Métodos para gerar e avaliar modelos de peixes-zebra de doenças renais humanas Parte 2

análise histológica

Os mutantes podem nem sempre apresentar alterações morfológicas suficientemente informativas. A análise histológica desses embriões ou órgãos dos adultos pode ser necessária para determinar a diferença entre os animais mutantes e selvagens. Os métodos de análise histológica para larvas e peixes-zebra adultos estão bem estabelecidos e podem ser executados com alto rendimento (Sabaliauskas et al., 2006). Embriões de peixe-zebra ou tecido adulto podem ser embebidos em parafina ou resina JB-4 seguida de seccionamento em micrótomo para estudar a arquitetura do tecido (Sullivan-Brown et al., 2011; Copper et al., 2018). A criosecção também pode ser realizada com embriões de peixe-zebra (Ferguson e Shive, 2019). Essas seções de tecido são então usadas para coloração de imunofluorescência, estudos imuno-histoquímicos ou coloração H&E. A coloração H&E de seções renais de adultos mostrou que o lado apical do túbulo proximal estava corado em rosa escuro e tinha um lúmen largo, enquanto o túbulo distal tinha uma mancha rosa claro com um lúmen estreito, marcando assim claramente o padrão de coloração diferencial entre os segmentos ( McCampbell e outros, 2015). A técnica de coloração com ácido periódico Schiff (PAS) que detecta polissacarídeos em tecidos tem afinidade pelo epitélio da borda em escova do túbulo proximal (McCampbell et al., 2015; McKee e Wingert, 2015). A prata metenamina mancha as membranas basais e pode ser usada para coloração dos túbulos nefricos e da membrana basal dos glomérulos (McCampbell et al., 2015). Um modelo AKI de peixe-zebra por insulto de gentamicina mostrou achatamento do epitélio, perda da borda em escova apical, distensão tubular e acúmulo de detritos no lúmen, destacando assim a utilidade da histologia na análise de modelos de doença de peixe-zebra (Cianciolo Cosentino et al., 2013) .

Nos últimos anos, a pesquisa sobre o uso de células-tronco e um remédio herbal chinês para o tratamento de doenças renais ganhou grande atenção. O principal mecanismo das duas terapias é promover a reparação dos tecidos renais lesados ​​e proteger orestantes funções renais.

O remédio herbal chinês, cistanche, tem sido usado na medicina tradicional chinesa para tratar váriosdoenças renais crônicasdesde os tempos antigos. É relatado que cistanche tem o potencial de reduzir a inflamação,reduzir a fibrose renal, e promovem a síntese de componentes da matriz extracelular. Foi revelado que esses efeitos são devidos aos seus componentes bioativos, incluindo muitas substâncias fenólicas, triterpenóides e cumarinas.

Por outro lado, a tecnologia das células-tronco provocou uma revolução na prática médica. A pesquisa demonstrou que as células-tronco podem se diferenciar em vários tipos de células renais e realizar atividades terapêuticas, incluindo a proteção dos tecidos renais funcionais remanescentes, retardando a fibrose tecidual e reparando danostecidos renais.

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Em última análise, a combinação da medicina tradicional chinesa com a ciência moderna pode ser a chave para o tratamento de váriosdoenças renais. Essa estratégia vem sendo gradativamente aceita pela comunidade médica e estudos já demonstraram que a terapia combinada decistanchee o tratamento com células-tronco pode reduzir consideravelmente a taxa de mortalidade das doenças renais.

Concluindo, o uso decistanchee o tratamento com células-tronco no tratamento de doenças renais mostra grande potencial e requer mais pesquisas. A terapia combinada dos dois tratamentos pode fornecer uma opção de tratamento melhorada para aqueles que enfrentam doenças renais.

Identificação de defeitos de segmentação de propensofros

O propensophros é padronizado em diferentes segmentos que executam funções distintas. O mecanismo por trás dessa segmentação não é claramente compreendido, embora muitos fatores de transcrição tenham sido identificados como reguladores da segmentação. As diferenças no padrão segmentar podem ser facilmente identificadas pela análise WISH com riboprobes que marcam especificamente diferentes segmentos do propensofros. A posição exata dos segmentos propensofros pode ser marcada pela implementação de dupla hibridização in situ de marcadores específicos de segmento e uma riboprobe antisense que marca o somito (como smyhc1 e xirp2a). Os marcadores específicos de segmento mais comuns são slc20a1a para PCT, trpm7 para PST, slc12a1 para DE, stc1 para CS e slc12a3 para DL (Fig. 2). Mutações no HNF1b humano estão ligadas a anormalidades renais como displasia renal, rim glomerulocístico, oligomeganefronia e rim solitário funcional (Lindner, 1999; Bingham et al., 2002; Bohn et al., 2003). Naylor et al., (2013) analisaram a segmentação de propensofros por WISH em embriões de peixe-zebra nocaute hnf1b usando genes marcadores específicos de segmento e descobriram que marcadores de túbulos proximais e distais estavam ausentes nos mutantes. Usando experimentos semelhantes, descobriu-se que o gene 1 do homeobox dos espiráculos vazios do fator de transcrição (emx1) promove o destino tardio distal e inibe o destino precoce distal durante a nefrogênese (Morales et al., 2018). Wingert et al., (2007) realizaram uma análise WISH de embriões tratados com RA e DEAB e descobriram que o tratamento com DEAB resultou em perda dos segmentos proximais e expansão dos segmentos distais, enquanto o tratamento com RA exógena reverteu esse fenótipo. Eles também estabeleceram uma ligação entre o fator de transcrição caudal (cdx) e RA na regulação da posição e segmentação do néfron (Wingert et al., 2007). Mostramos que o domínio EF-mão contendo 2 (efhc2) knockdown resulta na expansão dos segmentos iniciais distais e redução em CS e segmentos tardios distais. A expressão de odf3, que marca células multiciliadas de túbulos pronéfricos, também foi reduzida em morfos efhc2 (Barrodia et al., 2018).

Coloração e imagem dos cílios pronéfricos

Os cílios são organelas baseadas em microtúbulos que são móveis ou imóveis. Distúrbios humanos causados ​​devido a defeitos na estrutura e função dos cílios são chamados de ciliopatias. Defeitos nos cílios presentes em propensophros de peixe-zebra geralmente levam ao enrolamento do corpo, formação de cistos e dilatação dos túbulos (Sullivan-Brown et al., 2008). Células multiciliadas presentes em Genefros de peixe-zebra podem ser visualizadas por WISH ou hibridização in situ fluorescente (FISH) usando riboprobes antisense odf3b ou rfx2 (Liu et al., 2007; Barrodia et al., 2018). Os cílios em embriões de peixe-zebra podem ser corados usando tubulina acetilada e a g-tubulina pode ser usada para marcar os corpos basais (Jaffe et al., 2010; Zaghloul e Katsanis 2011). O movimento dos cílios móveis pode ser registrado usando um microscópio com uma câmera de alta velocidade empregando peixes-zebra transgênicos como Tg(Foxj1a: GFP) (Tavares et al., 2017). Uma técnica combinada de FISH e ensaio de imunofluorescência foi desenvolvida para marcar células multiciliadas, cílios e corpos basais (Marra et al., 2017). Diferentes mutantes de peixe-zebra com defeitos nos cílios, como Locke, swt e curly, foram examinados em detalhes e descobriu-se que eles apresentavam uma variedade de defeitos no movimento dos cílios (Sullivan-Brown et al., 2008). O movimento ciliar foi reduzido em Locke mutante e os cílios estavam imóveis em swt, enquanto os movimentos ciliares em crespos variaram de movimentos imóveis a irregulares. A imunocoloração com tubulina acetilada mostrou que o comprimento dos cílios era normal em swt e crespo, enquanto locke exibia cílios mais curtos (Sullivan-Brown et al., 2008). Os métodos descritos aqui têm sido usados ​​extensivamente para identificar defeitos nos cílios em doenças renais envolvendo cílios.

Avaliação da função do glomérulo

A principal função do rim é filtrar o sangue e remover resíduos e excesso de fluidos do corpo, evitando a perda de macromoléculas na urina. O glomérulo pode filtrar moléculas de 5 kDa, mas não permite a excreção de moléculas maiores, como a albumina sérica (Chang et al., 1976). Os métodos de diagnóstico comumente usados ​​para avaliar a disfunção renal em humanos não podem ser aplicados ao peixe-zebra devido ao seu pequeno tamanho. No entanto, corantes fluorescentes de diferentes pesos moleculares que imitam as moléculas comumente encontradas no rim humano podem ser injetados no peixe-zebra, e a avaliação de sua depuração ou retenção pode ser usada como um substituto para determinar a função renal (Christou-Savina et al., 2015 ). Foi provado que a injeção de dextrano fluorescente de 10 kDa na cavidade pericárdica de embriões de peixe-zebra resulta em uma perda de cerca de 85% do corante através da secreção do rim dentro de 24 horas após a injeção (HPI) (Christou-Savina et al. , 2015). Corantes de maior peso molecular, como 70 kDa ou acima, precisam ser injetados na vasculatura e são retidos em embriões de tipo selvagem. No entanto, 70 kDa de dextrano pode ser detectado na parede do túbulo proximal quando injetado na vasculatura do peixe-zebra mutante com cistinose (ctn's), indicando que a integridade das fendas do filtro glomérulo está comprometida em cents-/- larvas (Elmonem et al., 2017) . Kramer-Zucker et al., (2005) injetou 500 kDa de FITC-dextrano na veia cardinal de embriões de peixe-zebra de tipo selvagem de 84 hpf e nefrina e podocina, e detectou o corante no propensofros, indicando disfunção de néfrons nesses morfantes.

Avaliação da reabsorção de metabólitos

O receptor endocítico transmembranar megalina/LRP2, seu adaptador desativado2 (dab2) e o co-receptor Dublin desempenham um papel central na depuração mediada por endocitose de metabólitos do filtrado glomerular (Anzenberger, 2006). A injeção de dextrano fluorescentemente marcado de 70 kDa ou proteína associada ao receptor conjugado fluorescente (RAP), uma proteína que se associa fisicamente com megalina/LRP2 na corrente sanguínea de embriões de peixe-zebra, leva à captação dessas moléculas para reabsorção. Isso serve como um método conveniente para avaliar a função de reabsorção de metabólitos do rim. De acordo com seu papel central na reabsorção de metabólitos, o knock-down de megalina/LRP2 ou dab2 leva a uma falha completa da captação endocítica mediada por receptor de marcadores em morfantes (Anzenberger, 2006).

Avaliação da dilatação dos túbulos

O túbulo pronéfrico é revestido por uma única camada de células epiteliais polarizadas. A morfologia do túbulo pronéfrico e sua transformação em segmentos distintos são controladas pela proliferação de células epiteliais diferenciadas próximas à extremidade distal e sua migração em direção ao glomérulo. Esses eventos, por sua vez, são governados pelo fluido que flui no propensofros, fornecendo assim uma correlação entre a morfologia e a função do órgão (Vasilyev et al., 2009). As células na extremidade proximal são enroladas e mais colunares, enquanto as células na extremidade distal são cúbicas (Vasilyev et al., 2009). Uma diminuição na taxa de filtração glomerular, obstrução no túbulo ou defeitos no desenvolvimento e motilidade dos cílios inibem essa migração celular coletiva da direção posterior para a anterior. No entanto, as células da extremidade distal continuam a proliferar, causando a dilatação dos túbulos pronéfricos (Naylor e Davidson, 2017). A dilatação dos túbulos pode ser avaliada pela observação direta de embriões inteiros sob um microscópio ou por meio de análise histológica. A óptica DIC pode ser usada para gerar imagens e calcular o diâmetro do túbulo pronéfrico de embriões de peixe-zebra. Sullivan-Brown et al., (2008) compararam a dilatação dos túbulos em mutantes do tipo selvagem e encaracolado com defeitos nos cílios e descobriram que no tipo selvagem o túbulo medial tinha um diâmetro maior em comparação com o túbulo posterior e que o diâmetro do túbulo túbulos mediais diminuíram ao longo do tempo. Nos mutantes crespos, o diâmetro dos túbulos medial e posterior foi semelhante ao tipo selvagem em 26-30 hpf, mas um aumento constante no diâmetro dos túbulos medianos foi observado nesses mutantes a partir de 48 hpf. Foi ainda observado que o número de células ao redor do túbulo medial também aumentou em embriões mutantes (Sullivan-Brown et al., 2008). Mutações no gene humano MNX1 (neurônio motor e pâncreas homeobox 1) causam a síndrome de Currarino, uma doença congênita rara caracterizada por agenesia sacral e anormalidades urogenitais e renais, como rim em ferradura, rim único, hidronefrose e estenose anorretal (Currarino et al., 1981; Lee et al., 2018; Dworschak et al., 2021). Ott et al., (2016) geraram morfos mnx2b em células epiteliais Tg(-8cldnb.1:lynEGFP)zf106 de fundo em células epiteliais em desenvolvimento e descobriram que os morfos apresentavam diâmetros dos túbulos proximais aumentados em comparação com os selvagens -tipo controles em 4 pdf. Análises posteriores revelaram que esses morfos tinham funções renais alteradas, cílios pronéfricos desorganizados e microvilosidades apicais deformadas (Ott et al., 2016). Tal análise usando peixe-zebra sem dúvida nos ajudaria a entender o mecanismo subjacente das doenças humanas.

Avaliação da polaridade das células epiteliais

A polaridade das células epiteliais do túbulo pronéfrico é mantida por complexos proteicos que segregam a membrana celular em domínios apicais e basolaterais e organizam subdomínios da membrana para funções específicas como secreção, filtração, absorção e estimulação sensorial (Pieczynski e Margolis, 2011). O deslocamento de vários receptores, transportadores e canais foi identificado em muitas condições de doença, como Na mais K mais -ATPase, Na mais K mais 2Cl- cotransportador e EGFR em PKD e H mais -ATPase na doença de Dent (Wilson, 2011) . A polaridade das células epiteliais pode ser verificada por coloração de imunofluorescência de embriões inteiros usando um anticorpo contra Na plus /K plus -ATPase, marcador de junção apertada ZO-1 ou fosfatase alcalina (AP) para identificar os defeitos na polarização de epitélio tubular em mutantes em comparação com embriões de tipo selvagem. Na plus /K plus -ATPase é uma das proteínas mais abundantes nas células epiteliais tubulares que mantém a homeostase sódio-potássio e regula as funções de outros transportadores presentes nas células epiteliais (Fernández e Malnic, 1998). Está localizado na membrana plasmática basolateral e é importante para a polarização das células epiteliais e para a formação e manutenção de junções estreitas (Rajasekaran et al., 2001). ZO-1 e AP são usados ​​para marcar as superfícies apicais das células epiteliais pronéfricas. Drummond et al., (1998) analisaram um grupo de mutantes com defeito leve a grave em propensofros. Eles verificaram a polaridade das células epiteliais em embriões de 2,5 pdf por coloração de imunofluorescência com anticorpo monoclonal anti-Na plus /K plus -ATPase alfa subunidade (a6F) seguido de secção do tecido. Esta análise mostrou que a localização de Na mais /K mais -ATPase foi alterada na maioria das linhagens mutantes em comparação com sua expressão basolateral normal. Nos mutantes double bubble (bb) efler (flr), a Na plus / K plus -ATPase foi expressa na superfície apical enquanto a superfície basolateral apresentou coloração reduzida. Outros mutantes tinham mais coloração lateral, com superfícies apicais e basolaterais não coradas (Drumond et al., 1998).

Detecção de cálculos renais

Os cálculos renais são cristais de sais depositados, entre os quais os cálculos de cálcio são os mais comuns (Evan, 2010). Estes são compostos de oxalato de cálcio (CaOx) e fosfato de cálcio (CaP) em diferentes proporções. Pedras de cálcio podem ser esperadas em mutantes de peixe-zebra com homeostase de cálcio alterada. Corantes vitais como Alizarin red (vermelho fluorescente) e Calcein (verde fluorescente) podem ser usados ​​para detectar tecidos contendo cálcio e cálculos renais em larvas de peixe-zebra. Elizondo et al., (2010) mostraram que 57 - 97 por cento dos embriões mutantes homozigóticos trpm7 desenvolveram cálculos renais aos 5 dpf, enquanto apenas 0-1,4 por cento dos irmãos de tipo selvagem desenvolveram tais cálculos. Imagens de embriões mutantes homozigotos trpm7 corados com vermelho de alizarina em diferentes pontos de tempo mostraram que 2-4 embriões dpf não tinham cálculos, e os cálculos foram observados em 5 dpf no lúmen e não no epitélio do túbulo pronéfrico (Elizondo et al ., 2010).

Conclusões e perspectivas

A incidência de doenças renais está aumentando em um ritmo alarmante em todo o mundo. Há uma necessidade urgente de identificar as causas dessas doenças e desenvolver novos métodos para seu diagnóstico e cura. O rim metanéfrico dos mamíferos é complexo, dificultando o entendimento da patologia da doença renal. O propensofro nas larvas do peixe-zebra é funcional e possui apenas dois néfrons em cada lado da notocorda com um glomérulo compartilhado na parte anterior e uma cloaca na extremidade posterior. Nesta revisão, discutimos vários métodos que podem ser usados ​​para gerar modelos de peixe-zebra de doenças renais humanas e como analisar o fenótipo desses modelos de doença nos níveis morfológico, celular e molecular. Pesquisas meticulosas de muitos grupos estabeleceram esses métodos de geração e análise de modelos de doenças ao longo dos anos. Esses esforços agora estabeleceram que os embriões e adultos do peixe-zebra podem ser usados ​​como modelos de doença renal humana que podem recapitular fielmente vários aspectos da disfunção renal observada em humanos. Esses esforços também geraram muitas ferramentas e recursos úteis, incluindo linhagens mutantes e transgênicas. Isso oferece uma oportunidade não apenas de entender os mecanismos das doenças renais usando o peixe-zebra, mas também de usá-los para descobrir novos medicamentos para o tratamento de doenças renais. O diabetes é um dos principais contribuintes para complicações relacionadas aos rins em humanos. O peixe-zebra oferece uma oportunidade em que a disfunção renal relacionada ao diabetes também pode ser estudada (Jör gens et al., 2012). Assim, o peixe-zebra tem uma excelente base como modelo de doença e oferece um enorme potencial para encontrar novas soluções para doenças humanas.

Agradecimentos

Agradecemos a Tarique Anwar e Supriya Borah por suas discussões e comentários. SF é beneficiário do DBT (DBT/2015/ILS/361) e UR é beneficiário da bolsa DST-Inspire. A pesquisa no laboratório RKS é apoiada pelo SERB-EMR (EMR/2016/003780) e fundos internos do ILS, que é um instituto autônomo do DBT, o governo da Índia.

Contribuição do autor

SF concebeu e escreveu o primeiro manuscrito. UN e RKS discutiram e modificaram o manuscrito.

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