Benefícios neuroprotetores do exercício e do MitoQ na função da memória, dinâmica mitocondrial, estresse oxidativo e neuroinflamação em ratos com envelhecimento induzido por D-galactose, parte 2

2.6. Preparação de tecidos

Após completar 8 semanas de TE e testes de comportamento de memória, todos os ratos foram sacrificados por inalação de CO2, e tecidos cerebrais foram colhidos de 7 animais em cada grupo de tratamento.

O teste de comportamento da memória é uma ferramenta eficaz para avaliar a memória. Com a crescente pressão social e laboral, a memória das pessoas torna-se cada vez mais importante. Portanto, fazer um teste de comportamento de memória pode nos ajudar a compreender nosso nível de memória e a tomar medidas eficazes para melhorar e manter nossa memória de acordo com os resultados do teste.

Especificamente, os testes de comportamento de memória podem avaliar a capacidade das pessoas de receber, processar, armazenar e recuperar informações. Através do teste de diferentes tipos de informação, como linguagem, números, imagens, etc., a memória das pessoas pode ser totalmente testada. Os resultados dos testes fornecerão várias pontuações para nos ajudar a compreender nossos pontos fracos e fortes e como fortalecer nossa memória.

Na prática, muitos testes de comportamento de memória também fornecem dicas e sugestões profissionais. Por exemplo, um bom sono, uma dieta equilibrada, exercícios adequados e exercícios cerebrais regulares são benéficos para melhorar a memória das pessoas. Através desses métodos, podemos melhorar nosso tempo de retenção de memória, capacidade de reprodução de memória e outros aspectos, para melhor nos adaptarmos à vida diária ou às necessidades de trabalho.

Resumindo, um teste de comportamento de memória é muito útil para compreender, avaliar e melhorar a memória. Devemos também adoptar métodos apropriados para fortalecer a nossa memória de acordo com a nossa situação real, para estabelecer uma base sólida para uma vida mais plena e rica. Pode-se observar que precisamos melhorar a memória, e Cistanche pode melhorar significativamente a memória porque Cistanche é um material medicinal tradicional chinês com muitos efeitos únicos, um dos quais é melhorar a memória. O efeito do Cistanche vem dos vários ingredientes ativos que contém, incluindo ácido tânico, polissacarídeos, glicosídeos flavonóides, etc.

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Após a separação do córtex cerebral e do hipocampo, o tecido cerebral foi congelado rapidamente em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ◦C até a análise. Os 5 animais restantes foram utilizados para análise imuno-histoquímica (IHQ).

Após abertura da cavidade torácica, solução salina tamponada com fosfato (PBS) 50 mM foi passada através do ventrículo esquerdo durante 10 min e depois o animal foi perfundido com paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS 100 mM.

Após a fixação por perfusão, o cérebro foi colhido, colocado em PFA a 4% e fixado por 4 horas a 4 ◦C. O tecido cerebral fixado foi submerso em solução de sacarose a 30% por 2 dias e depois cortado em fatias de 40 µm de espessura usando um criostato ( Leica Microsystems, Nussloch, Alemanha).

2.7. Isolamento de mitocôndrias

Para isolar as mitocôndrias, utilizamos um kit de extração de mitocôndrias (IMGENEX Corporation, San Diego, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Para cada 100 mg de tecido hipocampal foi adicionado 1 mL de tampão homogeneizador.

Após homogeneização, o tecido foi centrifugado a 900× g por 10 min a 4 ◦C, e o sobrenadante foi coletado e centrifugado novamente a 15,{4}}× g por 30 min a 4 ◦C.

Tomando a fração citosólica centrifugada, o citosol foi separado e o sedimento restante foi completamente misturado em 1 mL de tampão de suspensão, antes de centrifugar a 15,{2}}× g por 10 min a 4 ◦C.

O sobrenadante foi removido e outro 1 mL de tampão de suspensão foi adicionado antes de misturar completamente e centrifugar novamente a 15,000× g por 10 min a 4 ◦C.

O sobrenadante foi removido e o pellet restante foi dissolvido em 1 mL de tampão de lise mitocondrial completo por 30 min a 4 ◦C. O extrato mitocondrial foi então centrifugado a 15,{4}}× g por 5 min a 4◦C, e o sobrenadante (fração mitocondrial) foi coletado.

2.8. Western Blot
A proteína total obtida pelo isolamento mitocondrial foi quantificada pelo método de Bradford. Uma quantidade igual de proteínas mitocondriais (30 µg por pista) foi carregada em eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) (8% ou 12%).

Após eletroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Boston, MA, EUA).

O bloqueio foi realizado por 1 h em temperatura ambiente usando solução salina tamponada com 1×Tris contendo solução de Tween-20 (TBS-T) com 5% de BSA e, em seguida, a membrana reagiu com anticorpos primários durante a noite a 4 ◦C.

Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p22 phox, p47 phox, gp91phox, SOD-2, catalase e -actina (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA, diluição:1 :1000); e TNF- (Abcam, Cambridge, Reino Unido, diluição: 1:1000).

As membranas foram então lavadas com um tampão de lavagem (PBS com 0 0,1% de Tween 20), após o que foram incubadas com anticorpos secundários de cabra anti-coelho conjugados com peroxidase de rábano (HRP) para p22 phox, gp91 phox e TNF - (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA, diluição: 1:5000).

Anticorpos secundários anti-camundongos de cabra conjugados com HRP foram utilizados para Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p47 phox, SOD-2, catalase e -actina (Santa Cruz Biotechnology, diluição: 1:5000).

Os níveis de expressão proteica foram detectados utilizando o sistema de detecção ECL Western blotting (Santa Cruz Biotechnology). As densidades das bandas proteicas desenvolvidas foram analisadas utilizando o sistema de imagem em gel ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA).

2.9. Imunohistoquímica (IHQ)
Para análise IHQ, foi utilizado o método de flutuação livre para o tecido selecionado em cada grupo de tratamento. Depois de lavar o tecido 3x por 10 min cada em 00,01 M PBS, o tecido foi incubado a 80 ◦C por 60 min em um béquer contendo citrato de sódio 0,01 M, seguido de bloqueio em 10% soro de burro normal (Millipore Sigma, Burlington, MA, EUA).

A amostra de tecido foi então reagida com anticorpos primários anti-p22 phox (Santa Cruz Biotechnology, diluição: 1:500) e proteína ácida fibrilar anti-Glial (GFAP) (Abcam, diluição:1:500) por 12 h a 4 ◦C. No dia seguinte, o tecido foi lavado 3x durante 5 min cada em PBS 0, 01 M e depois reagiu com anticorpo secundário de cabra anti-murganho conjugado com HRP (Santa Cruz Biotechnology, diluição: 1: 5000) à temperatura ambiente durante 2 h.

Finalmente, o tecido foi incubado em temperatura ambiente usando uma solução do kit Vectastain-Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA), e os resultados foram visualizados usando o DABPeroxidase Substrate Kit (Vector Laboratories).

Cada fatia de tecido foi montada em uma lâmina usando um meio de montagem (Vector Laboratories) e inspecionada usando um microscópio óptico (Leica Microsystems).

2.10. Análises Estatísticas

Os dados foram analisados ​​usando SPSS para Windows versão 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Todos os valores são expressos como média ± SEM. A significância estatística foi determinada usando ANOVA unidirecional. Testes post hoc de Bonferroni foram usados ​​para comparações múltiplas. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas em p < 0,05.

3. Resultados

3.1. Efeitos do exercício em esteira e do MitoQ na expressão de proteínas relacionadas à dinâmica mitocondrial no hipocampo de ratos com envelhecimento induzido por D-Gal

Verificamos que TE e MitoQ afetaram fatores relacionados à fusão mitocondrial (Mfn1, Mfn2, Opa1) e fatores relacionados à fissão (Drp1, Fis1) no hipocampo de ratos idosos (Figura 1).

Os níveis de expressão de fatores relacionados à fusão mitocondrial diferiram significativamente entre os grupos de tratamento (Mfn1, F4,34=1340,750, p < 00,001; Mfn2, F4,34=80. 816, p < 0,001;Opa1, F4,34=51.456, p=0.001).

Os níveis de expressão de fatores relacionados à fissão mitocondrial também diferiram significativamente entre os grupos de tratamento (Drp1, F4,34=53.448, p < 0.001; Fis1,F4,34=116 0,313, p < 0,001). Os resultados do teste post hoc são mostrados na Figura 1.

Em comparação com o grupo Y-CON, a expressão de fatores relacionados à fusão mitocondrial diminuiu no grupo D-CON e mostrou tendências crescentes nos grupos D-TE, D-MI e D-COMBI.

Por outro lado, a expressão do fator Drp1 relacionado à fissão mitocondrial aumentou no grupo D-CON em comparação com o grupo Y-CON. Embora os sinais de fissão mitocondrial tenham diminuído pelo tratamento combinado com TE, o tratamento com MitoQ sozinho não induziu uma alteração significativa.

O outro fator relacionado à fissão mitocondrial, Fis1, demonstrou as mesmas tendências decrescentes que Drp1, mas também foi diminuído apenas pelo tratamento com MitoQ.

Figura 1. Efeito do exercício em esteira e da mitoquinona (MitoQ) na expressão de proteínas relacionadas à dinâmica mitocondrial no hipocampo de ratos com envelhecimento induzido por D-galactose (D-gal). (A) Western blots representativos de fusão mitocondrial e proteínas relacionadas à fissão. (B – F) Análise densitométrica das bandas de Western blot normalizadas para -Actina. Os dados mostrados no Western Blot são médias de sete cérebros de ratos.

-A actina foi testada como controle interno. O teste post hoc de Bonferroni foi utilizado após ANOVA. Os valores são médias ± SEM.

a Denota diferença estatística em relação ao grupo de controle jovem (Y-CON). b Denota diferença estatística em relação ao grupo D-galactose (D-CON). c Denota diferença estatística em relação ao grupo D-galactose mais exercício em esteira (D-TE).

d Denota diferença estatística em relação ao grupo D-galactose mais MitoQ (D-MI) (p < 0,05). D-COMBI; Grupo D-galactose mais TE e MitoQ.

3.2. Efeitos do exercício em esteira e do MitoQ na expressão de subunidades da NADPH oxidase no córtex cerebral e no hipocampo de ratos com envelhecimento induzido por D-Gal

Observamos diferenças significativas entre os grupos de tratamento na imunorreatividade de p22 phox no córtex cerebral e hipocampo de ratos idosos (Figura 2) (CA3,F4,24=180,786, p <0.{{11 }}01; córtex, F4,24=120,662, p < 0,001).

No córtex, o grupo D-CON apresentou aumento da imunorreatividade do p22 phox em comparação com o grupo Y-CON, que diminuiu significativamente nos grupos D-TE, D-MI e D-COMBI.

No CA3, o aumento da imunorreatividade do p22 phox foi diminuído nos grupos D-TE e D-COMBI em comparação ao D-CON. Os níveis de expressão proteica das subunidades NOX p22 phox, gp91 phox e p47phox diferiram significativamente entre os grupos (p22 phox, F4,{{10}}.513, p <0.{{24} }01; gp91 phox,F4,34=57.282, p < 0,001;

Os resultados do post hoctest mostraram um aumento significativo nos níveis da subunidade NOX no D-CON em comparação com o Y-CON. No entanto, os níveis das subunidades NOX foram mais baixos em todos os grupos de intervenção em comparação com o grupo D-CON.

Em particular, a expressão de p22 phox e gq91 phox foi significativamente diminuída no grupo D-TE em comparação com o grupo D-MI. Essas descobertas implicam que o exercício e o MitoQ previnem individualmente o estresse oxidativo induzido pelo envelhecimento no cérebro, mas sua combinação não resulta em efeitos adicionais.

Figura 2. Efeitos do exercício em esteira e do MitoQ na expressão das subunidades da NADPH oxidase no córtex cerebral e no hipocampo de ratos com envelhecimento induzido por D-gal. (A1) Fotomicrografias mostrando imunorreatividade de NAPDH p22 phox no córtex cerebral e hipocampo de ratos idosos induzidos por D-gal em cada grupo. Retângulos pretos em A1 indicam a parte das imagens mostrada em f – i e p – t. (A2, A3) Quantificação da densidade óptica da coloração NADPH p22 phox no córtex cerebral e no hipocampo.

Teste post hoc de Bonferroni após ANOVA. Os valores são apresentados como médias ± SEM.(n=5 animais). (a – e e k – o) Barra de escala=100 µm, (f – j e p – t) Barra de escala=50 µm. (B) Imagens representativas de Western Blot para subunidades da NADPH oxidase no hipocampo.

(C – E) Quantificação de subunidades da NADPH oxidase no hipocampo. Os dados mostrados no Western Blot foram médias de sete cérebros de ratos. -A actina foi testada como controle interno. O teste post hoc de Bonferroni foi utilizado após ANOVA. Os valores são médias ± SEM.

a Denota diferença estatística em relação ao grupo Y-CON. b Denota diferença estatística em relação ao grupo D-CON. c Denota diferença estatística em relação ao grupo D-TE.(p < 0,05).

3.3. Efeito do exercício em esteira e do MitoQ na expressão de GFAP no córtex cerebral e no giro denteado do hipocampo de ratos com envelhecimento induzido por D-Gal

Observamos diferenças significativas entre os grupos de tratamento na imunorreatividade da GFAP no córtex cerebral e no giro dentado do hipocampo (DG) de ratos idosos (Figura 3) (Cortex, F4, 24=13 0,524, p < 0 0,001 ;DG, F4,24=30.364).

Os resultados do teste post hoc mostraram que o tratamento com D-gal aumentou significativamente a imunorreatividade da GFAP tanto no córtex quanto no DG.

Em comparação com o grupo D-CON, os níveis de GFAP no córtex diminuíram em todos os grupos de intervenção, e os níveis de GFAP no DG diminuíram nos grupos D-TE e D-COMBI, enquanto o grupo D-MI mostrou diferenças apenas na imunorreatividade da GFAP na região do córtex.

Assim, embora o tratamento com TE ou MitoQ tenha reduzido a neuroinflamação induzida por D-gal no córtex, apenas a intervenção com TE produziu efeitos positivos na DG.

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