Proteínas mitocondriais revelam o mecanismo pelo qual o exercício físico melhora a memória, o aprendizado e a atividade motora na encefalopatia hipóxica isquêmica, modelo de rato, parte 3

4. Materiais e Métodos

4.1. Animais e Grupos Experimentais

Trinta e seis ratos Sprague-Dawley foram utilizados para este estudo. Os animais foram mantidos a 22 ± 1◦C com ciclos claro/escuro de 12 horas e tiveram livre acesso a comida e água. Os procedimentos experimentais foram conduzidos com a aprovação do Comitê Institucional de Ética em Cuidados e Pesquisa Animal da Universidade de Zhengzhou.

O ciclo escuro refere-se ao período em que as pessoas dormem à noite e está intimamente relacionado à memória. Para a maioria das pessoas, uma boa noite de sono melhora a saúde física e a função cerebral. Ao mesmo tempo, o sono também está relacionado ao processo de memória do cérebro.

Quando dormimos, nossos corpos entram em diferentes estágios do sono, incluindo o sono de movimento rápido dos olhos (REM) e o sono de movimento não rápido dos olhos (NREM). Esses estágios desempenham um papel importante na regulação da integração de informações do cérebro e na consolidação da memória.

A maioria das pessoas experimenta os efeitos positivos do sono na concentração e na memória. A investigação mostra que o sono pode ajudar-nos a consolidar e fortalecer as nossas memórias e até a melhorar a nossa capacidade de aprendizagem. Durante o sono, o cérebro integra novas informações com o conhecimento existente, aumentando assim a capacidade de armazenar e usar a memória.

Por outro lado, a falta de sono adequado pode levar à perda de memória e dificuldades de aprendizagem. A insônia de longo prazo pode causar uma variedade de problemas no corpo e no cérebro, afetando a vida diária e a capacidade de trabalho. Portanto, uma estratégia correta de sono e um estilo de vida razoável são cruciais para manter uma boa memória.

No geral, existe uma conexão entre os ciclos sombrios e a memória. O sono adequado pode promover a integração da informação cerebral e a consolidação da memória, enquanto os distúrbios do sono a longo prazo podem afetar a função cerebral e a memória. Portanto, devemos prestar atenção à qualidade do sono no nosso dia a dia e manter um estilo de vida saudável, para apoiar e melhorar eficazmente a nossa memória e capacidades de aprendizagem. Percebe-se que precisamos melhorar a memória, e a Cistanche deserticola pode melhorar significativamente a memória, pois a Cistanche deserticola também pode regular o equilíbrio dos neurotransmissores, como aumentar os níveis de acetilcolina e fatores de crescimento. Essas substâncias são muito importantes para a memória e o aprendizado. Além disso, a Cistanche deserticola também pode melhorar o fluxo sanguíneo e promover o fornecimento de oxigênio, o que pode garantir que o cérebro receba nutrientes e energia suficientes, melhorando assim a vitalidade e a resistência do cérebro.

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Todos os esforços foram feitos para reduzir o número de animais e minimizar o sofrimento animal durante os experimentos. Os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (Figura 8). (1) HIE, NT (grupo hipóxia-isquemia-encefalopatia sem treinamento físico) consistiu de animais que foram modelados para encefalopatia hipóxico-isquêmica no 7º dia pós-natal, anestesiando os filhotes com isoflurano (5% de indução, 1,5% de manutenção).

A artéria carótida comum esquerda foi então permanentemente ligada e os filhotes foram colocados em uma maca de recuperação quente por 30 minutos antes de serem transferidos para uma câmara hipóxica com fluxo contínuo da mistura de gás hipóxico de 92% de N2 e 8% de O2 por 90 min e depois retornaram às gaiolas até a 10ª semana sem submetê-los a exercícios de natação. (2) O HIE, T (grupo de encefalopatia hipóxia-isquêmica com treinamento físico) foi composto por animais que foram modelados para encefalopatia hipóxico-isquêmica como em (1) e retornaram às gaiolas até a 6ª semana de vida e depois submetidos a 90 min de exercício de natação diariamente durante cinco dias com 2 dias de descanso por semana durante 4 semanas, (3) SHAM, NT (grupo controle) incluiu animais que não foram submetidos a nenhum tratamento, mas viveram uma vida normal nas gaiolas desde o dia 1 pós-natal até a 10ª semana sem treinamento físico, e (4) SHAM, T consistiu em animais não submetidos a nenhum tratamento, mas viveram uma vida normal nas gaiolas desde o dia pós-natal 1 até 6 semanas, após o que foram submetidos a exercícios de natação por 4 semanas.

Os cérebros dos animais dos diferentes grupos foram então colhidos e preparados para western blotting (hipocampo e córtex cerebral) e imunofluorescência (córtex motor).

4.2. Paradigma do Exercício

Os animais foram alojados com comida e água ad libitum e mantidos em um 12-ciclo claro/escuro. Eles foram divididos em dois grupos: animais sedentários (HIE, NT e SHAM, NT) e animais exercitados (HIE, T e SHAM, T). Os animais em exercício foram submetidos a treinamento físico de natação após a 6ª semana pós-natal por 4 semanas; eles foram submetidos a exercícios de natação cinco dias por semana com dois dias de descanso. Cada sessão de natação durou 90 minutos. A piscina foi preenchida até uma profundidade de 50 cm para evitar que os animais tocassem o fundo do tanque.

Os animais puderam nadar livremente, sem qualquer carga extra, e foram suavemente estimulados durante a natação. Os ratos foram cuidadosamente secos após o exercício e devolvidos às gaiolas.

4.3. Vertical! Teste de motor de pólo

Os animais de cada grupo foram colocados um a um, com a face para cima, sobre uma vara de tecido coberta com fita adesiva (3,0 cm de diâmetro e 150 cm de comprimento), que foi mantida na posição horizontal e, em seguida, foi levantada gradativamente até uma posição horizontal. posição vertical, e o tempo que o rato permaneceu no poste foi registrado por no máximo 2 min (120 s). Neste teste, o animal com déficit de coordenação motora e equilíbrio cai do poste.

4.4. Teste do Labirinto Aquático de Morris (MWM)

Ratos (10 semanas de idade) foram submetidos à MWM após 4 semanas de protocolo de treinamento físico (SHAM, 'T e HlE, T). Todos os dados do labirinto aquático foram registrados usando o sistema de rastreamento de vídeo Panjab SMART (Panlab Howo Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.) (Xangai, China). O MWM foi utilizado conforme descrito por l32]. Resumidamente, os ratos usaram sinais visuais colocados nas bordas de uma piscina para chegar a uma plataforma escondida e escapar da água. A aprendizagem foi avaliada ao longo de 7 dias. Antes da avaliação da aprendizagem, os ratos foram introduzidos na piscina que continha água limpa e uma plataforma visível. Durante o treinamento, os ratos realizaram exercícios experimentais de natação para se familiarizarem com a tarefa.

Durante a fase de aprendizagem, os ratos foram untados com corante preto para facilitar o rastreamento do vídeo e a plataforma foi submersa. Cada rato foi submetido a quatro tentativas a partir de diferentes pontos de partida (quadrantes). A latência ou tempo necessário para chegar à plataforma foi registrada todos os dias pelo Panlab SMART Video Tracking System. No último dia do experimento, a plataforma foi retirada e cada rato foi reintroduzido na água e foi registrado o número de vezes que os animais cruzaram o local da plataforma escondida no quadrante que anteriormente continha a plataforma (quadrante alvo).

4.5. Western Blot

Seis ratos foram selecionados aleatoriamente de cada grupo para o experimento de nível de proteína. As proteínas foram extraídas do hipocampo e do córtex e homogeneizadas em reagente RIPA (CW2333S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, EUA) e separadas em proteínas citoplasmáticas e nucleares. As concentrações de proteína foram determinadas utilizando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (CW0014S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, EUA), e um total de 20 g de proteína foi separado por eletroforese em géis universais de SDS-PAGE (CFAS AnyKD PAGE) #PE008, Zhonghui Hecai Bio-farmacêutica Technology Co., Ltd., Shaanxi, China.

As proteínas foram então transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno, (PVDF) (R1CB12934, Merck Millipore Ltd., (Burlington, MA, EUA). As membranas foram bloqueadas por 2 h com 5% de albumina de soro bovino (BSA) (#A8020, Solarbio Life Sciences , Pequim, China) à temperatura ambiente e incubados com os seguintes anticorpos primários da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA): AIF (D39D2, 1:1000), Citocromo C (136F3, 1:1000),caspase clivada{{ 13}} (Asp175, 1:1000), Smac/Diablo (D553R, 1:1000) e OPA1 (D7C1A,1:1000).

GAPDH da Servicebio, Wuhan, China (GB11002, 1:2000) e H3 da Proteintech (17168-1-AP, 1:1000) a 4 ◦C durante a noite seguido por anticorpo secundário SA conjugado com HRP00001-2 da Proteintect (1:5000) incubação por 2 h em temperatura ambiente. As bandas de proteína foram visualizadas com um kit de quimioluminescência aprimorado #KF005 da Affinity Biosciences e fotografadas com o sistema Bio-Image Analysis (Universidade de Zhengzhou, Zhengzhou, China). As proporções de intensidades de bandas proteicas para GAPDH (proteínas citoplasmáticas) e H3 (proteínas nucleares) como referências internas foram determinadas usando ImageJ.

4.6. Imunofluorescência

As fatias coronais de {{0}}µm de tecido cerebral foram obtidas usando um micrótomo de congelamento (Leica, Alemanha) para imunofluorescência. As lâminas foram bloqueadas por 2 h com PBS com 10% de soro bovino fetal, (#A8020, Solarbio Life Sciences, Pequim, China) e 0,3% de Triton ×-100, Amresco 0694, Biosharp, Estônia em temperatura ambiente e depois incubados com anticorpos primários da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA): anti-AIF, D39D2 (diluição de 1:400), anti-Citocromo C, 136F3 (diluição de 1:200), anti-caspase clivada-3 , Asp175 (diluição de 1:400), anti-Smac/Diablo, D553R (diluição de 1:200) e anti-OPA1, D7C1A (diluição de 1:400) durante a noite a 4 ◦C.

Em seguida, as lâminas foram lavadas 3 vezes, cada uma com duração de 10 min em PBS, e depois incubadas com anticorpos secundários (ab150077 da Abcam, Cambridge Biomedical Campus, Cambridge, Reino Unido) por 2 h em temperatura ambiente no escuro.DAPI,#C0065 da Solarbio Life Sciences, Pequim, China (1:100PBS) foi adicionado por 5 minutos e vertido, lavado em PBS por 3 vezes com duração de 5 minutos cada, seco, o agente anti-extinção foi adicionado (#P0126, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China), vidro as lâminas foram fixadas nas lâminas e as amostras foram armazenadas a -20 ◦C por 2 horas e coletadas para imagens microscópicas. As imagens dos tecidos foram capturadas usando um microscópio confocal de fluorescência (Ni-U942877, Nikon, Tóquio, Japão) e as imagens representando as proteínas no córtex motor foram então quantificadas usando FIJI-ImageJ conforme descrito em [33].

4.7. Análise Estatística

GraphPad Prism versão 8.0.0 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA) foi usado para todas as análises. ANOVA unidirecional seguida de testes post hoc de Dunnett, respectivamente, foram utilizados para medir a significância estatística. Os resultados são apresentados como média ± SEM, e p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

5. Conclusões

Este estudo demonstra que o exercício de natação melhorou a atividade motora, a memória e o aprendizado associados ao HIE, suprimindo a apoptose mitocondrial por meio das vias de sinalização Cyto.C/caspase clivada-3 e AIF. Além disso, foi demonstrado que a intervenção com exercícios de natação estabiliza as cristas mitocondriais e o potencial de membrana, conforme representado pela reversão de Smac/Diablo e OPA1 em ratos com EHI. Como resultado, esta é uma base atraente e viável para pesquisas adicionais para decifrar mais vias moleculares que poderiam ser manipuladas para gerenciar efetivamente a EHI e os déficits resultantes. Embora este estudo tenha demonstrado com sucesso o papel do exercício na reversão dos déficits estruturais e funcionais nas mitocôndrias causados pela HIE, não esgotou todos os métodos possíveis para estabelecer como as cristas mitocondriais são estabilizadas; isso é fundamental para pesquisas futuras sobre esse assunto.

Contribuições dos Autores: Conceituação, FG, FP, YW e CC; curadoria de dados, FG, FP, YW,HL e JF; análise formal, FG, HL e CC; aquisição de financiamento, CC; investigação, FG, FP, YW, HL e JF; metodologia, FG, FP, YW e CC; administração de projetos, FG, YW e CC; recursos, CC; software, FG, FP, JF e CC; supervisão, CC; validação, FG, FP, YW, HL e CC; visualização, FG, FP, YW, HL e JF; redação – rascunho original, FG e YW; redação – revisão e edição FG e HL Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento: Este estudo é apoiado pelo Projeto de Pesquisa Científica e Tecnológica do Departamento Provincial de Ciência e Tecnologia de Henan (Grant No. 212102310217) e uma bolsa dos Fundos da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant No. 81401015).

Declaração do Conselho de Revisão Institucional: O estudo foi conduzido de acordo com as diretrizes do Comitê para o Cuidado de Animais de Pesquisa da Universidade de Zhengzhou; ZZUIRB2022-32.

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido: Não aplicável.

Declaração de disponibilidade de dados: Não aplicável.

Conflitos de interesse: Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Referências

1. Li, B.; Conceição, K.; Meng, X.; Zhang, L. Interações cérebro-imunes em lesão cerebral hipóxico-isquêmica perinatal. Programa. Neurobiol.2017, 159, 50–68. [RefCruz]

2. Douglas-Escobar, M.; Weiss, MD Encefalopatia hipóxico-isquêmica: uma revisão para o clínico. JAMA Pediatr. 2015, 169, 397–403.[CrossRef] [PubMed]

3. Preto, RE; Cousens, S.; Johnson, H.L.; Gramado, J.; Rudan, I.; Bassani, D.; Jha, P.; Campbell, H.; Walker, CF; Cibulskis, R.; et al.Causas globais, regionais e nacionais de mortalidade infantil em 2008: Uma análise sistemática. Lancet 2010, 375, 1969–1987. [RefCruz]

4.Juul, SE; Ferriero, DM Estratégias Neuroprotetoras Farmacológicas em Lesão Cerebral Neonatal. Clin. Perinatol. 2014, 41, 119–131.[CrossRef]

5. Zhu, C.; Rodríguez, JI; Aceso.; Xu, Y.; Sun, Y. Papel do fator indutor de apoptose na lesão cerebral hipóxico-isquêmica perinatal. NeuralRegen. Res. 2021, 16, 205–213. [CrossRef] [PubMed]

6. Canção, S.-H.; Jee, Y.-S.; Ko, I.-G.; Lee, S.-W.; Sim, Y.-J.; Kim, D.-Y.; Lee, S.-J.; Cho, YS Exercícios em esteira e exercícios com rodas melhoram a função motora ao suprimir a morte celular neuronal apoptótica em ratos com inflamação cerebral. J. Exercício. Reabilitar. 2018, 14, 911–919.[CrossRef]

7.Kelly, M.; Darrah, J. Exercício aquático para crianças com paralisia cerebral. Dev. Med. Criança. Neurol. 2005, 47, 838–842. [RefCruz]

8. Muller, P.; Duderstadt, Y.; Lessmann, V.; Müller, NG Lactato e BDNF: Principais Mediadores da Neuroplasticidade Induzida pelo Exercício?J. Clin. Med. 2020, 9, 1136. [CrossRef]

9. Intlekofer, KA; Cotman, CW O exercício neutraliza o declínio da função do hipocampo no envelhecimento e na doença de Alzheimer. Neurobiol.Dis. 2013; na imprensa. [RefCruz]

10.Real, C.; Ferreira, A.; Chaves-Kirsten, G.; Torrão, A.; Pires, R.; Britto, L. O bloqueio do receptor BDNF dificulta os efeitos benéficos do exercício em um modelo de rato com doença de Parkinson. Neurociência 2013, 237, 118–129. [RefCruz]

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