causa da perda neuronal progressiva e da função neuronal prejudicada (Rivest 2009). Vários estudos in vitro e in vivo mostraram que a produção de ROS é um dos fatores envolvidos na regulação positiva da expressão de MMP-9 em células cerebrais via mecanismos dependentes da via de sinalização da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) (Hsieh e Yang 2013).

Com base nessas evidências, fica claro que a regulação negativa de fatores neurotóxicos, resultando em respostas neuroinflamatórias reduzidas, pode representar uma estratégia terapêutica eficaz para prevenir o aparecimento ou aliviar a progressão de doenças cerebrais.

Nos últimos anos, o interesse biomédico no campo neurológico está cada vez mais voltado para a pesquisa de compostos naturais capazes de modular os processos associados às respostas neuroinflamatórias. Nesse sentido, vários estudos têm demonstrado que compostos fitoquímicos, como polifenóis, isotiocianatos (ITCs), entre outros, possuem potencial neuroprotetor que também deriva de sua capacidade de inibir a expressão de MMPs e neutralizar a produção de ROS (Dinkova-Kostova e Kostov 2012; Liuzzi et al. 2007, 2011).

Os isotiocianatos são metabólitos produzidos por várias plantas pertencentes às famílias Brassicaceae como sistema de defesa contra o ataque de patógenos (Bones e Rossiter 2006). Originam-se da degradação enzimática dos glucosinolatos (GSL) pela enzima mirosinase. As ITCs estão presentes em vegetais crucíferos comumente consumidos, como brócolis, couve de Bruxelas, repolho, nabo, rábano, couve-rábano, mostarda, rabanete, agrião e couve. Suas quantidades nos alimentos são muito variáveis ​​e dependentes do processamento e preparação dos alimentos.

Recentemente, tem-se mostrado que os ITCs possuem uma variedade de efeitos terapêuticos, incluindo ação antioxidante, antibacteriana, anti-inflamatória e quimiopreventiva (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015).

A atividade protetora das ITCs é realizada através da modulação de diferentes vias de sinalização envolvidas na desintoxicação, inflamação, apoptose e regulação do ciclo celular. Várias evidências indicam que as propriedades anticancerígenas e anti-inflamatórias das ITCs podem ser atribuídas principalmente à sua capacidade de ativar a via do fator nuclear eritróide 2-relacionado ao fator 2 (Nrf2). O Nrf2 é um fator transcricional redox-sensível que na presença de agentes eletrofílicos e condições de estresse oxidativo se transloca para o núcleo onde se liga aos elementos de resposta antioxidante (ARE), induzindo a expressão de genes citoprotetores envolvidos na desintoxicação e na modulação de condições oxidativas e processos inflamatórios (Heiss et al 2001). A este respeito, foi relatado que as ITCs são capazes de aumentar a capacidade antioxidante das células humanas induzindo a expressão de enzimas desintoxicantes de fase II e pela regulação positiva da produção de GSH (Wagner et al 2010). Além disso, foi relatada a existência de uma conversa cruzada entre Nrf2 e a via do fator nuclear (NF)-κB que resulta na modulação da inflamação (Sturm e Wagner 2017; Lee e Johnson 2004). A este respeito, vários modelos experimentais in vitro e in vivo de neuroinflamação demonstraram que as ITCs são capazes de diminuir significativamente a translocação de NF-κB com a consequente inibição de citocinas pró-inflamatórias e MMPs (Lee et al. 2015; Subedi et al. 2017).

Neste artigo, investigamos o efeito de três ITCs, ou seja, isotiocianato de alila (AITC), 2-isotiocianato de fenetil (PEITC) e 2-sulforafano (SFN) na liberação de MMP-2 e -9 bem como na produção de ROS por astrócitos ativados por LPS. Nossos resultados evidenciaram que PEITC, SFN e AITC são capazes de inibir in vitro a expressão de MMP-9 e MMP-2 em astrócitos ativados por LPS e neutralizar a produção de ROS induzida por H2O2. Além disso, demonstramos que as ITCs modulam a superexpressão de MMPs com mecanismos relacionados à inibição da atividade da proteína quinase regulada extracelular (ERK). Esses resultados sugerem que uma dieta rica em vegetais crucíferos pode ter benefícios potenciais para a prevenção e tratamento complementar de doenças neurológicas.

Materiais e métodos

Produtos químicos e reagentes

O meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), soro bovino fetal (FBS), penicilina e estreptomicina foram fornecidos por GIBCO (Paisley, Escócia). Gelatina, DNase 1, poli-L-lisina

(PLL), tripsina, lipopolissacarídeo (LPS), azul de tripano e 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2.5-brometo de difeniltetrazólio (MTT ), isotiocianato de alilo (AITC) [cod. 377.430, pureza 95 por cento (HPLC)], 2-isotiocianato de fenetilo (PEITC) [cod. 253.731, pureza 99 por cento )], 2-Sulforafano (SFN) [cod. S6317, pureza superior ou igual a 95 por cento (HPLC)] foram fornecidos pela Sigma (St. Louis, MO, EUA). O diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína (DCFH-DA) foi adquirido de Calbiochem. As proteínas padrão e R-250 Coomassie Brilliant Blue foram da Bio-Rad (Hercules, CA, EUA). Anticorpos antiproteína ácida fibrilar glial (GFAP) (RRID: AB_2294571) foram adquiridos da Serotec (Oxford, Reino Unido). Anticorpos contra proteínas quinases reguladas extracelularmente (ERK) 1/2 e ERK 1/2 fosforilada (p-ERK 1/2) foram da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Membranas Hybond-P PVDF, sistema de análise de Western Blotting por quimioluminescência aprimorada (ECL) e anticorpo secundário anti-HRP de camundongo foram da GE

Ciências da Vida em Saúde (Little Chalfont, Buckinghamshire,

O Reino Unido). Os pares de primers específicos para MMP-2, MMP-9 e 18S rRNA eram da Sigma Genosys (Cambs, Reino Unido). O mini kit RNeasy e o kit QuantiTect Reverse Transcription foram adquiridos da Qiagen (Valencia, CA, EUA). Os reagentes Econo-Taq PLUS GREEN 2X Master Mix para PCR foram adquiridos da Lucigen Corporation (Middleton, WI, EUA).

Declaração de ética

Os experimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com as recomendações do NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e com aprovação do Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Bari, Itália (Permit Number: 23-98- UMA).

Preparação de culturas de astrócitos

Os astrócitos foram preparados a partir de tecidos neocorticais de {{0}}ratos Wistar de um dia (RRID: RGD_737960, Harlan Laboratories srl, Udine, Itália). Para a preparação dos astrócitos foram utilizadas 6 ninhadas de 12 filhotes, cada um de ambos os sexos. Os animais foram eutanasiados por exposição ao dióxido de carbono (CO2) e mortos por decapitação rápida. Os tecidos neocorticais foram dissecados e usados ​​para purificação de culturas de células gliais primárias seguindo o método relatado por Latronico et al. (2018). Resumidamente, após a dissecção, cérebros de ratos foram esgotados de meninges e vasos sanguíneos, picados mecanicamente e digeridos com 0 0,25 por cento de tripsina na presença de 0 0,01 por cento de DNase. Após centrifugação e avaliação da viabilidade celular, as células foram plaqueadas em frascos revestidos com PLL (75 cm2) a uma densidade de 1,5 × 107 células/frasco em DMEM, 10 por cento de FBS, 100 UI mL-1 penicilina, 100 µg mL-1 estreptomicina , e mantido a 37 graus em um CO2 de 5 por cento. Após 7 dias, os frascos foram agitados para remover oligodendrócitos e microglia. A pureza dos astrócitos, obtida por tripsinização (0,25 por cento de tripsina/0,02 por cento de EDTA), foi avaliada por imunocoloração para GFAP.

Tratamento de astrócitos ativados por LPS com isotiocianato de alilo, isotiocianato de fenetilo ou 2-sulforafano

Astrócitos confluentes, semeados em placas de 96 poços, foram estimulados com 10 µg mL −1 de LPS e tratados simultaneamente com diferentes concentrações de isotiocianato de alila (AITC), 2-isotiocianato de fenetila (PEITC) ou 2-sulforafano (SFN) em DMEM sem soro. Astrócitos em DMEM sem soro e astrócitos ativados por LPS representaram controles negativos e positivos, respectivamente. Além disso, uma vez que as soluções estoque de AITC (100 µM), PEITC (67 µM) e SFN (56,4 µM) foram feitas em DMSO, uma curva dose-resposta para DMSO, diluída em meio de cultura na mesma concentração de solvente presente em as amostras analisadas, foi executado para estimar a toxicidade do composto. Após 20 h de incubação a 37 graus, 5 por cento de CO2, os sobrenadantes foram coletados e armazenados a -20 grau até o uso, enquanto as células foram submetidas ao ensaio MTT para avaliar a viabilidade celular.

Ensaio de viabilidade celular MTT

A citotoxicidade de AITC, PEITC e SFN em astrócitos foi detectada usando o MTT [{{0}}(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,{{5 }}brometo de difenil tetrazólio]. Este ensaio baseia-se na redução do MTT pela succinato desidrogenase mitocondrial em células viáveis, a um produto azul formazan insolúvel que pode ser medido espectrofotometricamente. Resumidamente, após tratamento por 20 h com AITC, PEITC ou SFN, o meio de cultura foi removido e as células foram carregadas com 0,5 mg mL−1 de MTT. Após incubação por 2 h a 37 graus, 5 por cento de meio CO2 foi removido e os cristais de formazan nas células foram solubilizados com 90 por cento de etanol. Após agitação das placas por 15 min para obter a solubilização completa dos cristais, a quantidade do produto formazan foi determinada por absorbância óptica a 560 nm com comprimento de onda de referência de 690 nm. A viabilidade celular foi expressa como uma porcentagem de controle (CTRL), representada por células não tratadas, que foi fixada em 100 por cento. Para cada composto, foi obtida uma curva dose-resposta de viabilidade celular.

Detecção de espécies reativas de oxigênio

A detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) foi realizada carregando astrócitos com 10 μM de diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína (DCFH-DA) em DMEM sem vermelho de fenol a 37 graus por 30 min. Em seguida, o DCFH-DA foi removido dos poços e as células foram tratadas por 1 h com AITC (400 μM), PEITC (10 μM) ou SFN (25 μM) em DMEM sem vermelho de fenol na presença de H2O2 na concentração final de 100 μM . As células tratadas apenas com DCFH-DA ou com H2O2 representaram os controles negativo (CTRL) e positivo (H2O2), respectivamente. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS e lisadas com

Tris–HCl 10 mM/NaCl 150 mM/Triton X-100 0,5 por cento, pH 7,5,

depois centrifugado a 10,000×g, 4 graus por 10 min. Os sobrenadantes foram coletados e sua análise espectrofluorimétrica foi realizada em 525 nm sob excitação em 485 nm. Os resultados foram normalizados para o teor de proteína total e a produção de ROS foi expressa como uma porcentagem relativa da intensidade de fotoluminescência (PL) versus controle positivo.

Detecção de gelatinases

A atividade de gelatinase em sobrenadantes de células (SNs) foi detectada por análise zimográfica conforme relatado por Latronico et al. (2013). Resumidamente, uma quantidade de SN, correspondente a cerca de 10 µg de proteínas totais, foi solubilizada com 30 µl de tampão de amostra Laemmli sem -mercaptoetanol. As amostras foram processadas num gel de poliacrilamida a 7,5 por cento copolimerizado com gelatina a 0,1 por cento (p/v). Após a corrida eletroforética, os géis foram lavados duas vezes com 2,5 por cento Triton X-100/10 mM CaCl2 em 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 e incubados por 24 h a 37 graus em 1 por cento Triton X-100 /50 mM Tris-HCl/10 mM CaCl2, pH 7,4. Os géis foram corados com azul brilhante de Coomassie R-250 e descorados em metanol/ácido acético/H2O (4:1:5 v/v). A atividade da gelatinase foi visualizada como uma banda clara de digestão em um fundo azul do gel e foi quantificada por análise de imagem densitométrica computadorizada usando o software Image LabTM (Bio-Rad Laboratories). Gelatinase

a atividade foi expressa como densidade óptica (DO) × mm2, representando a área de varredura sob as curvas que levam em consideração tanto o brilho quanto a largura da zona de lise do substrato. Os dados foram expressos usando a seguinte equação: porcentagem de inibição=[100 − (amostra de DO/controle positivo de DO) × 100].

Reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR)

Os astrócitos, semeados em placas de 6 poços, foram ativados com LPS (10 µg mL−1) e tratados simultaneamente com ITCs na concentração máxima não tóxica. Após 20 h de incubação, o RNA total foi extraído dos astrócitos usando o mini kit Qiagen RNeasy de acordo com as instruções do fabricante. O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado a partir de 500 ng de RNA usando o kit QuantiTect Reverse Transcription de acordo com as instruções do fabricante. Um total de 25 ng de produtos de transcrição reversa foi usado para amplificar um fragmento de 591 pb usando primers específicos (sense 5'-GTC ACT CCG CTG CGC TTT TCT CG-3''; antisense 5'-GAC ACA TGG GGC ACC TTC TGA-3′) para a sequência de MMP-2 de rato e um fragmento de 541 pb usando primers específicos (sense 5'-CGG AGC ACG GGG ACG GGT ATC 3'; anti-sense 5'-AAG ACG AAG GGG AAG ACG CAC ATC 3') para a sequência MMP-9 de rato. Em paralelo, foi realizada a amplificação de um fragmento de 308 pb de rRNA 18S de rato (sense 5'-GCCTAGATA CCGCAGCTAGGA-3'; antisense 5'-TCATGGCCTCAG TTCCGAA-3'), um gene de referência interna relativamente invariável. . Os conjuntos de primers, já validados em outros estudos (Latronico et al. 2013; Liuzzi et al. 2004; Gramegna et al. 2011) reconhecem especificamente apenas os genes de interesse conforme indicado pela amplificação de uma única banda do tamanho esperado da PCR produtos. A amplificação por PCR foi realizada por 25 ciclos cada um consistindo de desnaturação a 94 graus , anelamento a 59 graus e extensão a 72 graus . Após a amplificação, os produtos foram analisados ​​em géis de agarose 1,5 por cento. Após a análise densitométrica dos géis, a amplificação dos genes alvo foi normalizada para a expressão de 18S rRNA, e os resultados foram expressos como porcentagem de inibição em comparação ao controle positivo conforme relatado para quantificação de gelatinase.

Detecção de fosforilação de ERK 1/2 por análise de Western blot

ERK 1/2 foram detectados por análise de immunoblot conforme relatado em Latronico et al. (2018). Resumidamente, primário confluente

astrócitos plaqueados em placas de {{0}}poços, quiescentes em meio sem soro por 24 h, foram pré-tratados por 1 h com AITC (400 μM), PEITC (10 μM), ou SFN (25 μM) em DMEM sem vermelho de fenol. Após estimulação por 2 h com 10 ug mL-1 de LPS, as células foram lisadas com 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2,5 mM Na-pirofosfato, 1 mM -glicerofosfato 1 por cento Triton X-100, 1 mM fenilmetilsulfonil fuoreto, 20 ug/mL de aprotinina, 1 mM de EGTA, 1 mM de Na-fuoreto, 1 mM de Na3VO4, pH 7,5. Sessenta µg de proteínas totais de cada amostra foram resolvidas por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida a 10% e as proteínas foram então imunotransferidas em membranas de difluoreto de polivinilideno. Após o bloqueio durante a noite a 4 graus com 0,05 por cento de Tween 20, 1 por cento de leite, 1 por cento de albumina de soro bovino em 150 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), as membranas foram sondadas durante a noite a 4 graus com um anti-p- monoclonal anticorpo ERK 1/2 (1:500). Em seguida, as membranas foram lavadas três vezes com Tween 20 a 0,05 por cento em solução salina tamponada com Tris, sondadas com anticorpo secundário anti-peroxidase de rábano de camundongo (1:20,000) por 2-h a 24 graus e detectadas com quimioluminescência aumentada. Para avaliar a quantidade total de ERK, as membranas foram retiradas e incubadas com um anticorpo específico para ERK 1/2 não fosforilada (1:500). As intensidades das bandas foram quantificadas por varredura densitométrica de blots e os níveis de fosforilação de ERK 1/2 foram normalizados para ERK 1/2 não fosforilada e expressos em porcentagem em comparação com o controle positivo (astrócitos tratados com LPS), de acordo com a seguinte equação:

por cento perERK 1/2=(amostra OD/controle ODpositivo) × 100.

Análise estatística

A análise dos dados foi realizada usando o GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Os dados foram expressos como valores médios ± DP. A análise estatística foi realizada por meio de análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de comparação múltipla de Dunnett.

Resultados

Efeito de compostos de isotiocianato na viabilidade de astrócitos

Experimentos preliminares foram realizados para avaliar a citotoxicidade de AITC, PEITC ou SFN. Para tanto, astrócitos purificados foram tratados por 20 h com os compostos ITC em concentrações variando entre 5 e 400 µM ou com DMSO diluído em meio de cultura conforme descrito na Seção de Métodos. Conforme mostrado na Fig. 1, o DMSO não foi tóxico em todas as concentrações usadas que correspondem às das soluções de ITC testadas. Entre os ITCs investigados, o AITC

Fig. 1 Viabilidade celular de astrócitos tratados com compostos isotiocianatos. Astrócitos primários confluentes foram tratados por 20 h com isotiocianato de alilo (AITC), 2-isotiocianato de fenetil (PEITC) ou 2-sulforafano (SFN) nas concentrações indicadas e então submetidos ao ensaio MTT. Além disso, uma vez que as soluções estoque foram dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO), uma curva dose-resposta para DMSO, diluída em meio de cultura na mesma concentração de solvente (porcentagem) presente nas amostras de ITC foi executada em cada experimento para obter uma estimativa confiável da toxicidade do ITC. O controle (CTRL) foi representado

perfumado de astrócitos não tratados em DMEM sem soro. Os gráficos representam as curvas de dose-resposta de viabilidade celular, expressas como porcentagem de sobrevivência celular em comparação com o controle. As doses dos compostos que determinaram a viabilidade celular acima de 60% foram escolhidas como as concentrações máximas não tóxicas. Os valores são média ± SD de n=3 experimentos realizados em diferentes populações de células. As micrografias mostram resultados representativos da morfologia celular observados sob um microscópio de contraste de fase (ampliação de 50X) após o tratamento com os diferentes compostos

foi o menos tóxico para os astrócitos. Em particular, AITC não foi tóxico para células até 400 µM enquanto PEITC e SFN foram tóxicos em concentrações acima de 10 e 25 µM, respectivamente. A observação microscópica confirmou os resultados do ensaio MTT mostrando que nas concentrações tóxicas de PEITC e SFN, os astrócitos foram reduzidos em número e os que permaneceram apresentaram alterações citotóxicas em seu citoplasma.

Efeito protetor dos compostos ITC na produção de ROS em astrócitos tratados com peróxido de hidrogênio

Para avaliar o efeito protetor dos ITCs contra o estresse oxidativo, os astrócitos foram pré-tratados com PEITC, AITC e SFN na concentração máxima não tóxica e depois estimulados com H2O2. A produção intracelular de ROS, induzida por H2O2, foi avaliada por DCFH-DA. Conforme mostrado na Fig. 2, a exposição ao H2O2 aumentou o sinal fluorescente em

Fig. 2 Produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em astrócitos tratados com ITCs. A presença de ROS foi testada medindo as alterações do sinal fluorescente de 2',7'-diclorofluoresceína (DCFA), conforme relatado na seção Materiais e Métodos. Os astrócitos, semeados em placas de 6 poços, foram pré-tratados por 30 min com DCFA e depois tratados por 1 h com 10 μM de PEITC, 400 μM de AITC ou 25 μM de SFN na presença de H2O2 na concentração final de 100 μM . Astrócitos tratados apenas com DCFA (CTRL) ou com 100 μM de H2O2 representaram controle negativo e positivo, respectivamente. O sinal fluorescente detectado nos lisados ​​celulares foi medido por um fluorômetro a 525 nm sob excitação a 485 nm. A produção de ROS foi expressa em porcentagem ( por cento ) da intensidade de fotoluminescência (PL) em comparação ao controle positivo. Os valores são média ± SD de n=3 experimentos realizados em diferentes populações de células. A diminuição estatisticamente significativa em comparação com H2O2 é indicada por asteriscos (ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Dunnet; *p <>

astrócitos em comparação com o controle (CTRL). Conforme evidenciado pela diminuição da intensidade de fluorescência do DCF, o pré-tratamento de astrócitos com compostos de ITC neutralizou a geração de ROS induzida por H2O2. Entre os ITCs testados, apenas PEITC e SFN foram capazes de reduzir significativamente a produção de ROS em cerca de 20 e 24 por cento, respectivamente, em comparação com um controle positivo (H2O2).

Os compostos de isotiocianato inibem os níveis de MMP-2 e MMP-9 em astrócitos ativados por LPS

O efeito dos compostos ITC nos níveis de MMP-2 e MMP-9 foi avaliado em astrócitos ativados com LPS, que é conhecido por induzir a expressão de gelatinases (Gottschall e Deb 1996), e tratados simultaneamente com AITC, PEITC, ou SFN na faixa de concentrações que não eram tóxicas para as células. Conforme mostrado na Fig. 3a, duas bandas claras de digestão de 72 e 92 kDa estavam presentes no gel correspondendo, respectivamente, a MMP-2 e MMP-9. A ativação de astrócitos com LPS aumentou os níveis de MMP-2 e induziu a síntese de MMP-9. O tratamento com AITC (Fig. 3b), PEITC (Fig. 3c) ou SFN (Fig. 3d) determinou uma dose dependente

redução dos níveis de MMP-9, que variavam de acordo com o composto utilizado. Em particular, entre os ITC usados, o SFN foi o mais eficaz na inibição de MMP-9, pois determinou 70 por cento de inibição na dose de 10 μM e 100 por cento de inibição na dose de 25 μM. Além disso, apenas SFN na concentração máxima não tóxica foi capaz de inibir significativamente MMP-2 (Fig. 2d).

Os compostos de isotiocianato inibem a expressão dos genes MMP-2 e MMP-9 em astrócitos ativados por LPS

Para determinar se os compostos de ITC estudados foram capazes de inibir a expressão de MMP-2 e MMP-9, RT-PCR foi realizado em astrócitos ativados por LPS tratados com a concentração máxima não tóxica de ITCs. Conforme mostrado nos géis representativos na Fig. 4a, o tratamento de astrócitos ativados por LPS com os ITCs individuais foi capaz de neutralizar o aumento da expressão de MMP-2 e MMP-9 mRNA. Conforme mostrado na Fig. 4b, a análise quantitativa dos resultados evidenciou que, na concentração máxima não tóxica, os compostos ITC determinaram uma inibição estatisticamente significativa da expressão de MMP-2 e MMP-9 em comparação para um controle positivo (LPS). Em particular, PEITC e SFN exercem a mesma porcentagem de inibição em MMP-2 (85 por cento) e MMP-9 (100 por cento), enquanto AITC foi menos eficaz que PEITC e SFN na inibição de MMP{{17} } (65 por cento ) e expressão MMP-9 (90 por cento ).

ERK 1/2 está envolvido na inibição da expressão de MMP por ITC

Uma vez que ERK 1/2 é a principal via de transdução de sinalização envolvida na regulação da expressão de MMP-2 e MMP-9 em astrócitos ativados por LPS (Lee et al. 2003), o efeito dos compostos ITC na a ativação de proteínas quinases reguladas extracelularmente (ERK) 1/2 foi testada.

Conforme mostrado na Fig. 5, o LPS induziu um aumento estatisticamente significativo nos níveis de ERK 1/2 fosforilado (p-ERK) que foi neutralizado pelo pré-tratamento com os compostos de ITC.

Discussão

Acredita-se que as principais estratégias de defesa contra muitas doenças consistem principalmente em evitar fatores de risco e adotar um estilo de vida correto. Existem inúmeras evidências científicas que sustentam a hipótese de que alguns metabólitos naturais, tipicamente produzidos por vários tipos de frutas e vegetais, são capazes de modular fenômenos patológicos como câncer, doenças neurológicas e outras doenças multifatoriais. Nesse cenário, os isotiocianatos (ITCs) despertaram grande interesse por suas propriedades antifúngicas, antibacterianas,

Fig. 3 Efeito de compostos de isotiocianato nos níveis de MMP-2 e MMP-9 em astrócitos ativados por LPS. Em a é relatado um gel zimográfico representativo da análise de sobrenadantes de cultura de astrócitos ativados com LPS (10 ug mL-1) e tratados simultaneamente por 20 h com AITC, PEITC ou SFN nas concentrações indicadas (μM). Controles negativos e positivos foram obtidos de astrócitos não estimulados e não tratados em meio sem soro (CTRL) e LPS-

células ativadas (LPS), respectivamente. Os histogramas b–d representam resultados (média ± SD) de n {{0}} experimentos realizados em diferentes populações de células, expressos como uma porcentagem de inibição de MMP em comparação com LPS, calculado após densitometria de varredura e análise computadorizada de géis . A diminuição estatisticamente significativa em comparação com LPS é indicada por asteriscos (ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Dunnet; *p < 0,05,="" **p=""><>

propriedades biológicas anticarcinogênicas, antimutagênicas, antioxidantes e anti-inflamatórias (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015; Vig et al., 2009; Talalay e Fahey 2001). Os isotiocianatos originam-se da degradação enzimática dos glucosinolatos (GSL) que são metabólitos secundários presentes em 15 famílias botânicas da ordem Capparales e são muito abundantes na família Brassicaceae (Fahey et al. 2001). Os GSL são hidrolisados ​​pela mirosinase (-tioglucosídeo glucohidrolase e; EC 3.2.3.147) em uma variedade de componentes, como ITCs, nitritos, tiocianatos, epitionitrilos, SFGate, glicose e oxazolidinas (Li e Kushad 2005). Embora os ITCs tenham sido extensivamente estudados no campo quimioterápico (Grundemann e Huber 2018), poucas investigações foram feitas sobre seu potencial terapêutico em doenças neurológicas, apesar de ter sido demonstrada a capacidade de SFN e AITC de atravessar o BBB e se acumular no parênquima cerebral (Clarke et al. 2011; Jazwa et al. 2011; Zhang 2010). Neste artigo, comparamos os efeitos de três ITCs,

presente em vários vegetais crucíferos comumente consumidos, na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e expressão de metaloproteinases de matriz (MMP) em um modelo in vitro de neuroinflamação representada por astrócitos ativados com lipopolissacarídeo (LPS) ou tratados com H2O2. Os astrócitos, o tipo de célula glial mais abundante do SNC, desempenham um papel crucial na manutenção da homeostase cerebral e são características de diferentes doenças neurológicas (Cekanaviciute e Buckwalter 2016; Colombo e Farina 2016). Eles são considerados reguladores cruciais da resposta imune inata e sua resposta a insultos nocivos, como estresse oxidativo, pode exacerbar reações inflamatórias e danos teciduais ou promover reparo tecidual. É bem conhecido que os astrócitos ativados produzem fatores neurotóxicos, como as MMPs, que têm um papel fundamental na promoção da neuroinflamação e perda neuronal progressiva em doenças neurológicas (Hsieh e Yang 2013). Assim, a modulação do

Fig. 4 Efeito dos compostos ITC na expressão de MMP-2 e MMP-9 em astrócitos ativados por LPS. Astrócitos, semeados em placas de 6 poços, foram ativados com LPS (10 µg mL-1) e tratados simultaneamente por 20 h com AITC (400 μM), PEITC (10 μM) ou SFN (25 μM), depois submetidos a RT-PCR. Géis de agarose representativos da expressão de MMP-2 e MMP-9 são relatados em (a). Os histogramas em (b) representam resultados (média ± SD) de n=3 experimentos realizados em células diferentes

os eventos que ocorrem após a ativação dos astrócitos podem mitigar a resposta inflamatória e o dano neuronal.

Os resultados deste estudo indicaram que entre os ITCs estudados, o AITC foi menos tóxico, pois não resultou em redução da viabilidade celular em todas as concentrações utilizadas. Por outro lado, de forma semelhante ao que foi observado por outros autores em várias linhagens de células gliais, PEITC e SFN mostraram toxicidade celular em concentrações superiores a 10 e 25 µM, respectivamente (Lee et al. 2015; Eren et al. 2018; Su et al. . 2015).

Na literatura científica atual, existem muitos dados controversos sobre os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos das ITCs na viabilidade celular. A este respeito, a maioria dos estudos sugeriu que os ITCs inibem a apoptose indutora de crescimento celular, parada do ciclo celular, geração de ROS em células cancerosas, mas não em células normais (Fofaria et al. 2015; Qin et al. 2018; Sestili e Fimognari 2015). Descobrimos que SFN e PEITC, mas não AITC, têm um papel protetor contra o estresse oxidativo em astrócitos, de fato, nas concentrações máximas não tóxicas, eles foram capazes de neutralizar a produção de ROS induzida pela exposição ao H2O2. O SNC é particularmente vulnerável ao estresse oxidativo devido ao seu alto consumo de oxigênio, fracos sistemas antioxidantes e alto teor de biomacromoléculas suscetíveis à oxidação. Acredita-se que a geração de ROS e dano oxidativo esteja envolvido na patogênese de distúrbios neurológicos, como doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (DP), Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) e Esclerose Múltipla (EM) (Lee et al. 2015). Portanto, embora em nossos experimentos in vitro SFN e PEITC tenham neutralizado a produção de ROS de forma moderada, podemos supor que in vivo uma administração prolongada de ITCs pode levar a uma redução mais significativa de ROS que, ao longo do tempo, pode resultar em para populações expressas como porcentagem de inibição de MMP em comparação com o controle positivo (LPS), calculada após densitometria de varredura e análise computadorizada dos géis. A diminuição estatisticamente significativa da expressão de MMP-2 e MMP-9 em comparação com LPS é indicada por asteriscos (ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Dunnet; *p <>

a prevenção e modulação de doenças cerebrais. ROS atua como uma molécula de sinalização crítica para desencadear a cascata de resposta inflamatória no SNC. A este respeito, é bem conhecido que ROS regulam a expressão de muitos genes envolvidos na neuroinflamação através da ativação de fatores de transcrição pró-inflamatórios, como o fator nuclear-κB (NF-κB) (Lee et al. 2015; Chiurchiù et al. 2016; Martorana et al. 2019). Neste cenário, um papel importante é desempenhado por MMPs cuja expressão é regulada positivamente por ROS através da ativação de NF-κB (Yan e Boyd 2007).

Uma vez que a desregulação das MMPs contribui para a patogênese de inúmeras doenças neuroinflamatórias e neurodegenerativas, sua inibição representa uma importante estratégia terapêutica. Por esta razão, o interesse crescente tem sido focado na última década no potencial de drogas e compostos naturais para inibir MMPs. Numerosos estudos in vitro evidenciaram que a ação anti-inflamatória e antioxidante de várias drogas e compostos bioativos presentes em vegetais e organismos marinhos estão associados às suas habilidades de inibir a expressão de MMPs (Latronico et al. 2016, 2018; Di Bari et al. . 2015). Neste estudo, demonstramos que entre os ITCs testados, SFN e PEITC foram os mais eficazes na inibição dos níveis e expressão de MMP-2 e MMP-9 em astrócitos ativados por LPS. A inibição de MMPs por ITCs foi relatada em outros estudos in vivo e in vitro. Em particular, Li et al. (2013) demonstraram que o SFN é capaz de mitigar o dano do BBB inibindo a expressão de MMP-9 em um modelo in vivo de encefalomielite autoimune experimental. Outros autores relataram que o SFN foi capaz de atenuar a expressão de MMP-9 após lesão na medula espinhal em camundongos (Mao et al. 2010a). Além disso, estudos in vitro demonstraram que a supressão por ITCs da migração celular e

Fig. 5 A quinase 1/2 regulada por sinal extracelular (ERK 1/2) está envolvida na inibição da expressão de MMP por compostos de ITC. Filmes autorradiográficos representativos de análise de Western blotting de lisados ​​de astrócitos pré-tratados por 1 h com AITC (400 μM), PEITC (10 μM) ou SFN (25 μM), e então ativado por 2 h com LPS (10 ug mL{{ 13}}). As células não tratadas e não estimuladas representam o controle negativo (CTRL). O histograma em (b) representa a invasão dos níveis de pERK1/2 em células de glioma C6 foi associada à inibição da expressão de MMP-9 mediada por NF-κB (Lee et al. 2015).

Os mecanismos moleculares pelos quais os ITCs inibem as MMPs não são claros, e não há estudos investigando as propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias dos ITCs em culturas primárias de astrócitos. Vários estudos sustentam a hipótese de que o efeito inibitório dos ITCs é consequência de sua capacidade de bloquear o NF-κB pela via de sinalização Nrf2. A este respeito, um estudo in vivo evidenciou que camundongos knockout para Nrf2 eram mais suscetíveis à resposta inflamatória da medula espinhal mediada por NF-κB e ao aumento da expressão de genes dependentes de NFκB, incluindo MMP-9 (Mao et al. 2010b ). Embora as vias NF-κB e Nrf2 possam interagir, demonstramos que a regulação do NF-κB ocorre também através da modulação de mecanismos moleculares independentes por Nrf2. De fato, descobrimos que AITC, PEITC e SFN inibiram a ativação de ERK1/2, que desempenha um papel fundamental na cascata de eventos de transdução de sinal que, em última análise, regulam a transcrição do gene MMP.

No entanto, a evidência experimental de que o SFN na concentração máxima não tóxica inibiu completamente a expressão e os níveis de MMP-9, enquanto o AITC e o PEITC inibiram ao máximo a expressão de MMP-9, mas apenas reduziram o MMP{{3} } para cerca de 50 por cento, pode sugerir que esses compostos modulam a transcrição de MMP-9 com diferentes mecanismos de ação. A esse respeito, foi relatado que o SFN, além da inibição da ativação de NF-κB induzida por LPS, interfere na ligação de LPS ao receptor TLR4 (Koo et al 2013). O efeito inibitório do SFN em TLR4 pode impedir a ativação de astrócitos por LPS e isso pode resultar na inibição upstream da expressão de MMP-9 com a consequente falta de produção de MMP-9.

obtido após varredura densitométrica de filmes autorradiográficos e normalização para ERK 1/2 não fosforilada. Os dados representam médias ± SD de n=3 experimentos realizados em diferentes populações de células. Os asteriscos representam valores estatisticamente diferentes do controle positivo (astrócitos ativados por LPS), que foi definido em 100 por cento (ANOVA unidirecional seguido pelo teste post hoc de comparação múltipla de Dunnett; *p <>

Conclusões

Em resumo, nossos dados indicam que o tratamento de astrócitos com ITCs reduz a formação de ROS e inibe a liberação de MMP-2 e MMP-9 fornecendo novos insights sobre as propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias de ITCs na glia células. Esses resultados sugerem que as CTIs podem ser agentes nutracêuticos promissores para o desenvolvimento de intervenções de neuronutrição, baseadas no uso de alimentos saudáveis, para prevenção e tratamento complementar de doenças neurológicas.

Financiamento Financiamento de acesso aberto fornecido pela Università Degli Studi di Bari Aldo Moro no âmbito do Acordo CRUI-CARE.

Conformidade com os padrões éticos

Conflito de interesse Os autores declaram não haver conflito de interesse.

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