Complexos de manganês (II) estimulam a imunidade antitumoral agravando os danos ao DNA e ativando a via CGAS-STING

A ativação do estimulador cíclico da GMP-AMP sintase da via do gene do interferon (cGAS-STING) é uma estratégia imunoterapêutica promissora para o tratamento do câncer. Descobriu-se que complexos de manganês (II) MnPC e MnPVA (P=1, 10-fenantrolina, C=cloro e VA=ácido valpróico) ativam a via cGAS-STING . Os complexos não apenas danificaram o DNA, mas também inibiram as histonas desacetilases (HDACs) e a poliadenosina difosfato-ribose polimerase (PARP) para impedir a reparação de danos no DNA, promovendo assim o vazamento de fragmentos de DNA para o citoplasma. Os fragmentos de DNA ativaram a via cGAS-STING, que iniciou uma resposta imune inata e uma comunicação bidirecional entre as células tumorais e as células imunológicas vizinhas. O cGAS-STING ativado aumentou ainda mais a produção de interferons tipo I e a secreção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-a e IL-6), aumentando a infiltração tumoral de células dendríticas e macrófagos, além de estimular células T citotóxicas para matar células cancerígenas in vitro e in vivo. Devido à maior capacidade de danificar o DNA, o MnPC e o MnPVA mostraram imunocompetência e atividade antitumoral mais potentes do que os íons Mn2+, demonstrando assim um grande potencial como agentes quimioimunoterapêuticos para o tratamento do câncer.

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Introdução

A recorrência, metástase e resistência dos tumores aos medicamentos representam grandes desafios para os medicamentos antitumorais convencionais.1 A imunoterapia é uma estratégia eficaz para erradicar as células tumorais, aproveitando ou estimulando o sistema imunológico dos pacientes.2,3 Na última década, múltiplas imunoterapias contra o câncer, incluindo inibidores de checkpoint imunológico, vírus oncolíticos e células T receptoras de antígeno quimérico (CAR-T) foram aplicados na prática clínica para aumentar a imunidade antitumoral adaptativa.4–6 No entanto, resistência primária e adaptativa a medicamentos, ativação imunológica inadequada e perda de resposta específica do tumor os alvos antígenos freqüentemente prejudicam a eficácia da imunoterapia.7,8 A imunidade antitumoral adaptativa é altamente dependente de uma imunidade inata robusta.8 Além de moldar e sustentar a imunidade antitumoral adaptativa, o sistema imunológico inato, como a primeira barreira para defender as células hospedeiras, assume a responsabilidade fundamental pela reconhecimento de células tumorais.9 Infelizmente, durante a progressão do tumor, as células malignas muitas vezes escapam da vigilância imunológica e eventualmente se transformam em tumores "frios".10,11 Assim, ativar a imunidade inata e facilitar sua interação com a imunidade antitumoral adaptativa pode reforçar a imunidade respostas aos tumores e melhorar o efeito terapêutico da imunoterapia. Os estimuladores cíclicos da GMP-AMP sintase dos genes do interferon (cGAS-STING) constituem os componentes vitais da imunidade inata, que emergiram como alvos promissores para a imunoterapia do câncer.12,13 A ativação da via cGAS-STING desencadeia uma série de reações a jusante. eventos de sinalização, incluindo estimulação e recrutamento de quinase 1 de ligação a TANK (TBK1) e fator regulador de interferon 3 (IRF3), que induzem a liberação e secreção de interferons tipo I (IFN-Is) e fatores pró-inflamatórios IL-6 e TNF-a. 13,14 Os IFNs subsequentemente promovem a maturação e migração de células dendríticas (DCs), aumentam o efeito citotóxico mediado por células assassinas naturais (NK) e cruzam células T específicas do tumor, orquestrando assim a imunidade inata e adaptativa para regular o comportamento de tumores agressivos.15,16 Atualmente, o processo terapêutico do agonista oral de moléculas pequenas MSA-2,17 dinucleotídeos cíclicos agonistas naturais (CDNs)18 e alguns nanossistemas19–23 foram testados em modelos de tumores murinos para intervir na via cGAS-STING. O manganês (Mn) é um oligoelemento nutricional que desempenha papéis importantes em muitos processos fisiológicos, incluindo respostas imunes antitumorais.24,25 Recentemente, foram descobertos íons Mn2+ para aumentar a sensibilidade de um sensor de DNA de fita dupla (dsDNA). cGAS e desencadeiam a produção de um mensageiro secundário cGAMP, aumentando assim a atividade de STING através do aumento da afinidade de ligação cGAMP-STING.12,26 Além disso, os íons Mn2+ inibem indiretamente a progressão do tumor, promovendo a função de CD8+ Células T através da indução da produção de IFN in vivo. 27 No entanto, a administração direta de íons Mn2+ in vivo não pode garantir uma concentração eficaz no microambiente tumoral23 e o excesso de íons Mn2+ pode induzir toxicidades sistêmicas, como neurotoxicidade irreversível e toxicidade cardiovascular.28 Os complexos Mn são mais estável e inerte às biomoléculas devido ao efeito de proteção dos ligantes e, portanto, poderia aliviar a toxicidade dos íons Mn2+. No entanto, nenhum complexo de Mn foi utilizado para ativar a via cGAS-STING até o momento. Modificações epigenéticas alteram reversivelmente as expressões genéticas, o que pode contribuir para o início e progressão de cânceres e para a supressão da imunidade antitumoral. A natureza reversível da modificação epigenética permite que as células malignas retornem ao estado normal.29,30 As histonas desacetilases (HDACs) medeiam a acetilação de proteínas, a dinâmica da cromatina, a renovação de proteínas e as respostas a danos no DNA. Os inibidores de HDAC são uma classe de moduladores epigenéticos potentes, tendo a cromatina como alvo, agindo na maioria ou em todos os tipos de tumor.31 A inibição de HDACs contribui, pelo menos parcialmente, para a acetilação das histonas, resultando na formação alterada e no reparo da quebra da fita dupla do DNA ( DSB),32,33 o que pode contribuir para abolir a resistência aos medicamentos nas células cancerosas.34 A estrutura relaxada da cromatina induzida pelos inibidores de HDAC pode promover o acesso mais fácil dos agentes quimioterápicos ao DNA, agravando assim o dano ao DNA,35 o que é benéfico para a ativação de a via cGAS STING. Alguns inibidores de HDAC – como o ácido valpróico (VA) – afetam HDACs de classe I e II (HDAC1/2), que sensibilizam as células cancerígenas a terapias que danificam o DNA.36

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Polimerases de poliadenosina difosfato-ribose (PARPs) são proteínas essenciais envolvidas na resistência do câncer às quimioterapias. Essas enzimas são cruciais para o reparo de quebras de fita simples do DNA (SSBs)37 e participam de vários processos celulares, como apoptose, resposta imune, transcrição gênica e inflamação.38–40 Os inibidores de PARP previnem o reparo de lesões de DNA, levando ao enriquecimento do DNA citosólico, que é reconhecido pelo cGAS para ativar a via cGAS-STING.41,42 Descobriu-se que uma série de complexos metálicos anticancerígenos, incluindo aqueles de platina, rutênio e ouro, inibem a atividade PARP.43, 44 Aqui relatamos as propriedades imunoestimulantes e antitumorais de dois complexos MnII MnPC e MnPVA. As estruturas químicas e cristalinas dos complexos são mostradas na Fig. 1. Nestes complexos, 1,10-fenantrolina (P) é um intercalador de DNA não tóxico e VA é um inibidor de HADCs.31 VA poderia promover a acetilação de proteínas histonas conjugadas com DNA, aumentam a acessibilidade do DNA dentro da cromatina relaxada e reativam genes supressores de tumor adormecidos.33,35 Supomos que a incorporação de 1,10-fenantrolina e/ou VA em MnPC ou MnPVA pode conferir os complexos com atividade antiproliferativa induzindo danos ao DNA e estimulando a imunidade antitumoral. Uma série de experimentos mostrou que MnPC e MnPVA danificaram efetivamente o DNA, ativaram a via cGAS-STING em células tumorais e imunológicas e aumentaram a secreção de IFNs e citocinas pró-inflamatórias. Em particular, o MnPVA inibiu a atividade de HDAC1/2 e PARP1, ativando assim a via cGAS-STING de forma mais eficaz do que o MnPC. Todos os resultados foram confirmados in vitro e in vivo. Até onde sabemos, MnPC e MnPVA são os primeiros complexos MnII multifuncionais que suprimem células tumorais principalmente através da ativação da imunidade antitumoral através da via cGAS-STING iniciada por dano ao DNA.

Figura 1 Estruturas químicas e cristalinas de MnPC e MnPVA. Os átomos de hidrogênio são omitidos para maior clareza.

Resultados e discussão

Propriedades químicas e físicas

MnPC e MnPVA foram preparados de acordo com métodos da literatura e totalmente caracterizados por análise elementar, espectroscopia de IV (Fig. S1 †), ressonância paramagnética eletrônica (Fig. S2, † EPR) e cristalografia de raios X. Os parâmetros da estrutura cristalina e os comprimentos e ângulos de ligação selecionados são apresentados nas Tabelas S1 e S2 (ver o ESI †). O átomo de Mn nestes complexos exibiu uma geometria octaédrica distorcida com um número de coordenadas de 6. MnPC cristalizou no sistema de cristal monoclínico com o grupo espacial P21/c; MnII formou quatro ligações Mn-N com dois ligantes bidentados 1,{{10}}fenantrolina e duas ligações Mn-Cl. Os comprimentos da ligação Mn – N variam entre 2,281 e 2,369 Å, ou seja, o comprimento da ligação de Mn – N1, Mn – N2, Mn – N3 e Mn – N4 é 2,369 (4), 2,281 (3), 2,341 (3 ) e 2,287(3) Å, respectivamente, e o ângulo de N1–Mn–N2, N1–Mn–N4 e N2– Mn–N3 é 71,15(11) graus , 97.86(11) grau e 89.00(11) grau , respectivamente. Esta estrutura é um pouco diferente daquela relatada por Abbas et al., 45 onde o MnPC cristalizou no sistema cristalino triclínico com o grupo espacial P1. Consequentemente, os comprimentos e ângulos de ligação correspondentes diferem nestes casos. Semelhante a uma estrutura relatada, 46 MnPVA cristalizou no sistema cristalino monoclínico com o grupo espacial C2/c, possuindo um conjunto doador de N2O4. MnII coordenado com dois átomos de N de 1,10-fenantrolina, e quatro átomos de O de uma molécula de água e dois ligantes VA, respectivamente. Um dos VA reagiu como um ligante monodentado, enquanto o outro foi um ligante bidentado. O comprimento da ligação de Mn–N1 e Mn–N2 é 2,265(19) e 2,298(2) Å, respectivamente, e o de Mn–O1, Mn–O2, Mn–O3 e Mn–O5 é 2,2476(19), 2,260(2), 2,0639 (18) e 2,1471 (17) Å, respectivamente. Como um forte ligante quelante N, N, 1,10-fenantrolina estabiliza complexos de Mn contra a desmetalação. A estabilidade de MnPC e MnPVA em solução salina tamponada com fosfato (PBS, com 0,5% v/v DMSO, pH 7,4 e 37 graus) e meio de cultura celular (contendo 10% de FBS) foi investigada por espectroscopia UV visível (Fig. S3† ). Os espectros UV dependentes do tempo demonstram que estes complexos são estáveis ​​dentro de 72 horas.

Tabela 1 Valores de IC50 (mM) de MnPC e MnPVA contra diferentes linhagens celulares às 72 h, com MnCl2, VA, CDDP e P como referências. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP, n=3)

Atividade antiproliferativa

As atividades antiproliferativas dos compostos contra câncer de mama triplo-negativo humano (MDA-MB-231), câncer de pâncreas humano (PANC-1), câncer hepatocelular humano (HepG2), câncer de mama de camundongo (4T1) células linhas e a linha celular epitelial tubular renal normal humana (HK -2) foram avaliadas pelo ensaio MTT. MnCl2, VA, cisplatina (CDDP) e 1,10-fenantrolina (P) foram usados ​​como compostos de referência. As concentrações inibitórias semimáximas (IC50) às 72 h estão listadas na Tabela 1. MnPC e MnPVA mostraram atividade antiproliferativa potente em todas as linhas celulares de câncer testadas, particularmente para MDA-MB-231 e PANC-1 células que são insensíveis ao CDDP, exibindo atividade cerca de 8- e 11- vezes maior, respectivamente. A atividade antiproliferativa do MnPC e do MnPVA contra HepG2 e 4T1 é semelhante à do CDDP. Curiosamente, tanto o MnPC quanto o MnPVA mostraram uma toxicidade diminuída para as células HK -2, com valores de IC50 sendo ligeiramente superiores aos do CDDP. Por outro lado, MnCl2, VA e P foram quase atóxicos nessas linhagens celulares, o que está de acordo com a literatura.13,36 De acordo com esses resultados, as investigações a seguir focaram na ação de MnPC e MnPVA no MDA-MB. -231 células.

Absorção celular e danos ao DNA

O acúmulo dos complexos em células MDA-MB-231 em termos de Mn foi medido por co-incubação ICP-MS por 24 h. 2A, a acumulação segue uma ordem de MnPVA > MnPC > MnCl2, mantendo-se em linha com a sua atividade antiproliferativa. Determinamos ainda o Mn ligado ao DNA em células MDA-MB-231 por ICP-MS. 2B, MnPC e MnPVA exibiram maior capacidade de ligação ao DNA do que MnCl2, possivelmente devido à sua maior absorção celular. A histona fosforilada g-H2AX é um marcador sensível de quebras de fita dupla de DNA (DSBs).47 Para avaliar o dano ao DNA induzido pelos complexos de Mn, detectamos a expressão de gH2AX por imunotransferência. 2C, MnPC e MnPVA aumentaram a expressão de g-H2AX em células MDA-MB -231 às 24 h. Sabe-se que os complexos metálicos de P são intercaladores eficazes de DNA;48,49 no entanto, o P sozinho dificilmente causou danos ao DNA (Fig. S4†). A expressão de g-H2AX em tecidos tumorais de camundongos portadores de tumor 4T1 também foi investigada por imunofluorescência e tratamento com cada composto (1,3 mg Mn por kg) uma vez a cada 2 dias durante 16 dias. MnPC e MnPVA danificaram efetivamente o DNA no tecido tumoral, enquanto MnCl2 e PBS quase não afetaram o g-H2AX (Fig. S5†). O dsDNA liberado das células MDA-MB- 231 para o sobrenadante do meio de cultura foi determinado usando um kit ELISA após tratamento com os complexos Mn. 2D, o conteúdo de dsDNA no meio de cultura celular tratado com MnPC ou MnPVA foi evidentemente maior do que em outros grupos. Os resultados sugerem que MnPC e MnPVA podem elevar a instabilidade do DNA genômico e o nível de DNA citosólico. A natureza do dano ao DNA foi inicialmente estudada medindo as alterações de fluorescência de um sistema DNA-brometo de etídio (EB) do timo de bezerro. EB é um intercalador que proporciona um aumento significativo na fluorescência quando ligado ao DNA, enquanto a fluorescência diminui quando é deslocada.50 MnPC e MnPVA reduziram moderadamente a intensidade da fluorescência (Fig. S6†), sugerindo que esses complexos poderiam intercalar nas ranhuras do DNA para substituir o EB ligado devido à estrutura planar de P. No entanto, a interação não é uma ligação covalente robusta. Alguns complexos de Mn poderiam gerar espécies reativas de oxigênio intracelulares (ROS) e induzir estresse oxidativo,51 e, portanto, detectamos as ROS em células MDA-MB -231 por imagem confocal usando diacetato de 2′,7′ -dicloro-fluoresceína ( DCFH-DA) como sonda de fluorescência de ROS após exposição ao complexo Mn por 18 h. 3, MnPC e MnPVA intensificaram a fluorescência intracelular de ROS em comparação ao controle ou MnCl2, especialmente MnPVA, sugerindo que eles podem causar danos oxidativos ao DNA celular. O dano ao DNA não apenas contribui para a ação letal das células cancerígenas, mas também estimula a imunidade antitumoral ao ativar a via cGAS-STING.14,52

Fig. 2 Captação celular (A) e Mn ligado ao DNA (B) determinado por ICPMS, expressão do marcador de dano ao DNA g-H2AX determinada por western blotting (C) e dsDNA extracelular determinado usando o kit ELISA (D) após Células MDA-MB-231 foram tratadas com MnCl2, MnPC, MnPVA e VA (6 mM) respectivamente por 24 h.

Parada do ciclo celular e apoptose

A resposta ao dano ao DNA celular (DDR) está associada à sinalização que impulsiona a captura do ponto de verificação do ciclo celular.53 O impacto dos complexos de Mn no ciclo celular das células MDA-MB-231 foi analisado por citometria de fluxo. 4A, MnPC e MnPVA aumentaram levemente a parada da fase G1, causando um colapso completo da fase G2 em comparação com o controle e MnCl2. Os resultados indicam que o dano ao DNA induzido por MnPC e MnPVA bloqueou seriamente o estágio posterior da síntese de DNA. Assim, o mecanismo antiproliferativo do MnPC e do MnPVA difere daquele do MnCl2. O modo de morte das células MDA-MB-231 foi investigado por citometria de fluxo após tratamento com os complexos por 72 horas e coloração com anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI). 4B e S7,† em comparação com o controle e MnCl2, a taxa de apoptose (precoce + tardia) induzida por MnPC e MnPVA atingiu 84,0% e 87,4%, respectivamente. Os resultados indicam que o MnPC e o MnPVA possuem forte capacidade pró-apoptótica, que se correlaciona estreitamente com a sua atividade antitumoral.

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Potencial de membrana mitocondrial

As mitocôndrias são participantes centrais na imunidade inata, e o DNA mitocondrial (mtDNA) é reconhecido como um agonista do sistema imunológico inato.54 Foi relatado que tanto o DNA citosólico quanto o mtDNA se ligaram a receptores de reconhecimento de padrões e desencadearam a via de sinalização cGAS-STING. 55 Para explorar a possível liberação de mtDNA das mitocôndrias na presença de MnPC e MnPVA, verificamos a integridade da membrana mitocondrial por imagem confocal usando JC-1 como uma sonda fluorescente, que forma agregados e exibe fluorescência vermelha em mitocôndrias normais com alto DJm, enquanto existem como monômero e emitem fluorescência verde em mitocôndrias danificadas com baixo DJm. 56 Como mostrado na Figura 5, MnPC e MnPVA reduziram bastante a intensidade da fluorescência vermelha em células MDA-MB-231 coradas com JC-1. A razão de fluorescência "verde (G) para vermelho (R)" para células tratadas com MnPC e MnPVA é 4,91 e 5,66, respectivamente, significativamente maior do que para o controle (2,35) e células tratadas com MnCl 2- ( 1,75). As observações sugerem que a integridade da membrana mitocondrial foi danificada por MnPC e MnPVA, o que pode facilitar o vazamento de mtDNA no citosol para desencadear a via cCAS-STING.

Figura 3 Imagem confocal de fluorescência de ROS geradas pelos complexos Mn (12 mM) em células MDA-MB-231 após incubação por 18 h e coloração com DCFH-DA (10 mM) por 30 min.

Fig. 4 Parada do ciclo celular de células MDA-MB-231 após incubação com diferentes compostos (6 mM) por 24 h (A), e análise apoptótica de células MDA-MB-231 por citometria de fluxo após incubação com diferentes compostos (6 mM) por 72 h (B).

Atividade e expressão de HDACs

Os inibidores de HDAC sensibilizam as células cancerosas para terapias que danificam o DNA, alterando a estrutura da cromatina e impedindo o reparo do DNA.33,35 Como um inibidor de HDAC de classe I, o VA tem como alvo seletivo as enzimas HDAC1 e HDAC2, modulando a sinalização de danos ao DNA para destruir a estabilidade genômica e inibir o tumor. proliferação in vivo. 31 A incorporação de VA no MnPVA pode reforçar a inibição de HDAC e a indução de DDR de forma mais eficiente. Portanto, determinamos o efeito dos complexos de Mn na atividade total de HDAC em células MDA-MB-231 após coincubação por 48 h. 6A, o MnPVA inibiu significativamente a atividade total do HDAC, sendo a atividade inibitória cerca de 1,5 vezes maior que a do VA. Estudamos ainda a expressão de proteínas HDAC1/2 em células MDA-MB -231 por imunotransferência. Como mostrado nas Figuras 6B e C, o MnPVA obviamente regulou negativamente a expressão de HDAC1 e HDAC2 em comparação com o controle. Embora o MnPC tenha inibido a atividade do HDAC, dificilmente influenciou a expressão das proteínas HDAC1/2. Inesperadamente, o VA como um inibidor conhecido de HDAC não mostrou inibição óbvia no HADC1/2 nesta concentração (6 mM), destacando assim o papel essencial da coordenação do Mn na intensificação da inibição do VA no HADC. Os resultados indicam que o MnPVA é um inibidor eficaz de HDAC1/2, que promoveria a DDR e desencadearia a via cGAS-STING, estimulando assim a imunidade antitumoral. Detectamos ainda a expressão de HDAC em tecidos tumorais de camundongos portadores de tumor 4T1 por imunofluorescência após tratamento com cada composto. 6D, o MnPVA evidentemente diminuiu a expressão de HDAC1, enquanto o MnPC e o MnCl2 afetaram apenas ligeiramente ou pouco o HDAC1.

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Expressão de PARP1 e proteínas apoptóticas

Os PARPs desempenham um papel fundamental no reparo de lesões de DNA. Os inibidores de PARP previnem o reparo do DNA, o que leva à exportação de fragmentos de DNA para o citosol, desencadeando uma resposta imune inata mediada por cGAS.42 Como uma proteína sensora para quebras de fita de DNA, a PARP1 localiza-se nos locais de dano ao DNA e domina o reparo de DNA, tornando-se assim um alvo importante para a terapia do câncer. A ativação de caspases, especialmente caspase-3, poderia iniciar a apoptose através da clivagem de PARP1, que é considerada uma marca registrada da apoptose.38,57 Portanto, as expressões de caspase-3, PARP1 e PARP1 clivada em Células MDA-MB-231 foram examinadas por western blotting. Como mostrado na Fig. 7, MnPC e MnPVA regularam positivamente a expressão de caspase -3 e clivaram PARP1 em comparação com o controle e outros compostos. A clivagem de PARP1 pela caspase ativada -3 separaria o domínio de ligação ao DNA do domínio catalítico, evitando assim a ativação de PARP e o reparo de lesões de DNA. Além disso, a inibição da PARP1 pode aumentar o nível de linfócitos T infiltrantes do tumor e regular as respostas imunes inatas. A disfunção de reparo do DNA tem o potencial de iniciar aberrações globais do DNA, o que poderia desencadear a apoptose. As proteínas proapoptóticas Bax e antiapoptóticas Bcl-xL desempenham papéis essenciais na apoptose.38 Portanto, detectamos sua expressão em células MDAMB-231 após tratamento com diferentes compostos por 48 h usando western blotting. MnPC e MnPVA regularam positivamente a expressão de Bax e regularam negativamente a expressão de Bcl-xL. Os resultados indicam que MnPC e MnPVA poderiam promover a apoptose através da regulação de proteínas apoptóticas como um efeito cascata1-relacionado ao PARP. Embora o VA possa induzir a apoptose de células tumorais ao inibir a expressão de HDAC1/2 em altas doses,58 ele não afetou significativamente essas proteínas apoptóticas sob essa condição, significando a superioridade dos complexos de Mn.

Figura 5 Imagens de fluorescência de células MDA-MB-231 após incubação com MnCl2, MnPC e MnPVA (6 mM) respectivamente por 36 h e coloração com a sonda fluorescente JC-1.

Ativação da via cGAS-STING

Sabe-se que o inibidor de PARP1 pode provocar uma resposta em cascata de sinalização cGAS-STING em células cancerígenas.40,59 cGAS é um sensor imunológico inato que reconhece uma gama diversificada de dsDNA citosólico, incluindo DNA com micronúcleos virais, apoptóticos, exossômicos, mitocondriais. e origens dos retroelementos.60,61 O enriquecimento do DNA citosólico induzido por MnPC e MnPVA criou uma circunstância favorável para ativar a via cGAS-STING, que subsequentemente iniciaria eventos de sinalização a jusante através do recrutamento e ativação de TBK1 e IRF3.12,59 Portanto, detectamos a expressão dessas proteínas em células MDA-MB -231 por imunotransferência após exposição a cada composto por 24 horas. 8A, MnPC e MnPVA elevaram significativamente a expressão de cGAS, p-STING, p-TBK1 e p-IRF3. Além disso, investigamos o efeito dos complexos na via cGAS-STING em células THP-1 de leucemia monocítica humana por imunotransferência. 8B, MnPC e MnPVA induziram uma regulação positiva significativa de cGAS, p-STING, p-TBK1 e p-IRF3, especialmente MnPVA, manifestando que ativaram a via cGAS-STING, o que iniciaria a imunidade inata para bloquear o tumor escapa e estimula a imunidade adaptativa, sem prejudicar as células THP-1 (Tabela S3†). Por outro lado, o MnCl2 apenas aumentou o nível de p-STING ou p-TBK1 e quase não afetou a expressão de cGAS e p-IRF3 em comparação com o controle, o que pode ser devido à sua incapacidade de induzir danos ao DNA e clivagem de PARP1 em baixas concentrações , e, portanto, é incapaz de desencadear eventos de sinalização a jusante, como a ativação de p-IRF3. Com base nestes resultados, concluímos que MnPC e MnPVA induziram danos ao DNA nuclear e mitocondrial nas células tumorais e liberaram os fragmentos de DNA para o citoplasma, que então ativou a via cGAS-STING. O cGAS-STING ativado poderia ativar diretamente as vias de sinalização de senescência e apoptose em células cancerígenas,62 levando a uma resposta imune antitumoral bidirecional. No entanto, a expressão de STING, TBK1 e IRF-3 nas células MDA-MB-231 e THP-1 foi pouco afetada (Fig. S8†).

Fig. 6 (A) atividade HDAC, (B) expressão de proteínas HDAC1/2 e (C) o conteúdo de proteína correspondente em relação a GAPDH em células MDA-MB-231 após incubação com cada composto (6 mM) para 48 h determinado usando o kit ELISA e western blotting respectivamente; (D) imagens de imunofluorescência da expressão de HDAC1 no tecido tumoral 4T1 de um camundongo após tratamento com cada composto (1,3 mg Mn por kg) uma vez a cada 2 dias durante 16 dias. *p < 0.05, **p < 0.01 e ***p < 0,001.

Interferons e citocinas pró-inflamatórias

A ativação de TBK1 e IRF3 poderia induzir a expressão e secreção de IFNs e citocinas pró-inflamatórias, como IFN-b, TFN-a e IL-6.59,63 Assim, o IFN-I extracelular liberado pelo THP{ As células {8}} e o IFN-b, TNF-a e IL-6 liberados pelas células MDAMB-231 foram medidos por ensaio ELISA após incubação com diferentes compostos por 24 h. Como mostrado na Fig. 9, MnPC e MnPVA aumentaram dramaticamente a secreção de IFN-I em relação ao controle, MnCl2 e VA. Ao mesmo tempo, também desencadearam a secreção de IFN-b e TNF-a. No entanto, o nível de IL-6 aumentou apenas moderadamente. O IFN-I (IFN-a e IFN-b) desempenha múltiplas funções imunoestimulantes na imunidade antitumoral, como a promoção da maturação e apresentação de antígenos de DCs e a estimulação cruzada de células T específicas do tumor para matar células tumorais, unindo a imunidade inata e adaptativa.13 TNF -a está envolvido na necrose aguda do câncer mediada por dinucleotídeo cíclico (CDN) e no ajuste do inlato imunológico.59 Os resultados significam que MnPC e MnPVA podem estimular respostas imunes antitumorais e sugerem que eles podem superar a resistência dos tumores aos medicamentos, um mecanismo quimioimunoterapêutico.

Maturação de células derivadas da medula óssea (BMDCs)

Os BMDCs representam células heterogêneas de origem mieloide consistindo de progenitores mieloides e macrófagos imaturos, granulócitos e células dendríticas (DCs); elas estão envolvidas na resposta imune, suprimindo a ativação de células T e a ativação de macrófagos associados a tumores (TAM).64 Como principais células apresentadoras de antígenos (APCs), as DCs funcionam como uma ponte para a comunicação entre os sistemas imunológicos inato e adaptativo. 22

Fig. 7 Expressão de proteínas relacionadas ao reparo e apoptose do DNA em células MDA-MB -231 após exposição a diferentes compostos (6 mM) por 48 h, e o conteúdo proteico correspondente em relação à a-tubulina. *p < 0.{{10}}5, **p < 0,01 e ***p < 0,001.

Fig. 8 Expressão de proteínas envolvidas na via cGAS-STING determinada por western blotting após células MDA-MB-231 (A) e THP-1 (B) terem sido tratadas com 6 e 3 mM de diferentes compostos por 24 h, respectivamente, e o conteúdo proteico correspondente em relação ao GAPDH. *p < 0.{{10}}5, **p < 0,01 e ***p < 0,001.

Fig. 9 Secreção de (A) IFN-I em células THP-1, (B) IFN-b, (C) IL-6 e (D) TNF-a em MDA-MB{{ 7}} células após tratamento com diferentes compostos (6 mM) por 24 h. Os dados são apresentados como média ± DP (n {{10}}); *p < 0.05, **p < 0,01 e ***p < 0,001.

DCs maduras e ativadas podem apresentar um antígeno específico para linfócitos T e iniciar uma resposta adaptativa contra tumores.65 Para testar se a via cGAS-STING ativada por MnPC e MnPVA poderia induzir a maturação de BMDCs, testamos os marcadores de superfície em BMDCs por Citometria de fluxo após tratamento com o sobrenadante de células MDA-MB-231 incubadas com diferentes compostos por 24 h. Como mostrado na Figura 10A, em comparação com o controle, MnPC e MnPVA elevaram notavelmente a coexpressão dos marcadores de maturação CD86 e CD80, atingindo 36,62% e 43,15%, respectivamente. No entanto, o MnCl2 superou apenas moderadamente o do controle. Além disso, o complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHC-II) é expresso constitutivamente pelas APCs, que apresentam peptídeos antigênicos às células T. Como resultado, as respostas imunes adaptativas são iniciadas, mantidas e reguladas.8 Como mostrado nas Figuras 10B e C, MnPC e MnPVA aumentaram a expressão de MHC-II para cerca de 1,5-vezes a do controle. . Os dados sugerem que estes complexos induziram grandemente a maturação das BMDCs, o que pode desencadear as respostas imunitárias dos linfócitos T citotóxicos.

Fig. 10 (A) Co-expressão de CD86 e CD80, (B) análises quantitativas de CD11c+CD86+CD80+ em BMDCs, (C) expressão de MHC-II na superfície dos BMDCs, e (D) intensidade média de MHC-II determinada por citometria de fluxo após tratamento com o sobrenadante de células MDA-MB-231 incubadas com diferentes compostos (6 mM) por 24 h.

Co-cultura de células cancerígenas com PBMCs

Para avaliar melhor os efeitos imunomoduladores dos complexos, a viabilidade das células MDA-MB -231 na presença de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) ativadas por drogas foi avaliada pelo ensaio MTT de acordo com um método da literatura.66 Células cancerosas ou células cancerígenas com PBMCs foram definidas como controles. Como mostrado na Figura 11, na ausência de PBMCs, MnPC e MnPVA suprimiram a viabilidade celular para 64,98% e 62,02%, respectivamente. A cocultura das células com PBMCs sem complexo Mn apresentou apenas citotoxicidade basal com viabilidade celular média de 81,49%. Contudo, na presença de PBMCs, MnPC e MnPVA suprimiram a viabilidade celular para 38,19% e 36,98%, respectivamente. Nesta concentração (6 mM), a maioria das PBMCs ainda estão vivas (Fig. S9†). Os resultados demonstram que MnPC e MnPVA podem ativar a resposta imune de PBMCs para exercer efeitos citotóxicos em células MDA-MB-231, exibindo assim um efeito sinérgico significativo contra as células cancerígenas.

Toxicidade aguda e atividade anticâncer in vivo

A toxicidade aguda dos complexos MnII foi avaliada em camundongos Balb/c fêmeas. A dose letal mediana (LD50) e as alterações no peso corporal após a injeção intravenosa de cada complexo foram determinadas. O LD50 de MnPC e MnPVA foi 16,08 ± 2,16 e 25,16 ± 3,19 mg kg−1, respectivamente (Fig. S10†), que são muito mais altos do que isso de CDDP (4,{{60}}6 ± 1,02 mg kg-1).67 Nenhuma alteração significativa no peso corporal foi observada nos camundongos tratados com MnPC e MnPVA. Os resultados indicam que MnPC e MnPVA são pouco tóxicos para mamíferos. Curiosamente, amarrar o VA ao complexo Mn atenuou a toxicidade geral ou aumentou a biocompatibilidade. Além disso, foram estabelecidos modelos de ratinho portadores de cancro da mama 4T1 para avaliar a actividade anticancerígena de MnPC e MnPVA in vivo. 12, após tratar os camundongos com PBS, MnCl2, MnPC e MnPVA (1,3 mg Mn por kg), respectivamente, durante 16 dias, MnPC e MnPVA mostraram inibição mais eficaz no crescimento do tumor do que MnCl2. No dia 16, o volume médio do tumor (A, B) diminuiu para 554,78 ± 43,76 e 348,01 ± 39,61 mm3, respectivamente, para os camundongos tratados com MnPC e MnPVA, enquanto para os camundongos tratados com PBS e MnCl2- ratos tratados foi 1182,01 ± 95,87 e 784 ± 64,93 mm3, respectivamente. O peso médio do tumor (C) foi de 1,41 ± 0,13, 0,95 ± 0,19, 0,82 ± 0,19 e 0,59 ± 0,1 g para os camundongos tratados com PBS, MnCl2-, MnPC e MnPVA, respectivamente. Obviamente, o efeito inibitório tumoral do MnPVA foi superior ao do MnPC e MnCl2, o que pode ser devido à inibição eficaz da expressão de HDACs pelo MnPVA. Além disso, nenhuma anormalidade patológica aparente ou lesão no peso corporal (D), sobrevivência e anatomia macroscópica do órgão foi observada (Fig. S11†). Estes resultados sugerem que os complexos MnII são candidatos promissores a medicamentos para terapia do câncer.

Fig. 11 Viabilidade média (%) de células MDA-MB-231 após co-incubação com PBMCs ativadas por composto (6 mM) por 48 h. Os dados são apresentados como média ± DP (n=3); **p < 0.01 e ***p < 0,001.

Resposta imune anticâncer in vivo

A capacidade imunoestimulante in vivo dos complexos MnII foi testada em camundongos Balb/c portadores de tumores 4T1. O status das células imunológicas no tumor, baço e linfonodos drenantes de tumor (LNs) foi analisado por citometria de fluxo.21 As células T CD8+ são essenciais para restringir o início do câncer e a progressão maligna no sistema imunológico, e a indução de linfócitos T citotóxicos (CTLs) requer a ativação de DCs imaturas em células maduras,8,9 que foram denotadas como células CD11c+ CD80+ CD86+.68 Como mostrado nas Figuras 13A e B , nos camundongos tratados com MnPVA, a porcentagem de DCs maduras denotadas pela expressão dos receptores coestimulatórios CD80+ e CD86+ (ref. 69) foi maior (45,59%) em LNs do que isso tratados com PBS, MnCl2 e MnPC, respectivamente. Os macrófagos são partes integrantes do sistema imunológico, modulando o microambiente tumoral.70 De acordo com as funções, os macrófagos podem ser classificados em estados de ativação fenotípica tumoricida M1 e protumoral M2.71 Os macrófagos M1 são marcados por TNF-a, IL-12 , CD80, CD86 e morte direta de células tumorais,70 enquanto TAMs semelhantes a M2- são caracterizados por alta expressão do receptor 1 de manose de macrófagos (MMR ou CD206) e promoção do crescimento de células tumorais, como além de exibir forte atividade imunossupressora. Sabe-se que inibidores de HDACs podem potencializar mudanças pró-em movimento na polarização de macrófagos e melhorar o fenótipo M1, além de prevenir o reparo do DNA.72 Portanto, detectamos a polarização de macrófagos no baço e no tumor por citometria de fluxo após tratamento com os complexos de Mn. 13C-E e S12A-C, † o fenótipo M2 marcado por CD206+ foi significativamente suprimido e o fenótipo M1 marcado por CD86+ foi notavelmente aumentado nos ratos tratados com MnPVA. Os resultados indicam que o MnPVA induziu eficazmente a polarização dos macrófagos do fenótipo M2 para o M1. MnCl2 e MnPC também aumentaram a expressão de CD86, mas influenciaram apenas levemente o CD206 em comparação com PBS. Enquanto isso, IFN-b, IL-6 e TNF-a secretados por DCs maduras e macrófagos foram medidos por ELISA. Como mostrado nas Figuras 13F e G, o MnPVA aumentou os níveis de IFN-b e TNF-a de forma mais eficaz do que PBS, MnCl2 e MnPC, o que pode induzir células T a matar células tumorais. No entanto, nenhuma alteração significativa na IL-6 foi observada (Fig. S13†).

Fig. 12 Efeito terapêutico de MnPC, MnPVA e MnCl2 em camundongos portadores de tumor 4T1, usando PBS como controle. (A) Imagens de tumores excisados, (B) volume do tumor, (C) peso do tumor e (D) peso corporal dos camundongos após tratamento com PBS, MnCl2, MnPC e MnPVA, respectivamente, a 1,3 mg Mn por kg uma vez a cada 2 dias durante 16 dias. **p < {{10}}.01 e ***p < 0,001.

Fig. 13 DCs maduras (CD80+CD86+ fechadas em CD11c+) e análises quantitativas em linfonodos drenantes de tumor (A e B), a polarização de macrófagos (CD206+CD{ {7}} fechado em CD11b+) no tecido tumoral 4T1 de um camundongo (C – E) determinado por citometria de fluxo e análises ELISA de IFN-b (F) e TNF-a (G) em soro de camundongos após tratamento com cada composto (1,3 mg Mn por kg) uma vez a cada 2 dias durante 16 dias. Os dados são apresentados como média ± DP (n=3). *P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,001.

Após a ativação da via cGAS-STING em DCs e macrófagos por MnPC e MnPVA, os IFNs-I secretados e as citocinas pró-inamatórias poderiam estimular os linfócitos citotóxicos.59 Portanto, avaliamos ainda a ativação de células T citotóxicas (CD8+ ) e células T auxiliares (CD4+ ) em tecidos tumorais e do baço, respectivamente. Como mostrado na Figura 14A e S12D-F†, as células T CD8+ (quadrado azul) em tumores foram efetivamente ativadas (9,18%) nos camundongos tratados com MnPVA em comparação com aqueles tratados com PBS (3,53% ), MnCl2 (4,48%) e MnPC (6,05%); As células T CD4+ (quadrado vermelho) também foram ligeiramente ativadas e os resultados foram opostos aos do baço após o tratamento com os complexos. A Fig. 14B mostra que as frequências de células T CD8+ ativadas (CD{20}}) que infiltram tumores foram dramaticamente aumentadas. Todos estes resultados indicam que o MnPVA foi capaz de estimular fortes respostas imunitárias in vivo devido à activação da via cGAS-STING.

Fig. 14 Células CD8+ (quadrado azul) e CD4+ T (quadrado vermelho) (A) e porcentagens do subconjunto CD69+ entre células T CD8+ ( B) no tecido tumoral 4T1 de um camundongo após tratamento com cada composto (1,3 mg Mn por kg) uma vez a cada 2 dias durante 16 dias determinado por citometria de fluxo.

Mecanismo de ação

foi proposta ação para os complexos de Mn conforme mostrado na Fig. 15. Nas células tumorais, MnPC ou MnPVA danificaram o DNA nuclear e/ou mitocondrial, levando à regulação positiva de g-H2AX; entretanto, o complexo inibiu a atividade de HDAC1/2 e PARP1, prejudicando assim a capacidade de reparo do DNA e intensificando os danos ao DNA. Os fragmentos de DNA acumulados foram liberados do núcleo e/ou mitocôndrias para o citoplasma e reconhecidos pelo cGAS para ativar o STING. O STING por sua vez estimulou a fosforilação de TBK1 e IRF3 e a translocação para o núcleo, induzindo a produção de IFNs, IL-6 e TNF-a. Esses IFNs e citocinas pró-inamatórias foram então secretados do núcleo para o citosol e posteriormente para o microambiente tumoral, onde promoveram a maturação e a apresentação de antígenos de DCs e macrófagos, e ativaram ainda mais células T citotóxicas para matar células cancerígenas. Eventos semelhantes também ocorreram em células imunes, como macrófagos, e a via cGAS-STING-TBK1 foi ativada. A ativação da via cGAS-STING iniciou respostas imunes inatas e comunicação bidirecional entre células tumorais e células imunológicas vizinhas para aumentar o efeito de morte em tumores.21 Consequentemente, os complexos de Mn mostraram potente atividade antitumoral devido à sinergia entre quimioterapia e imunoterapia. . A maioria destes processos foi comprovada in vitro ou in vivo.

Fig. 15 Mecanismo de ação proposto para complexos de manganês.

Conclusão

Evidências crescentes mostram que muitos complexos metálicos interagem com células tumorais e imunológicas para remodelar microambientes imunossupressores, além de exercer um efeito citotóxico direto nas células tumorais.73 Neste estudo, apresentamos dois complexos MnII MnPC e MnPVA como potenciais quimio-imunoterapêuticos para conter o câncer por meio de estimulação respostas imunes inatas, bem como quebra de fitas duplas de DNA. Esses complexos multifuncionais matam as células cancerígenas não apenas danificando o DNA, mas também reativando as respostas imunológicas adormecidas. Em primeiro lugar, actuam como quebradores de ADN, induzindo danos oxidativos no ADN e produzindo fragmentos de ADN; em segundo lugar, actuam como inibidores de HDACs e PARP1, prevenindo a reparação de danos no ADN e reforçando lesões no ADN; em terceiro lugar, actuam como agonistas da via cGAS-STING, induzindo a secreção de IFNs e citocinas pró-inflamatórias para promover a maturação de DCs e macrófagos, e estimulando ainda mais as células T específicas do tumor para matar as células tumorais.

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Em suma, o MnPC e o MnPVA activaram eficazmente a via cGAS-STING e restringiram o crescimento de células cancerígenas in vitro e in vivo. Amarrar VA ao complexo MnII potencializou dramaticamente sua inibição em HDACs e fortaleceu a atividade antiproliferativa do complexo, e a formação de complexos de Mn fornece uma diminuição significativa na atividade antiproliferativa de MnCl2 e 1,10-fenantrolina. Desde que Jiang et al. relatou pela primeira vez a atividade estimulante do Mn2+ para a via cGAS-STING,12 nenhuma propriedade desse tipo foi descoberta em complexos de Mn. Este estudo demonstra que a capacidade estimulante de MnPC e MnPVA para a via cGAS-STING é muito maior do que a de MnCl2 ou Mn2+ em células tumorais e imunes porque induziram mais fragmentos de DNA no citoplasma para ativar o cGAS -Caminho STING. As descobertas significam que agonistas cGAS-STING mais potentes poderiam ser obtidos através da construção de complexos MnII com ligantes que danificam o DNA ou que bloqueiam o reparo do DNA.

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