Métodos para gerar e avaliar modelos de peixe-zebra de doenças renais humanas Parte 1

ABSTRATO

Os distúrbios renais afetam milhões de pessoas em todo o mundo. Uma pesquisa com pacientes com doença renal crônica (DRC) mostrou que a carga de doenças renais está aumentando a cada ano. O estudo da carga global de doenças (GBD) de 2017 classificou a DRC como a 12ª principal causa de morte em todo o mundo. Portanto, a identificação das causas das doenças renais, o desenvolvimento de métodos diagnósticos precisos e novas terapêuticas são altamente relevantes. Os organismos modelo que recapitulam fielmente as doenças humanas desempenham papéis importantes na compreensão do processo da doença e fornecem um terreno valioso para encontrar sua cura. Zebrafish é um excelente modelo para estudar o desenvolvimento, fisiopatologia e aspectos moleculares de doenças renais humanas. Nesta revisão, resumimos várias manipulações genéticas e experimentais que podem ser realizadas em peixe-zebra para entender melhor a fisiopatologia das doenças renais humanas. Sugerimos que esses métodos serão úteis no desenvolvimento de potenciais terapias para tratar doenças renais.

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PALAVRAS-CHAVE:CKD, AKI, um modelo de peixe-zebra de doenças renais humanas, propensophros, patologia renal

Introdução

O rim é um dos órgãos vitais nos vertebrados que remove os resíduos e mantém as concentrações de pH, íons e metabólitos do sangue dentro da faixa fisiológica. O rim secreta eritropoietina que regula a produção de glóbulos vermelhos e ativa a vitamina D, que ajuda os ossos a absorver o cálcio. Existem cerca de um milhão de néfrons em cada rim humano, que são as unidades estruturais e funcionais desse órgão. Consequentemente, os defeitos nos néfrons afetam a estrutura e as funções dos rins. A disfunção do rim pode ocorrer devido a mutações genéticas, infecções, lesões, medicamentos ou exposição a compostos tóxicos no ambiente. Doenças crônicas como diabetes, doenças cardiovasculares e hipertensão são os principais contribuintes para a carga de doenças renais (Levey et al., 2010). A função renal prejudicada também aumenta o risco de complicações em outros sistemas de órgãos (Thomas et al., 2008). Os tipos comuns de doenças renais e suas causas estão descritos na Tabela 1.

doenças renais

As doenças renais contribuem para uma fração significativa da carga de doenças em todo o mundo. Cerca de 750 milhões de pessoas em todo o mundo são afetadas por distúrbios relacionados aos rins (Crews et al., 2019). A DRC é mais comum entre eles, com uma prevalência global de 13,4 por cento (Hill et al., 2016). O estudo GBD 2010 classificou a DRC como a 18ª principal causa de morte em todo o mundo, que saltou para a 12ª em 2017 por causar o número máximo de mortes globalmente (Jha et al., 2013; Carney, 2020). De acordo com o estudo GBD em 2017, cerca de 697,5 milhões de casos de DRC foram notificados em todo o mundo, entre os quais 1,2 milhão de pessoas morreram. Estima-se que o número de mortes por DRC aumente para 4 milhões até 2040 no pior cenário (Foreman et al., 2018). Um terço dos pacientes com DRC vive em dois países, China e Índia (Bikbov et al., 2020). O status da DRC entre a população indiana não é claro devido à falta de sistemas precisos de coleta de dados. Cerca de 115 milhões de casos de DRC foram relatados na Índia em 2017 (Bikbov et al., 2020). As doenças mais comuns na população indiana são diabetes e hipertensão (Geldsetzer et al., 2018). De acordo com o relatório do Conselho Indiano de Pesquisa Médica (ICMR), a prevalência de diabetes e hipertensão entre a população adulta urbana é de 28% e 21,4%, respectivamente (Varma, 2015). Entre 40% a 60% dos casos de DRC ocorrem devido a essas complicações e seu número está aumentando rapidamente (Rajapurkar et al., 2012). O centro de dados de doenças renais da Sociedade Internacional de Nefrologia relatou uma prevalência de 16,8% de CDK entre a população indiana (Ene-Iordache et al., 2016). As causas da DRC variam em toda a Índia. Andhra Pradesh, Odisha e Goa relataram altos níveis de DRC de etiologia desconhecida conhecida como nefropatia intersticial crônica (Varughese e Abraham, 2018). Como o número de pacientes com DRC está aumentando em todo o mundo a um ritmo alarmante, há uma necessidade urgente de realizar uma análise completa das causas das doenças renais comuns para encontrar melhores formas de prevenção e cura. Organismos modelo que podem imitar a fisiologia humana e as condições de doença podem fornecer grandes caminhos para abordar os problemas acima. O peixe-zebra tornou-se um modelo útil para estudar o desenvolvimento e doenças e fornecer maneiras promissoras de identificar novos alvos terapêuticos e drogas. Nesta revisão, discutimos vários métodos para recapitular doenças renais humanas em peixe-zebra e como esses modelos podem ser usados ​​para entender a patogenicidade da doença e seus mecanismos moleculares subjacentes. Isso pode resultar na geração de novas abordagens terapêuticas para o manejo e cura de doenças renais.

Semelhanças entre rim humano e peixe-zebra

O desenvolvimento do rim em mamíferos é único, pois ocorre através de três estruturas distintas durante a embriogênese: propensofros, mesonefros e metanefros. As duas primeiras estruturas são transitórias nos mamíferos e apenas o metanefro persiste ao longo da vida (Smyth et al., 2017; Jain, 2014). Pronephros é o rim funcional durante o desenvolvimento embrionário em vertebrados inferiores como anfíbios e peixes, que é substituído por mesonephros como o rim funcional em estágios posteriores (Tahara et al., 1993; Diep et al., 2015). A Tabela 2 descreve a duração do tempo de diferentes formas de rim em humanos, camundongos, Xenopus e peixe-zebra.

Embora a complexidade geral do rim aumente à medida que avançamos para as formas superiores, os néfrons são as unidades estruturais e funcionais de todos os tipos de rins. Cada néfron tem três partes: corpúsculo renal para filtrar o sangue, túbulo para absorver e secretar solutos e ducto coletor para coletar resíduos indesejados para excreção. O epitélio tubular é padronizado em diferentes segmentos para realizar funções específicas. Os néfrons de todas as formas de rim possuem um padrão de segmentação semelhante (Desgrange e Cereghini, 2015). A organização segmentar do néfron de zebrafish propenso e mesonefro é semelhante a metanefros de mamíferos, como mostrado na Fig. 1. O túbulo propenso a zebrafish é dividido em túbulo contorcido proximal (PCT), túbulo reto proximal (PST) e distal precoce (DE ) e túbulos distais tardios (DL), que são análogos ao padrão de segmentação dos néfrons metanéfricos de mamíferos. O peixe-zebra possui uma glândula endócrina denominada corpúsculos de Stannius (CS), que mantém a homeostase do cálcio (Krishnamurthy, 1976). O SC é formado pela transdiferenciação de células epiteliais renais entre os segmentos DE e DL, que gradualmente se separam do túbulo e formam a glândula CS pareada que se posiciona retroperitonealmente na superfície do rim em peixes adultos (Roberts e Ellis, 2012; Naylor e outros, 2018). Uma das principais diferenças entre o peixe-zebra e os néfrons de mamíferos é a falta de alça de Henle no peixe-zebra, que atua como um multiplicador de contracorrente para gerar gradiente osmótico medular para conservação de água. Este segmento não tem utilidade no zebrafish por ser um peixe de água doce (Elmonem et al., 2018). Cada segmento possui tipos celulares distintos e expressões gênicas específicas do segmento, que são conservadas entre os vertebrados (Verlander, 1998; Desgrange e Cereghini, 2015). Todos os tipos de rim seguem caminhos semelhantes de desenvolvimento. Os quatro estágios seguintes estão envolvidos sucessivamente no desenvolvimento do néfron; A: indução do mesoderma intermediário para formar o primórdio renal, B: epitelização e crescimento do ducto néfrico, C: padronização do néfron em segmentos especializados e D: vascularização do néfron para filtração do sangue (Drummond, 2003).

Métodos para gerar modelos de zebrafish de doenças renais humanas

O peixe-zebra possui um par de propensofros que começam a se formar após 12 horas após a fertilização (hpf) e se tornam totalmente funcionais em 48 hpf. Disponibilidade de toda a sequência do genoma, 71% de genes humanos com pelo menos um ortólogo de peixe-zebra, facilidade de manuseio, embriões transparentes, tempo de geração curto, técnicas eficientes de manipulação de genes, métodos para geração de peixes transgênicos e sua rápida triagem fazem do peixe-zebra o organismo modelo mais adequado para estudar anormalidades renais (Howe et al., 2013; Poureetezadi e Wingert, 2016). Uma das características cruciais do peixe-zebra adulto é sua capacidade de regenerar novos néfrons pelo processo de neo-nefrogênese em resposta à lesão renal (Chambers e Wingert, 2016). A Tabela 3 descreve as comparações entre zebrafish e outros organismos modelos comuns, como camundongos e Xenopus. As manipulações genéticas no peixe-zebra mostraram que os novos componentes genéticos do desenvolvimento e função renal podem ser identificados usando este organismo modelo (Poureetezadi e Wingert, 2016). Existem vários métodos para gerar modelos de zebrafish de doenças renais humanas.

genética avançada

A tela de genética avançada é usada para identificar genes que estão associados a fenótipos de interesse (Lawson e Wolfe, 2011). Tanto a mutagênese química quanto a de inserção são usadas em telas de genética avançada (Patton e Zon, 2001). A mutagênese química é uma triagem baseada em três gerações, na qual homens adultos são tratados com mutagênicos químicos, como etil metano sulfonato (EMS), etil nitrosourea (ENU) ou mutagênicos físicos, como radiação gama, para gerar várias mutações em células germinativas (Varshney e Burgess, 2014). Os peixes portadores das mutações são então cruzados com fêmeas selvagens para gerar peixes F1 que contêm alelos únicos da mutação gerada. Peixes F1 são cruzados para gerar portadores F2 que são então cruzados para obter seus mutantes homozigotos na geração F3. A prole com os fenótipos desejados é então isolada e usada para mapeamento genético e sequenciamento para identificar o gene mutado (Patton e Zon, 2001). Outras variações dessa triagem, como o uso de haplóides e diplóides homozigotos, podem ajudar a reduzir o tempo e o esforço necessários para identificar o fenótipo e a mutação genética causadora (discutidos em detalhes por Patton e Zon, 2001). Linhas repórteres transgênicas que expressam proteínas fluorescentes no órgão de interesse podem ser combinadas com triagem genética direta convencional para rastrear facilmente mutantes de interesse. Uma tela de mutagênese baseada em ENU levou à identificação do peixe-zebra mutante lightbulb (lib) que mostra defeitos morfológicos e de segmentação de néfrons semelhantes aos embriões de peixe-zebra deficientes em ácido retinóico (RA). Verificou-se que os mutantes lib têm transição C para A no nucleotídeo 174 de aldh1a2, que é previsto para sintetizar uma proteína truncada de 58 aminoácidos de comprimento, anulando assim a função de aldh1a2 e afetando a síntese de RA a partir do retinaldeído. A análise do mutante lib, neckless (nls) com mutação pontual no domínio catalítico de embriões tratados com aldh1a2 e DEAB (inibidor da síntese de ácido retinóico) revelou que os níveis de RA modulam a segmentação de néfrons alterando a expressão espacial de fatores de transcrição específicos de segmentos (Wingert e Davidson, 2011; Begemann et al., 2001; Mullins et al., 1994). Outro mutante chamado Zeppelin ajudou a identificar o brac2 como um regulador do desenvolvimento de podócitos (Kroeger et al., 2017).

A mutagênese por inserção é um método baseado em transposon ou antivírus que é usado para inserir DNA aleatoriamente em diferentes loci genômicos, e esse DNA estranho ajuda a identificar o gene mutado (Amsterdam et al., 1999). O Laboratório Hopkins do MIT realizou uma triagem de mutagênese insercional em embriões de peixe-zebra usando um vetor retroviral. Eles identificaram 12 genes que estavam associados a fenótipos renais defeituosos mostrando cistos na região tubular glomerular, entre os quais quatro estavam ligados à formação de cílios (Sun et al., 2004). As desvantagens da abordagem genética avançada são que o processo de triagem é pesado e demorado. No entanto, os avanços na nova tecnologia de sequenciamento tornaram a abordagem da genética avançada muito mais eficiente.

Nocaute genético usando nucleases programáveis

Uma das principais vantagens de usar o peixe-zebra como organismo modelo é a disponibilidade de técnicas eficientes de edição do genoma, como CRISPR/Cas, TALEN e ZFN (Sertori et al., 2016). CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) / Cas9 é a tecnologia de edição de genoma mais versátil e comumente usada no peixe-zebra. Uma quimera de CRISPR RNA (crRNA) e crRNA transativador (tracrRNA) é projetada como um único RNA guia (sgRNA), que junto com a proteína Cas9/mRNA são injetados em embriões de peixe-zebra no estágio de uma célula (Varshney et al. , 2016). O sgRNA se liga à sequência de DNA alvo de 20 pb adjacente a uma sequência NGG de motivo adjacente de protoespaçador (PAM) no genoma, Cas9 então gera um corte de fita dupla na sequência de DNA alvo. Isso é então preferencialmente reparado por junção de extremidade não homóloga, que é um mecanismo de reparo propenso a erros que resulta na geração de inserção/exclusão aleatória (indel), levando a mudanças no quadro de leitura da sequência de codificação e, consequentemente, anula o funções do gene de interesse. Metodologias avançadas foram desenvolvidas nos últimos anos para aumentar a eficácia da técnica de edição do genoma baseada em CRISPR (Liu et al., 2019). É possível deletar um grande fragmento de DNA usando dois ou mais sgRNAs por vez (Kim e Zhang, 2020). Também é possível direcionar simultaneamente vários genes de forma eficiente em um único embrião de peixe-zebra (Shah et al., 2016). Muitos estudos foram realizados para gerar mutantes de peixe-zebra para recapitular doenças renais humanas usando a tecnologia CRISPR/Cas9. O nocaute mediado por CRISPR da proteína da membrana ciliar Arl13b resultou na geração de mutantes que imitam a "síndrome de Joubert" (Cantagrel et al., 2008). É relatado que mutações no gene ELMO1 humano contribuem para a nefropatia diabética. O peixe-zebra mutante elmo1 exibe fenótipos observados em embriões hiperglicêmicos gerados por knockdown do gene pdx1, como glomérulo maior, podócito defeituoso, pescoço mais curto e hiperfiltração, destacando assim a função conservada desse gene (Sharma et al., 2016). O peixe-zebra mutante magi2a exibe síndrome nefrótica resistente a esteróides, que também é observada em pessoas com mutações no MAGI2 (Jobst-Schwan et al., 2019). Essas observações destacam a adequação do peixe-zebra como organismo para modelar doenças renais humanas.

Outro método para gerar mutantes de peixe-zebra são as Nucleases Efetoras Semelhantes ao Ativador de Transcrição (TALEN) baseadas na edição do genoma. Nesta técnica, o domínio de ligação ao DNA TALE é feito de monômeros, cada monômero consistindo de repetições em tandem de 34 resíduos de aminoácidos que se ligam a um nucleotídeo específico na sequência de DNA. Essas sequências TALE são derivadas da bactéria patogênica Xanthomonas, que altera a transcrição de genes nas células hospedeiras (Boch e Bonas, 2010). O construto de direcionamento TALEN consiste em um sinal de localização nuclear, o domínio de ligação ao DNA e o domínio FokI nuclease em seus terminais carboxil. TALEN trabalha em pares com seus sítios de ligação localizados em cadeias opostas de DNA separadas por uma sequência espaçadora de 12 a 25 pb. As construções se ligam ao sítio alvo no núcleo e geram uma quebra de fita dupla, que é então reparada por uma junção de extremidade não homóloga (Liu et al., 2014). O peixe-zebra mutante gerado por CRISPR ou TALEN pode ativar genes que compensam a perda de genes de interesse, dificultando assim a descoberta da função do gene (Rossi et al., 2015). No entanto, é possível identificar esses genes compensatórios por análise de transcriptoma usando métodos de sequenciamento de próxima geração (NGS), que podem ajudar a identificar a função do gene de interesse. A identificação de genes e vias moleculares que compensam a perda de função de um gene pode ajudar a encontrar novos métodos de tratamento para mutações genéticas que causam doenças graves (El-Brolosy e Stainier, 2017).

Gene knock-down usando oligos antisense morfolino

Os morfolinos são oligonucleótidos não aniónicos que são relativamente estáveis ​​em comparação com os seus oligómeros de ADN ou ARN (Summerton, 1999). Os oligonucleótidos anti-sentido morfolino ligam-se ao ARNm de uma proteína alvo no seu local de iniciação da tradução e bloqueiam a sua tradução. Outro tipo de oligos antisense morfolino pode ter como alvo as junções de splicing e bloquear o splicing pré-mRNA (Summerton, 1999). O efeito oligo morfolino-antisense é transitório e pode ser usado para estudar o papel inicial do desenvolvimento dos genes de interesse. A injeção de morfolino-antisense oligo é feita no estágio celular 1-4 dos embriões de peixe-zebra e seu efeito pode ser observado até 3-5 dias após a fertilização (pdf) (Bill et al., 2009). Os oligonucleotídeos antisense morfolino geralmente exibem efeitos fora do alvo (Robu et al., 2007). Experimentos de controle, como um experimento de resgate, devem ser realizados injetando morfolino junto com mRNA que não pode ser direcionado por este oligo antisense para verificar sua especificidade (Eisen e Smith, 2008). Foi desenvolvido um morfolino fotoativado, cuja atividade pode ser controlada espacial e temporalmente pela exposição aos raios UV (Tallafuss et al., 2012). Numerosos estudos foram realizados usando o knock-down do gene oligomediado antisense morfolino para entender as doenças renais humanas. Por exemplo, o knock-down do gene da nefrocistina-3 levou à formação de cistos e hidrocefalia em embriões de peixe-zebra de maneira semelhante à doença do tipo nefronoftísica-3 (Zhou et al., 2010).

Os antibióticos aminoglicosídeos geralmente usados ​​para tratar muitas infecções com risco de vida são conhecidos por seu efeito nefrotóxico e ototóxico (Mingeot-Leclercq e Tulkens, 1999). A gentamicina é um antibiótico comumente usado que pode induzir lesão renal aguda (LRA) em peixe-zebra. A gentamicina causa achatamento do epitélio da borda em escova, perda do epitélio tubular, deformação da estrutura do glomérulo, fosfolipidose lisossômica e acúmulo de leucócitos ou detritos celulares no lúmen tubular, o que simula superdosagem de gentamicina em humanos (Cianciolo Cosentino et al., 2010). Zebrafish pode regenerar e substituir néfrons danificados. O insulto de gentamicina pode ser usado para estudar a regeneração renal em zebrafish (Kamei et al., 2015). A lesão da gentamicina induz uma resposta de regeneração que faz com que as células-tronco renais passem pelos estágios de especificação, proliferação e diferenciação para gerar novos néfrons. Em peixes adultos, leva cerca de 14 a 21 dias para regenerar os néfrons (Diep et al., 2011; McCampbell et al., 2015). A cisplatina, que é utilizada como quimioterápico no tratamento de tumores, também apresenta efeitos nefrotóxicos, como observado no peixe-zebra (Hentschel et al., 2005). A etimicina é outro aminoglicosídeo que pode ser usado enquanto mimetiza baixa nefrotoxicidade e ototoxicidade em embriões de peixe-zebra (Shao et al., 2020). Assim, AKI e regeneração renal podem ser estudadas em peixe-zebra com a ajuda desses antibióticos.

Lesão mecânica no rim

O propensophros peixe-zebra pode ser fisicamente ferido por ressecção, esfaqueamento ou crioinjúria. A lesão cirúrgica pode ser realizada usando pinças finas para esfaquear a área desejada do propensofros para criar um modelo AKI. Essa técnica foi usada para danificar o ducto pronéfrico próximo à cloaca, o que prejudicou o fluxo de fluidos e levou à formação de cistos em 30 minutos (Kramer-Zucker, 2005). Verificou-se que a redução na taxa de fluxo de fluido em propensofros gera contrapressão no local de entrada do fluido, causando expansão luminal do túbulo e formação de cisto. Outro grupo de pesquisadores fez obstrução no túbulo pró-néfrico a 50 hpf ou nos túbulos mesonéfricos de peixes-zebra com 12-meses de idade, usando pinças para beliscar a área próxima aos túbulos coletores distais (Hellman et al., 2010). Eles descobriram que a cicatrização dos túbulos leva a um aumento na taxa de batimento dos cílios e a uma regulação positiva do fator de transcrição foxj1a que regula a expressão gênica lipogênica. Isso sugere que a lesão dos túbulos pronéfricos gera um sinal mecanossensorial baseado em cílios para manter a homeostase dos néfrons.

Lesão renal induzida por laser

A ablação celular mediada por laser é usada como uma ferramenta para estudar a lesão renal e imitar AKI em peixe-zebra. Johnson et al., (2011) descreveram um método para ablação mediada por laser seguida de rastreamento de néfrons em regeneração. Eles injetaram 40 kDa dextran-FITC nos somitos do tronco de embriões de peixe-zebra em 48-55 hpf para rotular as células epiteliais do túbulo proximal, que foram então direcionadas para ablação mediada por laser em 72 hpf. Os embriões removidos foram então reinjetados com rodamina dextrano para rastrear as células epiteliais do túbulo proximal. Eles descobriram que um túbulo proximal totalmente desenvolvido foi formado no 7º dia após a ablação mediada por laser (Johnson et al., 2011). Outra alternativa é usar uma linha transgênica específica de rim para identificar células para ablação mediada por laser e monitorar o comportamento das células vizinhas. Uma luz laser violeta de 405 nm de comprimento de onda foi usada para atingir o túbulo pronéfrico do peixe-zebra Tg(atp1a1a.4:GFP) (Palmyre et al., 2014). Como os espectros de excitação GFP estão na faixa de luz azul a violeta, ele absorveu luz laser de 405 nm, que atua como um dissipador de energia para potencialmente induzir lesões nas células epiteliais alvo. Esta experiência levou à descoberta de que a migração celular é a resposta primária do epitélio danificado. A migração celular coletiva causou estiramento mecânico que forneceu estímulos para a proliferação celular para reparar o túbulo lesionado. Para determinar o momento em que o túbulo pronéfrico do peixe-zebra adquire a capacidade de regeneração, Yakulov et al., (2018) usaram um laser de fótons 2-para remover uma pequena parte dos túbulos pronéfricos em Tg(cldn2b:lyn-GFP) embriões em diferentes momentos e seguiram o processo de regeneração. Eles descobriram que a ablação dos túbulos pronéfricos de embriões de 2-dias de idade era rapidamente reparada por respostas migratórias, enquanto embriões de 1-dias de idade não tinham essa capacidade. Eles realizaram perfis de expressão gênica de embriões de peixe-zebra feridos e descobriram que cxcr4b e mica estão envolvidos nesse processo de reparo (Yakulov et al., 2018).

genética química

Pequenas moléculas bioativas podem ser usadas para interferir na função da proteína e entender seu papel biológico. Um grande número de bibliotecas químicas está disponível comercialmente ou pode ser personalizado para sondar funções de proteínas. Essas pequenas bibliotecas de moléculas incluem inibidores de quinase, inibidores de protease, receptores nucleares e ligantes que podem ser usados ​​para identificar o papel das vias de sinalização envolvidas no desenvolvimento e funcionamento de órgãos (Kawasumi e Nghiem, 2007). Nas últimas décadas, o peixe-zebra emergiu como um poderoso organismo modelo de vertebrado para triagem química de alto rendimento e pontuação fenotípica (Kaufman et al., 2009). Cao et al., (2009) usaram a abordagem de triagem química para identificar compostos que podem reverter fenótipos causados ​​por mutações em pkd2 (gene causal de PKD) e ift172 (um gene responsável pela formação de cílios). Eles descobriram que um inibidor de pan-histona desacetilase (pan-HDAC) tricostatina A (TSA) e um ácido valpróico (VPA) inibidor de HDAC específico de classe I podem suprimir a formação de cistos renais no modelo knock-out pkd2 (Cao et al., 2009 ). Assim, a genética química pode ser uma ferramenta útil para identificar novos candidatos a medicamentos que podem reverter ou suprimir as condições da doença.

Modelos de lesões renais induzidas geneticamente

Um modelo de ablação de tecido geneticamente induzível pode ser usado em peixe-zebra no qual a nitroredutase bacteriana (NTR) é expressa sob o controle de um promotor de escolha que impulsiona a expressão de NTR em um segmento específico do propensofros. A NTR converte o metronidazol em um metabólito citotóxico que pode causar a morte das células que expressam a NTR (Curado et al., 2008). Zhou e Hildebrandt (2012) usaram esta técnica para induzir lesão de podócitos expressando NTR sob o controle do promotor de podocina na linhagem de zebrafish Tg(pod: NTR-mCherry). Eles também desenvolveram uma linha transgênica dupla de VDBP-GFP (proteína de ligação à vitamina D marcada com GFP) como um marcador de proteinúria junto com a linha Tg(pod: NTR-mCherry). O tratamento com metronidazol causou a lesão do podócito, resultando em edema de corpo inteiro e acúmulo de VDBP-GFP nos túbulos proximais, mimetizando o fenótipo da síndrome nefrótica humana (Zhou e Hildebrandt, 2012).

Métodos para avaliar o desenvolvimento e a função de propensofros em peixe-zebra

Descrevemos os métodos para gerar modelos de doença renal humana usando peixe-zebra. A criação de um modelo de doença usando outro organismo é o passo inicial, que precisa ser avaliado quanto à sua capacidade de recapitular fielmente vários aspectos de uma doença observada em humanos. O Zebrafish oferece muitas vantagens que podem ser usadas para avaliar rapidamente sua capacidade de servir como um substituto para entender as doenças renais humanas, conforme discutido abaixo.

Triagem baseada em morfologia

Na maioria das vezes, os embriões de peixe-zebra mutantes apresentam diferenças morfológicas, em comparação com o tipo selvagem, que podem ser facilmente julgadas por observações ao microscópio. A transparência dos embriões de peixe-zebra e sua capacidade de sobreviver até 5 dias, mesmo com graves defeitos de desenvolvimento, é uma grande vantagem nas telas baseadas em morfologia. Alterações morfológicas comuns observadas em embriões de peixe-zebra com propensofros defeituosos incluem edema pericárdico, cistos propensofricos, eixo corporal curvo e hidrocefalia (Poureetezadi e Wingert, 2016; Outtandy et al., 2019). O edema é um dos sinais comuns de um rim defeituoso, que também é observado em deficiências de outros órgãos, como o desenvolvimento do coração (Hanke et al., 2013). Mutantes com defeitos renais podem desenvolver cistos devido a outra ver-proliferação de células epiteliais, como pode ser facilmente observado ao microscópio (Zhao e Malicki, 2007; Yamaguchi et al., 2006). Um eixo corporal curvo é freqüentemente visto em mutantes com defeitos nos cílios pronéfricos. Peixe-zebra mutante como Locke (lok), shen yantf214a (tímido), garbustm304 (grb) e zatortg238a (zar) são alguns outros exemplos que mostram o eixo do corpo curvo (Zhao e Malicki, 2007). Zebrafish mutantes com defeitos renais apresentam múltiplos defeitos morfológicos no mesmo embrião. O knock-down de dois genes de policistina pkd1a e pkd1b levou ao eixo do corpo oralmente curvado, hidrocefalia, cartilagem e defeitos craniofaciais com baixa frequência de cistos pronéfricos (Mangos et al., 2010). Os mutantes das proteínas de transporte intraflagelar ift57, ift88 e ift172, onde os cílios eram defeituosos, tinham o eixo do corpo curvado ventralmente (Lunt et al., 2009). Assim, os mutantes zebrafish com rins defeituosos exibem muitas características morfológicas que podem ser facilmente identificadas.

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