Uma vacina MRNA provoca respostas imunes antitumorais dependentes de STING

Abstrato

As vacinas de RNA formuladas em lipídios têm sido amplamente utilizadas para prevenção e tratamento de doenças, mas o seu mecanismo de ação e os componentes individuais que contribuem para tais ações ainda não foram delineados. Aqui, mostramos que uma vacina terapêutica contra o câncer composta por um núcleo de protamina / mRNA e um invólucro lipídico é altamente potente na promoção de respostas de células T CD8+ citotóxicas e na mediação da imunidade antitumoral. Mecanisticamente, tanto o núcleo do mRNA quanto o invólucro lipídico são necessários para estimular totalmente a expressão de interferons tipo I e citocinas inflamatórias nas células dendríticas. A estimulação da expressão do interferon-b depende exclusivamente do STING, e a atividade antitumoral da vacina de mRNA é significativamente comprometida em camundongos com um gene Sting defeituoso. Assim, a vacina de mRNA provoca imunidade antitumoral dependente de STING.

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1. Introdução

O rápido desenvolvimento e a aplicação mundial de vacinas de mRNA para a prevenção da infecção por SARS-CoV-2 demonstraram o poder dos medicamentos baseados em mRNA na área da saúde1,2. Devido ao seu grande peso molecular e carga negativa, as moléculas de mRNA precisam ser empacotadas em veículos de entrega para entrarem efetivamente nas células de mamíferos. A embalagem em veículos de entrega de tamanho nanométrico também tem o benefício de proteger as moléculas de mRNA da degradação enzimática. Múltiplas plataformas de entrega foram desenvolvidas para atender a esse propósito, como nanopartículas lipídicas4, lipopoliplex (LPP)5, lipossoma-protamina-RNA (LPR)6, RNA lipoplex (RNA-LPX)7 e partícula de vacina semelhante a vírus (VLVP). )8. Embora cada plataforma tenha sua própria estrutura e composição únicas, a maioria dos veículos contém uma molécula lipídica iônica que facilita o empacotamento de mRNA e o escape de moléculas de mRNA dos endossomos. Com o sucesso das vacinas profiláticas, existe uma percepção geral de que a terapêutica com mRNA pode ser usada para tratar talvez a maioria, se não todos, os tipos de doenças9e12. Na verdade, vacinas terapêuticas contra o câncer baseadas em mRNA têm sido estudadas há muitos anos13,14. Avanços recentes em ensaios clínicos também demonstraram seu potencial de aplicação em pacientes com câncer selecionados15e17. Ao contrário das vacinas peptídicas contra o câncer que são preparadas com moléculas adjuvantes18e20, as partículas da vacina de mRNA também podem servir como autoadjuvantes21.

Por exemplo, uma vacina contra o câncer baseada em mRNA de dois componentes contendo mRNA livre e complexado com protamina também pode ativar a sinalização do receptor toll-like 7 (TLR7) . No entanto, com a crescente preocupação com a toxicidade imunológica inata aguda do mRNA nu, a maioria dos investigadores e empresas estão usando RNA modificado para evitar o reconhecimento inato pelos TLRs23. Consequentemente, os componentes lipídicos desempenham um papel importante no aumento da actividade adjuvante na partícula da vacina de ARNm, preferencialmente através da activação da sinalização não-TLR. Um estudo recente sobre o RNA-LPX carregado negativamente, formulado com lipídios, constituído por lipossoma de 1,2- di-octadecenil-3-trimetilamônio (DOTMA, um lipídio catiônico)/dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE, um lipídio auxiliar) revelou ativação do eixo antagonista do receptor de interleucina 1 (IL1)-interleucina 1 (IL-1ra) na regulação da secreção de citocinas pró-inflamatórias e o papel essencial de ativação da via do inflamassoma em duas etapas em monócitos24. Curiosamente, outra investigação recente sobre o BNT162b2 baseado em LNP preparado com ALC-0315 (um lipídio ionizado), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC, um lipídio auxiliar) , polietilenoglicol-2000-N, N-di tetradecil acetamida (PEG2000-DTA) e colesterol mostraram o papel fundamental da ativação da sinalização MDA5 dependente de interferon tipo I, mas não de TLRs ou inflamassoma, na estimulação de ambos imunidade inata e adaptativa da vacina COVID-1925. Estes estudos apontam para a possibilidade de que plataformas de entrega compostas por moléculas lipídicas variáveis ​​possam depender de diferentes vias de transdução de sinal para a atividade da vacina. Assim, é importante investigar completamente a função das moléculas-chave e suas combinações, a fim de melhorar ainda mais a terapêutica do mRNA.

No presente estudo, montamos experimentos para dissecar o papel funcional de componentes individuais em uma vacina terapêutica contra o câncer. A partícula de vacina de mRNA (MVP) é composta por um núcleo de protamina/mRNA que é encapsulado em um invólucro lipídico que consiste em um lipídio catiônico, um lipídio auxiliar, um lipídio peguilado e colesterol (Fig. 1A). Foi demonstrado que a inclusão de lipídios carregados pode facilitar a entrega de RNA direcionado26, e dioleoiletilfosfatidilcolina (EDOPC) e dioleoil-3-trimetilamônio propano (DOTAP) são dois dos lipídios catiônicos que foram testados para esse fim5,27. Examinamos a estimulação da expressão de interferon-b (IFN-b), IL-1b e fator de necrose tumoral-a (TNF-a) pelo núcleo de mRNA, veículo livre de mRNA e todo o MVP, e correlacionaram tais atividades com o TLR7, sinalização antiviral mitocondrial (MAVS, também conhecida como IPS-1), estimulador de genes IFN (STING) e sinalização de IFN-b indutora de adaptador contendo domínio TIR (TRIF). Posteriormente, investigamos o papel da protamina no núcleo e do lipídio catiônico na casca na estimulação da expressão de IFN-b e TNF-a. Finalmente, comparamos as respostas imunes antitumorais do MVP em camundongos do tipo selvagem e com gene knockout.

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2. Materiais e métodos

2.1. Materiais

1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (EDOPC) (890704), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidil-etanolamina (DOPE) (850725 ), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [amino(polietilenoglicol)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOTAP) (890890), 1,2- dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) (850375) foram adquiridos da Avanti Polar Lipids, Inc. Birmingham, Alabama, EUA). O colesterol (C8667) foi obtido da Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, EUA). Os reagentes foram dissolvidos em etanol na concentração de 2 mg/mL para DSPE-PEG2k, 10 mg/mL para colesterol e DOPC e 20 mg/mL para EDOPC, DOPE e DOTAP, respectivamente. O sulfato de protamina (P4020) foi obtido da Sigma Aldrich. Moléculas de mRNA que codificam ovalbumina (OVA-mRNA) (L-7210), eGFP (eGFP mRNA) (L-7201) e luciferase (Luc-mRNA) (L-7204) foram adquiridas de TriLink Biotechnologies (San Diego, CA, EUA). Água livre de RNase (W0805-010) foi obtida da GeneDEPOT (Baker, TX, EUA). O agonista de TLR7 imiquimod (tlrimq) e o agonista de Sting 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) eram produtos da Invivogen (San Diego, CA, EUA). Lipofectamine 2000 (11668019) e kit de ensaio de RNA Quant-iT™ RiboGreen™ (R11490) foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA). O GM-CSF de ratinho recombinante (554586) foi adquirido à BD Biosciences (San Diego, CA, EUA). O coquetel inibidor do transportador de proteínas 500 (00-4980-93) era um produto da Invitrogen. O kit Cytofix/Cytoperm (AB_2869010) foi adquirido da BD Biosciences. O Kit de Isolamento de Células T de Rato EasySep™ (19851) foi obtido da STEMCELL Technologies, Inc. (Vancouver, BC, CAN). Os seguintes anticorpos foram adquiridos da BioLegend (San Diego, CA, EUA): anti-CD80-PE-Cy7 (104734), anti-CD86-FITC (105006), anti-CD11b-APC- Cy7 (101226), anti-CD8-BV510 (100752), anti-CD44-APC (103012), anti-CD69-APC (104514) e anti-H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), anti-CD64- PE-Cy7 (139314), anti-B220-APC (103212), anti-MHCII-BV711 (107643) e anti-CD103-PE (121406). Anti-CD{108}}FITC (553723), anti-LY6C-AF700 (557979) e anti-IFN-g-PE (554412) eram da BD Biosciences. OVA257e264-MHCI dextramerPE (JD2163) foi adquirido da ImmuDex (Fairfax, VA, EUA). Os kits ELISA para IL-1b (EM2IL1B) e TNF-a (BMS607-3) foram adquiridos da Invitrogen, e os kits ELISA para CCL5 (DY478) e IFN-b (DY8234) foram obtidos da R&D Systems (Minneapolis, MN, EUA). Anticorpos para análise de Western blot incluindo anti-MAVS (4983), anti-STING (13647), anti-TBK1 (3504), antifosfo-TBK1 (5483), anti-b-actina (4970) e anti-GAPDH (5174) foram adquiridos da Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, EUA).

Figura 1 Preparação e caracterização de partículas de mRNA. (A) Vista esquemática da preparação de partículas de vacina. (B) A eletroforese em gel de agarose mostra que as moléculas de mRNA foram retidas no poço de carregamento da amostra em amostras preparadas com mRNA/protamina na proporção de 1:1 a 1:2. (CeF) Caracterização de partículas de vacina de mRNA (MVPs) com base na porcentagem de encapsulamento, índice de polidispersidade, potencial zeta e tamanho. (G) Imagens TEM representativas de partículas MVP2, barra de escala Z 50 nm. (H) Porcentagem de expressão de eGFP após células DC2.4 terem sido tratadas com eGFP-MVPs por 16 h. (I) Imagem fluorescente de células DC2.4 que expressam eGFP, barra de escala Z 400 mm. (J) Análise quantitativa da bioluminescência em BMDCs tratadas com MVPs encapsulados com mRNA codificador de luciferase por 16 h. (K) Alterações na viabilidade de BMDCs tratadas com PBS, veículo livre de mRNA, núcleo de mRNA/protamina ou MVP2 encapsulado em mRNA. As concentrações de tratamento foram equivalentes a mRNA. Os dados são apresentados como média SEM (n Z 3). *P < 0,05; **P < 0,01.

2.2. Linhas de células e cultura de células

A linha celular dendrítica murina DC2.4 foi obtida da ATCC (Manassas, VA, EUA) e foi cultivada em RPMI -1640 contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina. A linha celular de melanoma murino B16-OVA foi adquirida do Dr. Kenneth Rock, Dana-Farber Cancer Institute (Boston, MA, EUA). Células B16-OVA foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina. A linha celular MC38 de adenocarcinoma do cólon murino foi adquirida à ATCC. As células foram projetadas com expressão de OVA e foram cultivadas em DMEM com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina. A cultura celular foi mantida a 37°C com 5% de CO2.

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2.3. Preparação de partículas de vacina de mRNA

Todas as partículas de vacina de mRNA foram preparadas usando o instrumento microfluídico NanoAssemblr Benchtop da Precision Nanosystems, Inc., (Vancouver, BC, CAN) misturando a fase orgânica e a fase aquosa. Para preparar a fase orgânica, EDOPC (20 mg/mL), DOPE (20 mg/mL), colesterol (10 mg/mL) e bis-DSPE-PEG2k (2 mg/mL) foram dissolvidos em etanol e misturados a 34 Proporção :30:35:1 M com vazão de 9 mL/min. Para preparar o núcleo de mRNA da fase aquosa, o mRNA foi misturado com sulfato de protamina a 1:1 (p/p) no instrumento microfluídico a uma vazão de 9 mL/min. Após 20 min de incubação a 20°C, o núcleo de mRNA da fase aquosa foi misturado com a fase orgânica para gerar partículas de vacina de mRNA. Após 20 min, a suspensão de partículas de vacina foi transferida para um filtro ultracentrífugo Amicon (MWCO 30 kDa) e foi adicionado 9-volume de água de grau molecular para diluir a concentração de etanol de 25% para 2,5%. A suspensão de partículas foi então concentrada por centrifugação a 2.000 g (Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) a 4°C. Um volume igual de 2 PBS foi adicionado ao produto concentrado para ajustar a pressão osmótica.

2.4. Ensaio de retardo de gel

O núcleo de mRNA/protamina foi primeiro analisado por retardamento em gel. Resumidamente, o núcleo de mRNA/protamina contendo 0,5 mg de mRNA foi carregado no poço de um gel de agarose a 1% em solução de 1 TBE e a eletroforese foi realizada a 120 V por 30 min (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Hércules, CA). As bandas de RNA foram coradas com Gelred (Biotium, Hayward, CA) e detectadas com um sistema GelDoc (Gel Doc XRþ, BioRad Co., Ltd.).

2.5. Caracterização de partículas de vacina de mRNA

A distribuição de tamanho e o potencial zeta foram medidos com Zetasizer de dispersão dinâmica de luz (Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Westborough, MA, EUA). A taxa de encapsulamento foi determinada utilizando um kit de ensaio de RNA Quant-iT™ RiboGreen™. Resumidamente, uma amostra de partícula de vacina contendo 00,5 mg de mRNA foi diluída com um tampão TriseEDTA (10 mmol/L de TriseHCl, 1 mmol/L de EDTA, pH 7,5) com ou sem 2% de Triton-X100 em um { {10}}placa de poço. Após 10 min de incubação a 37°C, RiboGreen foi adicionado em cada poço e a intensidade fluorescente foi medida. A eficiência de encapsulamento foi calculada como mostrado na Eq. (1): A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) das partículas da vacina foi realizada seguindo procedimento descrito anteriormente9.

2.6. Animais

Todas as operações com animais foram aprovadas pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Metodista de Houston (número de protocolo AUP06200042). Os ratos foram alojados em um ambiente que cumpria completamente os padrões regulatórios do Instituto Nacional de Saúde e da Associação Americana de Cuidados com Animais de Laboratório. Camundongos C57BL/6J de tipo selvagem e camundongos geneticamente modificados incluindo camundongos Tlr7/, Sting/, Mavs/ e Trif/ foram adquiridos do Jackson Laboratory.

2.7. Geração de células dendríticas derivadas da medula óssea murina (BMDCs)

As células da medula óssea foram eliminadas do fêmur e da tíbia com RPMI 1640 completo. Os glóbulos vermelhos foram lisados ​​com um tampão de lise ACK e as células imaturas da medula óssea foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 20 ng/mL de GM-CSF murino recombinante por 10 dias a 37 C com 5% de CO2. O meio de cultura celular foi atualizado nos dias 3, 6 e 8, e as células dendríticas não aderentes foram coletadas no dia 10.

2.8. Medição de citocinas e quimiocinas

Os BMDCs foram semeados em uma placa de 24-poços a uma densidade de 5  105 células/poço. Após 1 h de assentamento, as células foram tratadas com 1 mg/mL de imiquimode, 20 mg/mL de 20 30 -cGAMP, (equivalente a 1 mg/mL de mRNA) de partículas de vacina ou controles. Os meios de cultura celular foram coletados 24 horas depois, e os níveis de TNF-a, CCL5, IFN-b e IL-1b foram medidos usando kits de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), seguindo os procedimentos sugeridos pelo fabricante.

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2.9. Análises sobre transfecção de DC, maturação de DC e estimulação

Para analisar a eficiência da transfecção de DC in vitro, as células DC2.4 foram semeadas a 2,5 105 células/poço em uma placa de 24-poços. As células foram tratadas com partículas encapsuladas em mRNA que codificam eGFP ou luciferase a uma concentração final de 1 mg de mRNA/mL. As células foram colhidas 24 horas depois, lavadas com 2% de FBS em solução de PBS e depois ressuspensas na mesma solução antes de serem aplicadas para análise de citometria de fluxo com um citômetro de fluxo BD LSR II (LSR II, BD Biosciences, San Jose, CA) . Para medir a maturação das DC e a apresentação do antígeno in vitro, os BMDCs foram semeados a 2,5  105 células/poço em uma placa de 24-poços e tratados com 1 mg/mL de OVA-MVP por 24 h. Os BMDCs foram corados por 30 min com anticorpos específicos para CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80 e CD86 para maturação de DC e anti-H-2Kb (SIINFEKL) para apresentação de antígeno. Para determinar a potência estimulante in vivo, camundongos C57BL/6J foram vacinados uma vez com 10 mg de OVA-MVP por camundongo na pata, e LNs poplíteos drenados foram colhidos 24, 48 e seguintes marcadores de superfície celular: CD11c, MHC I, CD11b, B220 , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.

2.10. Análises de citometria de fluxo na ativação e proliferação de células T

Para medir a activação de células T in vivo, os ratinhos foram vacinados uma vez com 10 mg de OVA-MVP e os LNs poplíteos foram isolados às 24 ou 48 h. As células T foram coradas com os seguintes anticorpos: CD45, CD3, CD4, CD8 e CD69. Para detectar células T específicas do antígeno, tumores, baço e nódulos linfáticos poplíteos foram colhidos 5 dias após a segunda vacinação. Os tecidos foram processados ​​para gerar suspensões unicelulares e as células foram coradas com anticorpos específicos de células T e dextrâmero OVA257e264-MHCI seguindo as instruções do fabricante. Para medir o nível intracelular de IFN-g, 2  106 esplenócitos ou células isoladas de LNs poplíteos e tumores foram estimulados com 10 mg/mL de peptídeo OVA257e264 em meio RPMI 1640 completo suplementado com 55 mmol/L de b-mercaptoetanol e 1 inibidor de transportador de proteína coquetel às 18h. As células foram colhidas e coradas com anticorpos específicos de células T. Após fixação e permeabilização com kit Cytofix/Cytoperm, as células foram coradas com anticorpo anti-IFN-g e aplicadas para análise no citômetro de fluxo BD LSR II (BD Biosciences). Para medir a proliferação de células T, as células T foram isoladas dos baços de ratinhos transgénicos OT-I utilizando um kit de isolamento de células T de ratinho. Eles foram corados com 1 mmol/L de CFSE em RPMI 1640 contendo 200 mg/mL de BSA por 10 min a 37°C. Células T marcadas com CFSE foram lavadas duas vezes com 5 volumes de RPMI 1640 completo frio. Enquanto isso, BMDCs maduros foram tratados com 2 mg/mL de MVP encapsulado em mRNA de OVA por 24 h antes do isolamento de células T. Uma vez prontas as células T, as BMDCs e as células T foram co-cultivadas numa proporção de 1:5 (DC:T) durante 72 h. As células foram coletadas e coradas com anticorpos de superfície para células T, a proliferação foi testada usando um citômetro de fluxo BD LSR II (BD Biosciences) e analisada. Todos os resultados da citometria de fluxo foram analisados ​​​​com o software FlowJo v10 (Ashland, OH, EUA).

2.11. Rastreando a expressão de proteínas em camundongos vivos

Camundongos BALB/c foram tratados por injeção intra-pata com 10 mg de MVP encapsulado em mRNA de Luc. Eles foram injetados intraperitonealmente com 30 mg de RediJect D-luciferina por camundongo 6, 12, 24 ou 48 horas depois, e a bioluminescência foi medida com o sistema de imagem Xenogen IVIS -200 (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA, EUA).

2.12. Ensaio ELISpot

As placas de filtro IP foram pré-lavadas com 50 mL de etanol a 35% e lavadas completamente 3 vezes com PBS antes do etanol evaporar. As placas foram subsequentemente revestidas com anticorpos de captura anti-IFN-g a 4°C durante a noite. As placas foram bloqueadas com meio completo RPMI 1640 contendo 55 mmol/L de b-mercaptoetanol por 2 h a 37°C. Células (1  105 esplenócitos, 1  105 células de LN poplíteo) foram semeadas em cada poço, e estimulado por 36 h com 10 mg/mL de peptídeo OVA257e264. Os meios foram descartados e as células foram lavadas 4 vezes com PBST (PBS contendo 0,05% de Tween 20) e duas vezes com PBS. Após a lavagem final, um anticorpo de detecção anti-IFN-g foi adicionado e incubado por 2 horas em temperatura ambiente no escuro. As placas foram lavadas 4 vezes com PBST e duas vezes com PBS, e avidina-HRP foi adicionada e incubada por mais 45 min à temperatura ambiente no escuro. Finalmente, as placas foram lavadas com PBST e PBS novamente como descrito acima, e 50 mL de substrato AEC foram aplicados e observados quanto à reação pontual. Quando as manchas se tornaram visíveis, a reação foi interrompida descartando o substrato AEC e lavando-o com água bidestilada 5 vezes. Após secagem ao ar durante a noite, as placas foram escaneadas e analisadas usando o analisador CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa ELISpot (S5Versa-02- 9038, CTL Inc., Cleveland, OH, EUA).

2.13. Análise de Western Blot

Foram coletadas BMDCs derivadas de camundongos Mavs KO ou Sting KO do tipo selvagem e as células foram lisadas em tampão de lise celular RIPA suplementado com inibidores de protease e fosfatase. A concentração de proteína no lisado celular foi medida com um kit de ensaio de proteína BCA. As amostras de proteínas foram separadas por eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF). A expressão de MAVS e STING foi detectada após a membrana ter sido incubada com um anticorpo anti-MAVS ou anti-STING na diluição de 1:2000 seguida de imunodetecção com SuperSignal West Pico e Femto Chemiluminescent Substrate. Para medir a ativação da via STING, os BMDCs derivados de camundongos do tipo selvagem foram tratados com veículo ou MVP encapsulado em mRNA de OVA na concentração indicada por 2 h. As células foram lisadas e prosseguidas para análise de Western blot com anticorpos anti-TBK1 e antifosfo-TBK1 na diluição de 1:2000.

2.14. Ensaio antitumoral

Modelos de tumor murino foram gerados pela inoculação de 2  105 células B16-células de melanoma OVA ou 5  105 MC38-células OVA por camundongo subcutaneamente no flanco esquerdo de 6 a {{5} } camundongos C57BL/6J fêmeas com uma semana de idade. Os ratos foram alocados aleatoriamente em grupos de tratamento e tratados duas vezes separados por 7 dias com 10 mg de OVA MVP ou controles na pata. O crescimento do tumor foi monitorado a cada 2 dias. O volume do tumor foi calculado de acordo com a Eq. (2):

Os ratos foram sacrificados 5 dias após a segunda vacinação e o peso dos tecidos tumorais foi registado.

2.15. Análise estatística

Todos os resultados são apresentados como média SEM. As estatísticas foram avaliadas com um teste ANOVA unidirecional usando a correção de Tukey para comparação de múltiplos grupos e um teste t bicaudal não pareado para comparação de dois grupos. Os dados foram analisados ​​com o software GraphPad Prism v8.0.2. P < 0.{{10}}5 foi considerado estatisticamente significativo (*P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001).

3. Resultados

3.1. MVP medeia expressão robusta de mRNA em células dendríticas (DC)

Preparamos partículas de vacina core-shell em uma abordagem microfluídica em duas etapas (Fig. 1A) e avaliamos sistematicamente componentes individuais na nanopartícula para montar uma partícula de vacina com alta estabilidade, alta absorção celular e alto potencial de expressão em DCs. A eletroforese em gel revelou que um núcleo de mRNA estável poderia ser formado uma vez que a proporção de mRNA para protamina fosse de 1 ou menos (Fig. 1B). Usando mRNA que codifica eGFP como marcador substituto, descobrimos que uma composição lipídica em uma proporção molar de 34% EDOPC/30% DOPE/35% colesterol/1% DSPEPEG2k proporcionou uma taxa de encapsulamento ideal e a melhor eficiência de expressão (Tabela 1, Informações de suporte Fig. S1AeS1D). A alteração da taxa de carga não alterou significativamente a taxa de encapsulamento, o índice de polidispersidade ou a carga superficial das partículas (Tabela 2, Fig. 1CeE); no entanto, o tamanho das partículas resultantes estava entre 70 e 80 nm de diâmetro quando a proporção estava entre 12 e 16, em comparação com um diâmetro de 120e130 nm, uma vez que a proporção caiu fora da faixa (Fig. 1F e G). A melhor expressão foi detectada em células DC2.4 tratadas com MVP2 que tinham uma razão de carga de 12 (Fig. 1H e I). Um padrão semelhante foi observado quando as partículas foram preparadas com mRNA que codifica a luciferase, e foi detectada expressão dependente da dose (Fig. 1J). As partículas encapsuladas em mRNA demonstraram estabilidade desejável, uma vez que não perderam atividade após liofilização ou congelamento-descongelamento (Fig. S1E e S1F). Além disso, não houve citotoxicidade após as células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs) terem sido tratadas apenas com o núcleo de mRNA, uma partícula veículo preparada sem moléculas de mRNA ou MVP2 contendo mRNA (Fig. 1K). Assim, o MVP2 apresentou o melhor potencial de expressão. Ele foi usado para todos os experimentos adicionais do estudo e rotulado como MVP no restante do texto. As partículas de MVP poderiam efetivamente entregar moléculas de mRNA in vivo, e não houve toxicidade detectável do MVP encapsulado em mRNA com base nas alterações de peso corporal (Fig. S1GeS1I).

3.2. O MVP induz efetivamente a apresentação de antígenos e a ativação de células T in vitro e in vivo

Preparamos núcleo de mRNA, veículo livre de mRNA e MVP encapsulado em mRNA de OVA, e os aplicamos para testar a maturação de DC e apresentação de antígeno (Fig. 2A). Os BMDCs tratados com MVP exibiram superexpressão dependente da dose de marcadores de maturação de DC, incluindo CD40, CD80 e CD86 (Fig. 2BeD). O tratamento com o veículo livre de mRNA ou com o MVP encapsulado em mRNA desencadeou a superexpressão do MHC I (Fig. 2E), indicando que o efeito estava associado ao veículo e não ao complexo de mRNA. Além disso, o tratamento com MVP resultou na exibição na superfície celular do complexo epítopo do antígeno OVA257e264-MHC I (SIINFEKL-MHC I) que foi detectado com um anticorpo anti-SIINFEKL-MHCI (Fig. 2F), demonstrando processamento e apresentação eficaz do antígeno pelos BMDCs . Além disso, a co-incubação de BMDCs tratadas com MVP com B3Z, uma linhagem de células T CD8+ que reconheceu especificamente o epítopo OVA257e264, ou células T isoladas do baço de um camundongo OT-I que expressou uma célula T específica de OVA257e264- receptor, desencadeou a secreção de IL -2, um resultado não observado em células T coincubadas com DCs tratadas apenas com veículo ou apenas com o núcleo de mRNA / protamina (Fig. 2G). A análise de citometria de fluxo detectou 32,5% de células T CD8+ proliferativas após co-incubação com MVP (Fig. 2H e I). Partículas de MVP encapsuladas em mRNA de OVA também foram aplicadas para tratar camundongos por injeção intradérmica. O exame das células nos linfonodos de drenagem revelou um aumento constante na expressão de CD86 entre as DCs clássicas (CD8+ DC, CD11b+ DC, CD103+ DC) e DCs plasmocitóides (pDC) durante as primeiras 48 h, indicando estimulação de DC maturação (Fig. 2J). O tratamento também promoveu o enriquecimento de células T CD8+ nos gânglios linfáticos, com aumento significativo na população de células T CD69+CD8+ (Fig. 2K e L), indicando ativação de células T pelo tratamento. Para determinar a ativação de células T, coletamos células nos gânglios linfáticos de drenagem 3, 5 ou 7 dias após o tratamento com MVP e realizamos análises ELISpot após as células terem sido desafiadas com o peptídeo antígeno OVA257e264 (Supporting Information Fig. S2). O tratamento com MVP desencadeou um grande salto nas células secretoras de IFN-g durante o período, com pico de atividade no Dia 5 (Fig. 2M). Estes resultados demonstraram estimulação robusta de DC, apresentação de antígeno e ativação de células T após tratamento com MVP.

Tabela 1 Composição de nanopartículas encapsuladas com mRNA codificador de eGFP.

mesa 2Composição lipídica e taxa de carga do MVPpartículas.

3.3. MVP provoca imunidade antitumoral potente em modelos murinos de tumor colorretal e melanoma

O MVP foi aplicado para tratar camundongos com câncer de cólon MC38 e melanoma B16. Em ambos os modelos, o tratamento com mRNA de OVA encapsulado em MVP bloqueou completamente duas vezes o crescimento do tumor por via subcutânea; em comparação, o tratamento com MVP encapsulado com mRNA de eGFP ou veículo sozinho não teve qualquer efeito inibitório detectável no crescimento do tumor (Fig. 3AeD, Informações de Apoio Fig. S3). Em linha com o padrão de mudança de CD4 para CD8 nos gânglios linfáticos (Fig. 2), observamos um aumento na proporção de células T CD8 + / CD4 + em tumores de camundongos tratados com MVP encapsulado com mRNA de OVA (Fig. 3E). Além disso, detectamos níveis elevados em células T IFN-g+CD8+ nos baços, nódulos linfáticos e tumores em camundongos tratados com MVP encapsulado em mRNA de OVA, mas não com veículo sozinho ou MVP encapsulado em mRNA de GFP (Fig. 3FeH, Informações de Apoio Figura S4). Além disso, houve um aumento significativo em células T CD8+ positivas para dextrâmero OVA257e264-MHCI em tumores do grupo de tratamento MVP encapsulado em mRNA de OVA indicando proliferação de células T CD8+ específicas para antígeno (Fig. 3I). O ensaio ELISpot com células isoladas do baço e dos gânglios linfáticos forneceu suporte adicional na ativação de células T (Fig. 3JeM).

3.4. MVP estimula respostas imunes inatas ativando sinalização dependente de STING

Aplicamos núcleo de mRNA, veículo livre de mRNA e MVP encapsulado em mRNA para tratar BMDCs, a fim de identificar os principais fatores e vias responsáveis ​​pela estimulação do IFN tipo I e da expressão de citocinas inflamatórias. Curiosamente, o MVP foi tão potente quanto o agonista de Tlr7, imiquimod, no desencadeamento da secreção de IFN-β, e o veículo sozinho também mostrou atividade na promoção da secreção de IFN-β, embora sua potência não fosse tão alta quanto o MVP; no entanto, o núcleo de ARNm sozinho foi ineficaz na estimulação da secreção de IFN-b (Fig. 4A). O resultado implicou que tanto o ARNm como os componentes do veículo eram necessários para maximizar a expressão de IFN-b. Enquanto isso, o imiquimod e o veículo mostraram atividade semelhante na promoção da expressão de TNF-a e IL-1b, enquanto o MVP foi muito mais potente que qualquer um deles (Fig. 4B e C). A expressão de CCL5, uma citocina comumente associada aos fatores reguladores de NF-kB e IFN, foi igualmente estimulada em células tratadas com imiquimod, apenas veículo ou MVP (Fig. 4D). TLR7, MAVS, STING e TRIF são fatores-chave nas principais vias de transdução de sinal que medeiam as respostas celulares ao RNA viral e ao DNA danificado28e30. Geramos BMDCs de camundongos com nocaute do gene Tlr7, Mavs, Sting ou Trif (KO) e células tratadas com núcleo de mRNA, veículo livre de mRNA ou MVP encapsulado em mRNA para examinar a expressão de IFN-b e TNF-a.

Figura 2 Estimulação de respostas imunes por MVP. (A) Vista esquemática do núcleo de mRNA/protamina, veículo livre de mRNA e MVP completo. (BeD) Maturação de BMDCs após tratamento com OVA-MVP por 24 h. (E e F) Expressão de MHC I e complexo epítopo de antígeno OVA257e264-MHC I em BMDCs após tratamento com OVA-MVP por 24 h. (G) Nível de IL-2 de BMDCs tratados co-incubados com células T B3Z ou OT-I. (H e I) Análise de citometria de fluxo de células T proliferativas. Cromatogramas representativos de células T são mostrados. (J) Maturação DC após tratamento com MVP in vivo. Camundongos C57BL/6J foram tratados com OVA-MVP e as DCs nos linfonodos poplíteos foram analisadas. (K e L) Análise da população de células T. Camundongos C57BL/6J foram tratados com veículo ou OVA-MVP, e células T em linfonodos poplíteos foram analisadas com citometria de fluxo. (M) ensaio ELISpot. Camundongos C57BL/6J foram tratados com OVA-MVP e os gânglios linfáticos foram coletados nos momentos indicados. Células isoladas foram aplicadas para a medição de células que expressam IFN-g. Os dados são apresentados como média SEM (n Z 3). *P <0.05; **P < 0.01; ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, não significativo.

Figura 3 Atividade antitumoral do MVP. (A) Inibição do crescimento do tumor MC38-OVA. Camundongos fêmeas C57BL/6J foram inoculados subcutaneamente com células tumorais 5  105 MC38-OVA/camundongo no dia 0 e tratados com controle de PBS, controle de veículo, GFP-MVP ou OVA-MVP em Dias 3 e 10. (B) Inibição do crescimento do tumor B16-OVA. Camundongos fêmeas C57BL/6J foram inoculados subcutaneamente com células tumorais 2  105 B16-OVA/camundongo no dia 0 e tratados com controle de PBS, controle de veículo, GFP-MVP ou OVA-MVP nos dias 3 e 10. (C e D) Imagem e peso de tumores B16-OVA no dia 17. (E) População de células T em tumores de camundongos pós-tratamento. (FeH) Células T IFN-g+CD8+ em baços, gânglios linfáticos (LN) e tumores de camundongos pós-tratamento. (I) Células T CD8+ específicas de OVA em tumores de camundongos pós-tratamento. (JeM) Imagens e análise quantitativa do ensaio ELISpot de células esplênicas e LN de camundongos pós-tratamento. Os dados são apresentados como média SEM (n Z 5). *P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001.

O status KO de Mavs e Sting em BMDCs foi confirmado com análise de Western blot (Supporting Information Fig. S5A). Surpreendentemente, Sting KO eliminou a atividade estimulatória na secreção de IFN-b tanto do veículo sozinho quanto do MVP (Fig. 4E), indicando que o MVP ativou a expressão de IFN tipo I através de STING. Para apoiar a noção, detectamos a fosforilação da quinase 1 de ligação ao tanque (TBK1) (Fig. S5B), uma quinase que é comumente associada à atividade do STING . Além disso, esta via foi independente da sinalização do TLR7, uma vez que a expressão do IFN-β não foi comprometida nas células tratadas com imiquimod (Fig. 4E). Em comparação, Trif ou Mavs KO tiveram um impacto mínimo na expressão de IFN-b promovida pelo MVP. Como esperado, o imiquimod foi ineficaz na estimulação da secreção de IFN-β em BMDCs derivadas de Tlr7 KO; no entanto, o Tlr7 KO teve um impacto negativo no efeito estimulador do MVP (Fig. 4E). Curiosamente, foi observado um perfil diferente na secreção de TNF-a nos mesmos tratamentos. O nocaute de Sting, Trif ou Tlr7 não teve impacto mínimo na expressão de citocinas estimuladas por MVP. O nocaute de Mavs, por outro lado, reduziu drasticamente os níveis de TNF-α em células tratadas apenas com veículo ou MVP (Fig. 4F). O resultado indica que o MAVS é um regulador chave da expressão do TNF-α nas DCs após tratamento com MVP.

3.5. MVP estimula as vias STING e MAVS para promover a secreção de IFN-I e citocinas inflamatórias

Para identificar os componentes do veículo responsáveis ​​pela estimulação da sinalização STING e MAVS, preparamos veículos e MVPs substituindo ou omitindo componentes-chave e os aplicamos para tratar BMDCs. O GMP-AMP cíclico agonista de Sting (cGAMP) serviu como controle positivo na estimulação da secreção de IFN-β. A substituição do lípido catiónico EDOPC no veículo por outro lípido carregado positivamente, DOTAP, eliminou completamente a secreção de IFN-b. Em comparação, o efeito estimulador do veículo e do MVP foi retido com ou sem protamina, e tal atividade estimulatória foi dependente de um gene Sting intacto (Fig. 4G). Curiosamente, os BMDCs tratados com componentes individuais do invólucro lipídico, incluindo EDOPC, não promoveram forte secreção de IFN-β (Supporting Information Fig. S6). Assim, o EDOPC foi essencial para a ativação do STING, e sua atividade depende da formação de uma nanopartícula lipídica (ou seja, veículo ou MVP). Veículo e MVP preparados com EDOPC ou DOTAP também foram aplicados para tratar BMDCS derivados de camundongos KO de tipo selvagem e Mavs, e foram determinados os níveis de TNF em meios de crescimento celular. Como esperado, a substituição do EDOPC por DOTAP ou DOPC eliminou o esforço estimulatório do veículo e do MVP. Além disso, o nível de TNF-a foi significativamente reduzido em células Mavs KO em comparação com células do tipo selvagem, mas não diminuiu (Fig. 4H), indicando que factores adicionais podem estar envolvidos na mediação da expressão de TNF-a estimulada por MVP.

3.6. A via STING é essencial para respostas imunes antitumorais mediadas por MVP

Ambos os camundongos do tipo selvagem e knockout foram tratados com MVP encapsulado em mRNA de OVA, e a maturação de DC e a proliferação de células T foram examinadas. Sting KO reduziu significativamente a porcentagem de células CD80+ e CD86+ DC e células T CD69+ (Fig. 5AeD). O ensaio ELISpot revelou células produtoras de IFN-g significativamente reduzidas nos baços e nódulos linfáticos de camundongos Sting KO em comparação com camundongos do tipo selvagem após terem sido tratados com a mesma dose de MVP (Fig. 5EeH). O impacto do Mavs KO foi mínimo, pois nenhuma diferença foi monitorada nas células T de memória CD44þCD8þ, células T CD8+ positivas para dextrâmero OVA257e264-MHCI ou número de células produtoras de IFN-g nos gânglios linfáticos em comparação com células selvagens- tipo camundongos (Fig. 5IeL). O resultado reforça a noção de que fatores adicionais além do MAVS podem estar envolvidos na expressão de citocinas inflamatórias estimuladas por MVP. Ambos os camundongos do tipo selvagem e Sting KO foram aplicados para inocular tumores B16-OVA, e os camundongos foram tratados com controle de PBS ou MVP encapsulado em mRNA de OVA. A análise de citometria de fluxo em amostras de linfonodos e tumores coletadas de camundongos vacinados revelou um número significativamente reduzido de células T CD8+ produtoras de IFN-g nos camundongos Sting KO (Fig. 6A e B). Como resultado, o crescimento do tumor foi completamente inibido em camundongos do tipo selvagem tratados com MVP, em comparação com a inibição apenas parcial nos camundongos Sting KO (Fig. 6C).

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4. Discussão

No presente estudo, examinamos sistematicamente os papéis funcionais de componentes individuais no MVP na estimulação de respostas imunes antitumorais. Nosso estudo baseado em células demonstrou claramente que tanto as moléculas de mRNA quanto o veículo livre de RNA no MVP são necessários para sua plena atividade na promoção da expressão de IFN-b e de uma série de citocinas inflamatórias, incluindo IL-1b e TNF -a nas células dendríticas. Foi demonstrado que tais citocinas desempenham papéis essenciais na ativação de células dendríticas e na imunidade antitumoral mediada por vacina20. Nosso estudo também revelou que a estimulação da produção de citocinas depende de uma série de vias-chave de transdução de sinal envolvidas na detecção imune inata, incluindo aquelas mediadas por STING e MAVS. Embora o STING seja essencial para a expressão do IFN-β, o MAVS está principalmente envolvido na regulação da expressão do TNF-α (Fig. 6D). A importância da sinalização STING na imunidade antitumoral mediada por MVP é ainda demonstrada pela redução da atividade das células T e, consequentemente, pela inibição comprometida do crescimento tumoral em camundongos Sting KO. Este resultado está de acordo com outros relatos de que a ativação do STING determina a imunidade antitumoral mediada por células T citotóxicas . MAVS é um intermediário chave na sinalização do receptor RIG-I (RLR) em resposta à infecção viral. A ativação desta via leva a uma cascata de respostas inflamatórias33. É intrigante que a atividade das células T não esteja comprometida em camundongos Mavs KO, dado que a sinalização MAVS está claramente desempenhando um grande papel na regulação da expressão de citocinas inflamatórias, incluindo o TNF-a. Uma possível razão é que a estimulação de tais citocinas pelo MVP é mediada por múltiplas vias, e a interrupção da via MAVS não reduz a expressão de citocinas a um nível suficientemente baixo para causar um impacto significativo. Alternativamente, a perda da sinalização MAVS é compensada pelas outras vias. Mais estudos são necessários para identificar essas vias para compreender melhor o mecanismo de ação da vacina MVP. Embora o TLR7 tenha sido tradicionalmente associado à terapêutica do mRNA, a sinalização do TLR7 não parece desempenhar um papel importante na mediação da atividade do MVP. A aplicação de moléculas de mRNA totalmente metiladas no presente estudo pode ter tornado a sinalização do TLR7 menos relevante. Foi bem demonstrado que a metilação do RNA suprime o reconhecimento pelos TLRs23. TRIF é uma proteína adaptadora chave para sinalização TLR3/7/8 . O nocaute de Trif também não afeta a atividade do MVP, reforçando a noção de que os TLRs acima, incluindo o TLR7, não desempenham um papel importante na mediação das respostas celulares ao MVP. Múltiplos agonistas de Sting foram aplicados no desenvolvimento de vacinas contra o câncer, incluindo dinucleotídeos cíclicos e compostos moleculares pequenos e grandes . Tais agonistas de Sting precisam de ser adicionados como adjuvantes externos durante a preparação da vacina, o que acrescenta outra camada de complexidade à composição da vacina. Além disso, o agonista Sting adicionado externamente pode causar efeitos adversos indesejáveis, uma vez que se separa do complexo de mRNA. Em comparação, o nosso MVP serve como autoadjuvante e funciona no contexto de uma vacina contra o cancro, uma vez que nenhum dos componentes individuais da vacina, incluindo o EDOPC, pode promover a expressão de citocinas. Curiosamente, o fosfolípido catiónico EDOPC não pode ser substituído pelo não fosfolípido DOTAP, que também tem carga positiva. É intrigante especular o mecanismo potencial para a diferença entre esses dois lipídios catiônicos. No entanto, foi documentado que outras propriedades de um componente da molécula lipídica, como a hidrofobicidade, podem ter um impacto profundo na função global de uma nanopartícula e na sua eficácia de entrega de ácidos nucleicos . Assim, deve-se ter cuidado na seleção das moléculas adequadas para preparar uma vacina de mRNA totalmente funcional. Em resumo, desenvolvemos uma potente vacina terapêutica contra o câncer baseada em mRNA e atribuímos componentes individuais na vacina com sua funcionalidade. Seu mecanismo de ação é bastante diferente de outras plataformas de mRNA utilizadas para intervenções profiláticas e terapêuticas. O conhecimento derivado do estudo atual guiará definitivamente o desenvolvimento futuro de terapêuticas adicionais de mRNA.

Figura 4 Promoção de respostas imunes inatas por MVP. (AeD) BMDCs tratadas com 1 mg/mL de imiquimode, 1 mg/mL de núcleo equivalente de mRNA, veículo ou MVP por 24 h. Os níveis de IFN-b, TNF-a, IL{7}}b e CCL5 foram medidos com ELISA. (E e F) Expressão de IFN-b e TNF-a de BMDCs derivadas de camundongos de tipo selvagem e knockout de gene (KO). Os BMDCs foram tratados com os reagentes indicados por 24 horas. IFN-b e TNF-a foram medidos com ELISA. (G) IFN-b em BMDCs derivados de camundongos knockout do tipo selvagem e Sting. Os BMDCs foram tratados com 20 mg/mL de cGAMP, 1 mg/mL de núcleo equivalente de mRNA, veículo ou MVP por 24 h. Veículo (DOTAP): elaborado através da substituição de EDOPC por DOTAP; veículo (sem protamina): preparado omitindo a protamina. ND: não detectável. (H) TNF-a em BMDCs derivados de camundongos knockout de tipo selvagem e Mavs. Os BMDCs foram tratados com núcleo, veículo ou MVP equivalente a 1 mg/mL de mRNA por 24 h. Veículo (DOTAP): elaborado através da substituição de EDOPC por DOTAP; veículo (DOPC): elaborado substituindo EDOPC por DOPC. Os dados são apresentados como média SEM (n Z 3). ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, não significativo.

Figura 5 Respostas imunes antitumorais em camundongos knockout para Sting e Mavs. (AeD) Diminuição da ativação de células DC e T em camundongos knockout para Sting. Tanto os camundongos do tipo selvagem quanto os knockout para Sting foram tratados com MVP encapsulado em mRNA de OVA, e os gânglios linfáticos foram coletados 48 horas depois para medição de células DC e T. (EeH) Células T que expressam IFN-g reduzidas no baço e nos gânglios linfáticos de camundongos knockout para Sting. São mostradas imagens de manchas e análises quantitativas. (IeL) Nenhum impacto na atividade das células T em camundongos knockout para Mavs. Tanto os camundongos selvagens quanto os camundongos knockout para Mavs foram tratados com controle PBS ou MVP encapsulado em mRNA de OVA, e os gânglios linfáticos foram coletados 48 horas depois para medição de células T de memória CD44þCD8þ (I), OVA257e264-CD8+ positivo para dextrâmero MHCI Células T (J) e número de células produtoras de IFN-g (K e L). Os dados são apresentados como média SEM (n Z 3 ou 5). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, não significativo.

Figura 6 Imunidade antitumoral dependente de picada. (A e B) Análise de células T que expressam IFN-g em nódulos linfáticos e tecidos tumorais após camundongos knockout de tipo selvagem e Sting portadores de tumores B16-OVA foram tratados com MVP encapsulado em mRNA de OVA. Os ratos foram tratados nos Dias 3 e 10, e nódulos linfáticos e tumores foram coletados no Dia 15. Células individuais foram analisadas com citometria de fluxo. (C) Inibição do crescimento tumoral em camundongos knockout de tipo selvagem e Sting. Os ratos foram tratados com controle PBS ou MVP nos dias 3 e 10. Os dados são apresentados como média SEM (n Z 5). *P < 0,05; ****P < 0,001; ns, não significativo. (D) Vista esquemática da estimulação MVP de vias de transdução de sinal que levam à produção de citocinas em DCs. Embora a estimulação da expressão de IFN-b seja mediada exclusivamente por STING, existem vários fatores, incluindo MAVS, que medeiam a expressão de TNF-a e IL-1b.

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