A peroxidação lipídica lisossomal regula a imunidade tumoral

A inibição lisossomal provocada pelos inibidores da palmitoil-proteína tioesterase 1 (PPT1), como o DC661, pode produzir morte celular, mas o mecanismo para isso não é completamente compreendido. As vias programadas de morte celular (autofagia, apoptose, necroptose, ferroptose e piroptose) não foram necessárias para atingir o efeito citotóxico do DC661. A inibição de catepsinas, ou quelação de ferro ou cálcio, não resgatou a citotoxicidade induzida por DC. A inibição do PPT1 induziu a peroxidação lipídica lisossomal (LLP), o que levou à permeabilização da membrana lisossomal e à morte celular que poderia ser revertida pelo antioxidante N-acetilcisteína (NAC), mas não por outros antioxidantes da peroxidação lipídica. O transportador lisossomal de cisteína MFSD12 foi necessário para o transporte intralisossomal de NAC e resgate de LLP. A inibição do PPT1 produziu imunogenicidade intrínseca às células com expressão superficial de calreticulina que só poderia ser revertida com NAC. Células tratadas com DC estimulam células T virgens e aumentam a toxicidade mediada por células T. Camundongos vacinados com células tratadas com DC geraram imunidade adaptativa e rejeição tumoral em tumores "imunes quentes", mas não em tumores "imunes frios". Estas descobertas demonstram que a LLP conduz à morte celular lisossomal, uma forma imunogénica única de morte celular, apontando o caminho para combinações racionais de imunoterapia e inibição lisossomal que podem ser testadas em ensaios clínicos.

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Introdução

Com atividade encorajadora em ensaios clínicos que envolvem o inibidor lisossômico hidroxicloroquina (HCQ) (1), a identificação da palmitoil-proteína tioesterase 1 (PPT1) como alvo molecular dos derivados da cloroquina (2) e o lançamento de novos inibidores de PPT1 na prática clínica ensaios (3, 4), há necessidade de compreender o mecanismo pelo qual os inibidores lisossomais induzem a morte celular e o efeito da inibição lisossomal na imunidade tumoral. O mecanismo canônico de morte celular lisossomal descrito para HCQ envolve permeabilização da membrana lisossomal (LMP), vazamento de catepsinas e ativação de apoptose mediada por caspases (5, 6). Mostrámos anteriormente que o inibidor lisossómico DC661 penetra nas células no microambiente tumoral ácido e localiza-se no lisossoma de forma mais eficiente do que o HCQ (2, 7). DC661 produz morte celular potente em muitas linhas celulares de câncer (2). DC661 liga e inibe o PPT1, desacidifica o lisossoma e inibe a autofagia. DC661 também induz LMP e aumenta os níveis de caspase 3 clivada (2, 7). Nos últimos anos, novos mecanismos de morte celular que têm consequências imunogênicas foram definidos e incluem necroptose, ferroptose e piroptose (8). Demonstrou-se que a autofagia dependente de lisossoma degrada o MHC classe I (9), bem como os componentes do imunoproteassoma (10), sugerindo que a inibição da autofagia pode melhorar o processamento do antígeno. No entanto, os efeitos imunogénicos da inibição lisossómica e da subsequente morte celular não foram totalmente caracterizados. Para resolver esta lacuna de conhecimento, investigamos os efeitos do DC661 nos mecanismos canônicos de morte celular para determinar se a morte celular lisossomal é sua forma de morte celular ou simplesmente um precursor de um dos outros mecanismos estabelecidos. Descobrimos que o HCQ e o DC661 induziram um aumento significativo em apenas um pequeno número de proteínas no proteoma do melanoma e a maioria destas eram proteínas relacionadas à autofagia e à apoptose. Os inibidores da morte celular programada (apoptose, necroptose, ferroptose e piroptose) não atenuaram os efeitos citotóxicos após comprometimento lisossômico pelo DC661. A peroxidação lipídica lisossomal (LLP) é um dos principais impulsionadores da morte celular induzida por LMP associada à expressão de calreticulina (CALR) na superfície celular. Essa forma de morte celular só pode ser revertida com o uso do antioxidante N-acetilcisteína (NAC). A atividade do NAC foi prejudicada pela inibição do importador de cisteína lisossomal MFSD12. LLP provocou fenótipos imunogênicos promovendo a morte mediada por células T. Estas descobertas demonstram que a morte celular lisossomal é uma forma potencialmente única de morte celular imunogénica.

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Resultados

A inibição lisossomal induz alterações significativas no proteoma associadas à autofagia e apoptose. Para estabelecer os efeitos citotóxicos dos inibidores lisossômicos, avaliamos a viabilidade de linhas celulares de melanoma A375P, carcinoma de cólon RKO e MIA PaCa{1}} de câncer de pâncreas tratadas com o inibidor vacuolar de H+-ATPase bafilomicina-A1 (1 00nM); Inibidores PPT1 DC661 (3 μM) ou HCQ (10 μM ou 30 μM); fluoreto de hexadecil sulfonil mimético de palmitato (HDSF; 60 μM); inibidores de catepsina pepstatina A (PepA; 10 ug/mL), E64 (PepA; 10 ug/mL) ou PepA+E64; e bromidrato de éster metílico de Leu-Leu, disruptor de membrana lisossomal (20 μM) por 48 horas. Apenas a bafilomicina-A1 e DC661 causaram uma diminuição significativa na viabilidade celular através das linhas celulares de câncer (Figura 1A e Figura Suplementar 1A; material suplementar disponível online com este artigo; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), com produção de DC661 uma redução mais profunda na viabilidade celular do que a bafilomicina-A1. Com base nesses dados e nas propriedades farmacológicas semelhantes a medicamentos dos derivados de cloroquina, concentramos nosso estudo nos derivados de cloroquina como ferramentas para entender a morte celular lisossomal. Uma análise imparcial do proteoma global foi aplicada a células de melanoma A375P tratadas com DC661 (3 μM) ou o menos potente HCQ (10 μM ou 30 μM) por 24 horas. Das 4.264 proteínas quantificadas de alta confiança, apenas 87 e 55 proteínas aumentaram significativamente com DC661 (3 μM) e HCQ (30 μM), respectivamente; além disso, 14 e 15 proteínas foram significativamente diminuídas com DC661 (3 μM) e HCQ (30 μM), respectivamente (mudança absoluta de dobra superior a 2; q <0,05) com DC661 (3 μM) ou HCQ (30 μM), respectivamente , quando comparado com o controle do veículo. A dose mais baixa de HCQ (10 μM) não apresentou alterações significativas nas proteínas em comparação com o controle do veículo. As 50 principais proteínas que aumentaram significativamente após o tratamento com DC661 foram associadas principalmente à autofagia e apoptose, e alterações semelhantes foram observadas para a dosagem mais elevada de HCQ (Figura 1B). Por estas razões, optamos por focar mais estudos no DC661, mais potente. Exemplos de algumas das maiores alterações proteicas associadas à autofagia e apoptose foram a proteína 1 de ligação ao imposto (TAX1BP1; aumentada 15- vezes); Proteína 3 de interação BCL2- (BNIP3; aumentou 6-vezes); vizinho da proteína do gene 1 BRCA1 (NBR1; aumentado 12- vezes); sequestossomo-1 (SQSTM1/p62; aumentado 5- vezes); coativador de receptor nuclear 4 (NCOA4; aumentado 3- vezes); e LC3B (MAP1LC3B; aumentou 3- vezes). A apolipoproteína B-100 (APOB; aumentada 66- vezes) foi derivada de soro fetal de bezerro e não foi mais estudada. A imunotransferência confirmou que o tratamento com DC661 ou concentrações mais altas de HCQ produziu aumentos acentuados na expressão dos receptores de carga de autofagia NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 e NCOA4 de maneira dependente da dose e do tempo (Figura 1, B e C suplementar). CRISPR/Cas9 KO de PPT1 em células A375P fenocopiou os efeitos de DC661 nessas proteínas quando comparado com suas contrapartes WT (Figura 1D suplementar). No entanto, a expressão de receptores de carga de autofagia e os aumentos relativos induzidos pelo tratamento com DC661 foram variáveis ​​entre câncer de cólon, câncer de pâncreas e outras linhagens celulares de melanoma nas quais DC661 demonstra citotoxicidade (Figura 1E suplementar). Isto sugeriu que é improvável que os próprios receptores de carga de autofagia, embora aumentados ao nível da proteína, sejam responsáveis ​​pela morte celular após o tratamento com DC661. Para confirmar isso, focamos nos receptores de carga de autofagia TAX1BP1 e BNIP3 porque eles têm efeitos pró-apoptóticos conhecidos em células cancerígenas (Figura 1C). TAX1BP1 é um adaptador de carga de autofagia (11) e também regula a apoptose induzida por inibidores da síntese protéica ou agentes prejudiciais ao DNA em células cancerígenas (12). A eliminação de TAX1BP1 por siRNA (Figura 1D) não afetou a citotoxicidade induzida por DC em ensaios de viabilidade de curto prazo (Figura 1E) e longo prazo (Figura 1F). Esses resultados demonstraram que TAX1BP1 não desempenha um papel essencial na citotoxicidade mediada por DC. O BNIP3 é uma proteína pró-apoptótica que prejudica a bioenergética mitocondrial e regula a mitofagia (13). O knockdown efetivo do BNIP3 (Figura 1G) não afetou a citotoxicidade induzida por DC (Figuras 1, H e I). Estes resultados mostraram que os efeitos citotóxicos do DC661 são independentes da expressão do BNIP3. Em seguida, estudamos os efeitos do esgotamento de células de genes canônicos de autofagia necessários para a produção de autofagossoma na eficácia de DC661, derrubando unc-51 como a quinase ativadora de autofagia 1 (ULK1) e o gene 7 relacionado à autofagia (ATG7). O knockdown efetivo de ULK1 ou ATG7 (Figura Suplementar 2, A e B) inibiu o fluxo autofágico (Figura Suplementar 2C), mas não afetou a citotoxicidade induzida por DC (Figura 1, J-M). Estes resultados mostraram que a ausência da maquinaria essencial de autofagia não anula os efeitos citotóxicos do DC661. A inibição lisossomal por DC661 induz múltiplas vias de morte celular programadas. O ponto de vista canônico é que a morte das células lisossômicas é devida à apoptose (5). A imunotransferência revelou que o tratamento com DC661 resultou na ativação de caspase -3, -7 e -9 e clivagem de PARP -1, confirmando que DC661 ativou a apoptose (Figura 2A). O inibidor pan-caspase Z-VAD-FMK preveniu a ativação da caspase por DC661, mas não inibiu o acúmulo de LC3B e p62, demonstrando que a ativação da apoptose e o bloqueio da autofagia são separáveis ​​após a inibição lisossomal (Figura 2B). O bloqueio da apoptose com ZVAD-FMK não aumentou ou limitou a citotoxicidade do DC661, sugerindo que a apoptose é dispensável para a morte celular lisossomal (Figura 2, C e D). Os efeitos citotóxicos do DC661 foram semelhantes nas células primárias da medula óssea Bax / Bak duplo-KO incapazes de sofrer apoptose e células WT (Figura 2E). O bloqueio da apoptose também não afetou a citotoxicidade induzida por DC no câncer de cólon e nas células cancerígenas do pâncreas (Figura 2 suplementar, D-F). Como descobrimos que a apoptose é dispensável para a morte celular induzida por DC, investigamos se DC661 induz necroptose, outra forma de morte celular programada regulada pela proteína quinase de interação com o receptor (RIPK) e pela proteína semelhante ao domínio da quinase de linhagem mista ( MLKL). Os níveis das formas fosforiladas e ativadas de RIPK e MLKL aumentaram após o tratamento com DC661 de 0,1–1 μM (Figura 2F). A 3 μM de DC661 houve uma ausência de RIPK1 fosforilado, mas MLKL fosforilado persistente, sugerindo que, nesta concentração mais elevada, formas adicionais de morte celular poderiam ser envolvidas. O pré-tratamento com os inibidores RIPK1 necrostatina-1 ou necrostatina-1s ou o inibidor MLKL necrosulfonamida preveniu a fosforilação de RIPK1 após o tratamento com DC661 (1 μM) em células de melanoma (Figura 2G), mas não conseguiu resgatar DC{{192 }} citotoxicidade induzida em células de melanoma (Figura 2H) ou câncer de cólon ou células de câncer pancreático (Figura 2G suplementar). Essas descobertas sugerem que a necroptose é ativada, mas dispensável para morte celular mediada por DC.

Figura 1. A inibição da autofagia lisossômica induz mudanças significativas na apoptose e nas proteínas da autofagia. (A)

Os lisossomos são um dos principais locais de armazenamento de ferro. O metabolismo intracelular desregulado do ferro, juntamente com a diminuição da capacidade redutora, pode desencadear uma morte celular não apoptótica conhecida como ferroptose. Uma marca registrada da ferroptose é a regulação positiva da prostaglandina-endoperóxido sintase 2 (PTGS2), do regulador de transporte de cátions homólogo 1 (CHAC1) e da cisteinil-tRNA sintetase (CARS) (14). Todos os três marcadores de ferroptose foram regulados positivamente pela transcrição pelo tratamento com DC661 (Figura 3A), sugerindo que a inibição lisossomal induz a ferroptose. DC661 induziu uma mudança de fluorescência em células A375P tratadas com C11-BODIPY, indicando peroxidação lipídica, característica da ferroptose. Essa mudança induzida por DC661-foi significativamente revertida na presença de inibidores de ferroptose ferrostatina-1 ou roxstatina labial-1 administrados em uma concentração eficaz (Figura 3B e Figura Suplementar 3A), indicando ainda que DC661 ferroptose induzida. No entanto, a inibição da ferroptose não resgatou a citotoxicidade associada ao DC661 (Figura 3, C e D). O cotratamento de células cancerígenas com o quelante de ferro deferoxamina (DFO) e DC661 não resgatou a citotoxicidade do DC661 (Figura 3E). O tratamento com ferrostatina-1, roxstatina labial-1 ou DFO não resgatou a inibição do DC661 da viabilidade a curto prazo ou do crescimento clonogênico a longo prazo em células de câncer de melanoma, cólon e pâncreas (Figura 3, B suplementar –E e Figura Suplementar 4, A – D). Esses dados demonstram que a ferroptose é ativada, mas dispensável para morte celular661-mediada por DC. A piroptose é uma forma de morte celular programada associada a uma resposta inflamatória que envolve a ativação de caspases que processam gastrina (GSDM), permitindo a formação de poros na membrana plasmática e a subsequente liberação de padrões moleculares associados a danos, como alta mobilidade caixa de grupo 1 (HMGB1). O tratamento com DC661 em múltiplas linhagens celulares de melanoma (A375P, A375, WM35 e WM793) resultou na ativação da caspase iniciadora-8 e -9 e da caspase executora-7, típica da piroptose, e produziu clivagem de GSDME de comprimento total, semelhante em extensão ao conhecido indutor de piroptose PLX4720 e PD0325901 (Figura 5A suplementar). DC661 produziu uma liberação extracelular mais forte de HMGB1 do que o conhecido indutor de piroptose, BRAF e inibição de MEK em 1% de FBS (15), refletindo a consequência funcional da piroptose ativada. Em seguida, testamos se a inibição da piroptose pelo GSDME KO melhoraria os efeitos citotóxicos do DC661. O tratamento com DC661 induziu acúmulo de LC3II e SQSTM1/p62 e ativação de caspases, mas a liberação de HMGB1 foi quase completamente anulada em células humanas GSDME-KO WM35, demonstrando que a consequência funcional da inibição da piroptose foi alcançada (Figura 3F). No entanto, o tratamento com DC661 produziu citotoxicidade igual em células YUMM1.7 WT, vetor vazio (EV) e Gsdme KO1 e KO2 em condições de FBS de 10% e 1% (Figura 3G e Figura Suplementar 5B). Um resultado comum de múltiplas formas de morte celular é a liberação de LDH. O DC661 produziu um aumento significativo na liberação de LDH, e isso não pôde ser revertido pela apoptose, necroptose ou inibição da ferroptose (Figura 5C suplementar). Esses resultados mostraram que DC661 induz múltiplos modos de morte celular, incluindo apoptose e piroptose, bem como necroptose e ferroptose, mas nenhum desses modos de morte celular é necessário para a morte celular induzida por DC. A inibição da catepsina ou a quelação do cálcio não previnem a morte celular por permeabilização da membrana lisossomal. Tendo demonstrado que a ativação de caspases (que é necessária para apoptose e piroptose) é dispensável para a morte celular induzida por DC, levantamos a hipótese de que a liberação de catepsina dos lisossomos poderia causar morte celular dependente de caspases. A inibição química (DC661) ou genética (siRNA PPT1 [siPPT1]) de PPT1 produziu permeabilização da membrana lisossomal (LMP), enquanto HDSF, um inibidor irreversível menos potente de PPT1 que se esgota rapidamente na cultura celular, não conseguiu induzir LMP, conforme medido por pontos positivos para galectina -3 (Figura 4A). A LMP resulta na liberação de catepsinas e outros conteúdos lisossômicos no citoplasma e é considerada uma característica proximal chave da morte celular baseada no lisossomo. A LMP induzida por DC661 foi associada a um aumento significativo na atividade citoplasmática da catepsina-L, que foi significativamente bloqueada com um inibidor de cisteína protease E64 (Figura 4B). Relatórios anteriores sugeriram que a liberação de catepsina de lisossomos fraturados promove a ativação de caspases, levando à morte celular por apoptose (16–18). A inibição completa da catepsina não preveniu a clivagem da caspase (Figura 4C) e não resgatou a citotoxicidade induzida por DC661- em ensaios de viabilidade de curto e longo prazo em melanoma (Figura 4, D e E), câncer de cólon e câncer de pâncreas células cancerígenas (Figura Suplementar 6, A – C). Estes resultados contrariam a visão canónica da morte celular lisossómica impulsionada pela morte celular mediada pela catepsina. Além da liberação de catepsina pelos lisossomos com vazamento, a liberação de cálcio dos lisossomos tem sido implicada na disfunção celular quando o PPT1 está prejudicado (19). O tratamento com DC661 resultou em extensa liberação de cálcio, que foi revogada pelo pré-tratamento do quelante permanente de cálcio (Ca{101}}) celular, BAPTA-AM. (Figura 4F). Notavelmente, BAPTA-AM não evitou a LMP{105}}induzida por DC (Figura 4G) ou a clivagem de caspases (Figura 6, D e E suplementares) e, o mais importante, não resgatou a citotoxicidade{108}}induzida por DC ( Figura 4H). Esses achados também foram observados em linhas celulares RKO e MIA PaCa-2, nas quais não foram observadas diferenças significativas nos valores de IC50 com BAPTA-AM e DC661 (Figura Suplementar 6F), o que sugeriu que a morte celular associada a LMP é não depende de cálcio ou catepsinas.

Figura 2. Apoptose e necroptose induzidas por DC661-. (A)

Figura 3. Ferroptose e piroptose induzidas por DC661-. (A)

LLP impulsiona LMP. Tendo estabelecido que inibidores das principais vias de morte celular (apoptose, necroptose, ferroptose e piroptose), catepsinas (PepA e E64) e quelantes de íons (BAPTA-AM [Ca2+] e DFO [Fe{{3}] }]) não preveniu a morte celular por DC661 e encontrando evidências de peroxidação lipídica por C-11-BODIPY, realizamos uma análise global do lipídio 2 e 4 horas após o tratamento com DC661. DC661 induziu aumentos precoces e sustentados de 3- a 10- vezes em todas as classes de lisofosfolipídios (Figura 5A). Em contraste, alterações mínimas ou nenhumas foram observadas nas classes de fosfolipídios, incluindo fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol e ácido fosfatídico (Figura 7A suplementar). Espécies lisofosfolipídicas podem ser geradas por ERO, que oxidam a cadeia de ácidos graxos saturados que é então clivada pelas fosfolipases (20). Para determinar se os antioxidantes poderiam prevenir danos lipídicos mediados por ROS, investigamos a citotoxicidade induzida por DC na presença do eliminador de pan-ROS N-acetilcisteína (NAC) (21, 22) e dos supostos inibidores da peroxidação lipídica Trolox (23). ) e vitamina C (ácido ascórbico) (24, 25). Ao contrário de qualquer um dos outros agentes testados até agora, o cotratamento com NAC resgatou a citotoxicidade associada a DC em múltiplas linhas celulares (Figura 5B e Figura Suplementar 7B). Ensaios de CFU de longo prazo mostraram que o NAC, ao contrário de todos os inibidores de morte celular, quelantes de íons e inibidores de catepsina testados aqui, preveniu os efeitos citotóxicos de DC661 em células A375P, RKO, MIA PaCa -2, B16F10 e MC38 ( Figura 5C e Figura Suplementar 7C). Curiosamente, o Trolox e a vitamina C não resgataram a citotoxicidade do DC661 no melanoma humano, câncer colorretal, células de câncer pancreático e melanoma murino e células de câncer colorretal (Figura 5D e Figura Suplementar 7, D-H). Essa disparidade nos levou a testar se NAC, Trolox e vitamina C afetavam a DUM. Nossos resultados mostraram que o NAC foi o único antioxidante que reduziu significativamente a LMP induzida por DC (Figura 5E). Nossa hipótese é que o LLP impulsiona a produção de LMP pelo DC661, que pode ser revertido pelo NAC, mas não pelo Trolox e pela vitamina C. Para estudar o processo do LLP usamos a sonda fluorescente FOAM-LPO (26), que se localiza especificamente no lisossoma e produz uma mudança espectral de 586 para 512 nm (vermelho para verde) quando exposto a peróxidos lipídicos. Descobrimos que o DC661 induziu LLP em comparação com o controle (Figura 5F). O NAC reduziu a peroxidação lipídica nos lisossomos das células de melanoma tratadas com DC661-, enquanto o Trolox e a vitamina C não conseguiram reduzir o LLP (Figura 5F). NAC, Trolox e vitamina C por si só não tiveram efeito significativo na peroxidação lipídica. O knockdown de PPT1 (Figura 8A Suplementar) ou o tratamento com altas concentrações de HCQ (Figura 8B Suplementar) também induziu LMP que poderia ser revertido por NAC, enquanto a inibição química de ULK1 não induziu LMP (Figura 8C Suplementar). É importante ressaltar que o knockdown do siPPT1 também incluiu LLP que poderia ser revertido com NAC (Figura 8D suplementar). Esses resultados mostraram que a inibição do PPT1 induz o LLP que pode ser resgatado pelo NAC e é provavelmente a causa da LMP induzida pela inibição do PPT 1-. Além disso, estas descobertas sugeriram que o LLP é crítico para a morte celular lisossomal.

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A importação de cisteína para os lisossomos pelo MFSD12 atenua a morte celular lisossomal. Dos 3 inibidores da peroxidação lipídica, apenas o NAC preveniu a LLP. Um relatório recente mostrou que o principal domínio da superfamília facilitadora contendo 12 (MFSD12) é um componente essencial do importador de cisteína para lisossomas e melanossomas (27). Raciocinamos que o NAC, ou seu metabólito cisteína, é transportado para o lisossoma através do MFSD12, onde a cisteína é oxidada em seu dissulfeto, a cisteína. Para testar essa hipótese, comparamos a capacidade do NAC de resgatar a citotoxicidade DC661 em células siNT e siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP. Nossos resultados mostraram que o NAC resgatou LMP induzido por DC661- em células siNT, mas não resgatou LMP em células siMFSD12 (Figura 6A). O NAC reduziu o LLP de células siNT-A375P tratadas com DC, mas não de células siMFSD12. As células siMFSD12 tratadas com DMSO ou NAC aumentaram o LLP basal (Figura 6B) em comparação com as células siNT. Embora o NAC tenha resgatado a citotoxicidade de DC661 em células siNT, a capacidade do NAC de resgatar a citotoxicidade de DC661 foi completamente anulada em células siMSFD12 (Figura 6C). Isto mostrou que o knockdown de MFSD12 bloqueia os efeitos citoprotetores do NAC contra DC661. O NAC é desacetilado pela acilase no citosol (28). Para determinar se o tratamento com NAC produz um acúmulo de cisteína ou cistina dentro dos lisossomos, empregamos a técnica de imunoprecipitação lisossomal (Lyso-IP) (29) para purificar lisossomos de células A375P tratadas com DMSO e NAC (Figura 6D e Figura Suplementar 9A) e realizado metabolômica direcionada para quantificar NAC e metabólitos relacionados. Como esperado, o NAC foi detectado no lisado de células inteiras tratado com NAC e nas frações não ligadas associadas. Os níveis de L-cisteína aumentaram substancialmente nos lisossomos tratados com NAC. A L-cistina só foi detectável nos lisossomos tratados com NAC. Surpreendentemente, não encontramos um aumento significativo na glutationa (reduzida) nos grupos tratados com NAC (Figura 6E); isso foi surpreendente porque se acredita comumente que o tratamento com NAC induz aumento na produção de glutationa, corrigindo o equilíbrio redox. Estes resultados sugerem que a cisteína importada para os lisossomos através do importador MFSD12 é crítica para resgatar LLP, LMP e morte celular lisossomal. LLP é imunogênico. Algumas formas de morte celular regulada induzida por DC661 (piroptose, necroptose, ferroptose) foram identificadas como imunogênicas. Anteriormente, a morte celular imunogênica foi descrita para medicamentos quimioterápicos com base em características, que incluem a exibição de padrões moleculares associados a danos, incluindo expressão de CALR na superfície celular e liberação de proteína HMGB1 e trifosfato de adenosina (ATP) (30). CALR atua como um sinal "coma-me" quando exposto às superfícies celulares durante o estresse celular. A liberação extracelular de HMGB1 e ATP atua como um sinal "encontre-me" reconhecido pelas células fagocíticas. Comparamos dois modelos: células B16F10, que em modelos de tumor singênico são quase completamente desprovidas de linfócitos infiltrantes de tumor, e células MC38, que em modelos de tumor singênico possuem linfócitos infiltrantes de tumor. Primeiro, demonstramos que o tratamento com DC661 ou siPpt1 induz significativamente a expressão superficial de CALR que pode ser completamente anulada com o cotratamento com NAC em células MC38 (Figuras 7, A e B). Achados semelhantes foram observados em células B16F10 (Figura 7C). Os inibidores das principais vias de morte celular (apoptose, necroptose, ferroptose e piroptose) não conseguiram prevenir a expressão superficial de CALR (Figura 7D). Para determinar se a morte celular imunogênica induzida por DC661 é devida à regulação positiva do MHC classe I, as células B16F10 e MC38 foram tratadas com DC661 (3 μM) ou DMSO por 24 horas. Descobrimos que o tratamento com DC661 não aumentou a expressão do MHC classe I e a regulação positiva do imunoproteassoma (Figura 7E e Figura Suplementar 9, B e C).

Figura 4. A inibição da catepsina ou a quelação do cálcio não previnem a morte celular induzida por DC. (A)

Para compreender os efeitos da inibição da autofagia na preparação de células T, realizamos uma experiência de preparação e cocultura in vitro utilizando esplenócitos C57BL6/J como descrito anteriormente (31). Para a preparação, expusemos esplenócitos a células B16F10 ou MC38 tratadas com DC 661- ou DMSO. Em seguida, estes esplenócitos preparados foram cultivados com células B16F10 ou MC38 vivas e a citotoxicidade foi medida (Figura 8A). Os esplenócitos preparados com células B16F10 tratadas com DC produziram um aumento significativo no IFN- em comparação com os esplenócitos expostos a células B16F10 tratadas com DMSO. A morte mediada por células T preparadas de células B16F10 em proliferação foi significativamente aumentada em esplenócitos iniciados com DC661- quando comparados com esplenócitos iniciados com DMSO (Figura 8, B e C). As células MC38 tratadas com DC661 produziram ainda mais citotoxicidade de células T estimuladas e IFN quando comparadas com células B16F10 (Figura 8, D e E). O co-tratamento de NAC com DC661 foi capaz de anular completamente a liberação de IFN dos esplenócitos e diminuir a citotoxicidade das células T iniciadas (Figura 8, F e G). A eliminação da calreticulina por siCalr em células MC38 (Figura 9D suplementar) anulou a eficácia do tratamento com DC661 e reduziu significativamente a citotoxicidade das células T preparadas (Figura 8, H e I). Tomados em conjunto, estes dados apoiam um papel mecanicista da regulação positiva de CALR associada a LLP na promoção da imunidade de células T de células antitumorais. Em seguida, expandimos esses achados in vitro para um estudo de vacinação antitumoral in vivo em modelos de camundongos imunocompetentes e imunodeficientes. Para este ensaio, células B16F10 ou MC38 tratadas com DC661- congeladas-descongeladas in vitro foram injetadas sc no flanco esquerdo para proteger camundongos imunocompetentes C57BL/6 ou NOD/SCID contra nova exposição com células tumorais vivas do mesmo tipo injetadas 7 dias depois no flanco direito (Figura 9A). Células B16F10 tratadas com DC661- não conseguiram prevenir a rejeição do tumor apesar dos ensaios in vitro, sugerindo que DC661 induziu morte celular imunogênica (Figura 9B e Figura Suplementar 9E). Em contraste, a inoculação de um flanco com células MC38 tratadas com DC promoveu a rejeição completa de células MC38 vivas implantadas no flanco oposto (Figura 9C e Figura Suplementar 9F). Para determinar se a imunidade adaptativa era crítica para o efeito da vacina que o DC661 parecia ter com os tumores MC38, repetimos o experimento em camundongos NOD/SCID. Surpreendentemente, descobrimos que células MC38 tratadas com DC não induziram rejeição de tumores de reexposição em camundongos NOD/SCID imunodeficientes (Figura 9D e Figura Suplementar 9G), indicando que a imunidade adaptativa era necessária para o efeito da vacina observado. Para testar a robustez desta descoberta, seleccionámos outra linha celular imunogénica de cancro de ratinho bem conhecida, CT26, e realizámos a experiência de vacinação como acima. Como esperado, a implantação de células CT26 tratadas com DC em um flanco do camundongo produziu um efeito semelhante ao de uma vacina e evitou o crescimento de células CT26 vivas implantadas no outro flanco (Figura 9E e Figura Suplementar 9H). Nossas descobertas sugeriram que a LLP induzida por DC é crítica para a morte celular imunogênica mediada por LMP, que é revertida pela importação de cisteína para o lisossomo pelo transportador lisossomal MFSD12 (Figura 9F).

Discussão

A inibição lisossomal parece ser uma abordagem terapêutica promissora em estudos pré-clínicos, e os ensaios clínicos de HCQ produziram resultados encorajadores, mas mistos (1, 32). O PPT1 é o alvo molecular do HCQ, e inibidores mais potentes do PPT1, como DC661 (2) e GNS561 (3), induzem a morte celular mediada por LMP in vitro. O mecanismo preciso da morte celular lisossômica e seu papel na imunogenicidade tumoral não foi totalmente elucidado. A imunidade antitumoral é aumentada quando a inibição da autofagia é combinada com imunoterapia (9, 10, 31). Os mecanismos propostos para a imunogenicidade intrínseca às células após a inibição da autofagia incluem o MHC classe I e a regulação positiva do imunoproteassoma, que suportam um melhor processamento e apresentação do antígeno. Além disso, a perda de proteínas de autofagia ou a inibição da autofagia pela cloroquina aumentou a resposta das células T CD8+, aumentando os níveis superficiais de MHC classe I em células dendríticas (33). Mostramos anteriormente que a inibição sistêmica do PPT1 pode repolarizar macrófagos de um fenótipo M2 para M1. Os inibidores de PPT1 podem aumentar os níveis de STING, levando à liberação de IFN e ao aumento da morte mediada por células T em modelos de melanoma (31). Aqui, demonstramos que o próprio LLP produz uma forma imunogênica intrínseca às células tumorais de morte celular. Descobrimos que a inibição lisossomal induziu muito poucas alterações proteicas nas células cancerígenas, e as proteínas mais significativamente elevadas incluíam receptores de carga de autofagia e reguladores de apoptose. Nossa abordagem visando alguns desses genes em todas as funções demonstrou que as proteínas induzidas por drogas provavelmente não eram os principais reguladores da morte celular. A inibição genética de ULK1 ou ATG7 também não resgatou a citotoxicidade do DC661. Demonstramos que a inibição lisossomal ativa múltiplas formas de morte celular programada, incluindo apoptose, necroptose, ferroptose e piroptose, mas cada uma delas era dispensável para citotoxicidade induzida por drogas. É digno de nota que os mecanismos programados de morte celular podem se sobrepor e o co-direcionamento de múltiplos mecanismos de morte celular poderia fornecer citoproteção contra a morte celular após a permeabilização da membrana lisossomal. Nosso trabalho descartou mecanismos dependentes de catepsina e cálcio para a morte celular lisossomal e destacou a importância do LLP como o determinante crítico da morte celular. Encontramos evidências de LLP que era reversível por um antioxidante que foi transportado para o lisossoma, o NAC, e foi crítico para a permeabilização e citotoxicidade da membrana lisossomal. O NAC foi o único agente capaz de mitigar ou reverter a morte celular induzida por DC, e essa capacidade dependia da presença do transportador lisossomal de cisteína MFSD12. A falta de penetração lisossomal é provavelmente a razão pela qual outros supostos inibidores da peroxidação lipídica, Trolox e vitamina C, não foram capazes de prevenir a citotoxicidade do DC661. O NAC é convertido em cisteína, que é importada para os lisossomos e oxida em sua forma dissulfeto, a cistina. A cistina é exportada para o citosol por outro transportador lisossômico, a cistinose, onde é reduzida a cisteína que remobiliza as fontes internas de nutrientes, reativa o alvo do complexo 1 da rapamicina e promove a autofagia (34). Este ciclo de oxidação-redução de cisteína para cistina (lisossomas) e de volta para cisteína (citosol) poderia ser um possível mecanismo de resgate do NAC contra a citotoxicidade do DC661 ou lesão lisossômica mais geral em outros contextos de doenças onde o NAC provou ser útil terapeuticamente (35) . O NAC não apenas reverteu LLP e LMP induzidos por DC, mas também uma expressão de superfície do marcador imunogênico de morte celular calreticulina. A expressão da proteína CALR na superfície celular foi necessária para a citotoxicidade melhorada mediada por células T induzida por esplenócitos estimulados por DC, demonstrando que a inibição lisossomal produz uma forma específica de imunogenicidade intrínseca à célula.

Embora estudos anteriores tenham demonstrado que a inibição lisossômica pode aumentar a atividade antitumoral da inibição do ponto de controle imunológico em tumores de flanco estabelecidos (9, 31), nosso estudo é o primeiro de nosso conhecimento a demonstrar um efeito semelhante ao de uma vacina para tumores MC38, mas não para tumores B16 em células tumorais pré-tratadas com DC661 antes da implantação. Isto demonstra que a morte celular lisossomal pode induzir imunogenicidade intrínseca às células, mas estas alterações por si só não são suficientemente prováveis ​​para reverter um microambiente tumoral "imune frio" num microambiente tumoral "imune quente". Nossos estudos anteriores em modelos de microambiente tumoral "imune frio" B16 e BRafCA PtenloxP Tyr: modelos de camundongos geneticamente modificados CreERT2 (31) demonstraram que a inibição lisossômica sistêmica produziu efeitos em macrófagos associados a tumores e células supressoras derivadas de células mieloides que foram suficientes para melhorar a eficácia da imunoterapia. Pode ser que a imunogenicidade intrínseca às células também desempenhe um papel nestes tumores imunes resfriados que se tornam mais responsivos ao CDI após a inibição lisossomal. O efeito semelhante ao da vacina da inibição lisossomal observado num ambiente laboratorial controlado pode ou não traduzir-se na clínica, mas poderia explicar porque é que alguns doentes tratados com dabrafenib, trametinib e HCQ em melanoma com mutação BRAF previamente tratado tiveram uma lesão tão profunda e duradoura. resposta a este regime (32). Mais estudos são necessários para entender como a inibição do PPT1 produz ERO lisossomal e peroxidação lipídica. A regulação dependente de PPT1-da V-ATPase e da acidificação lisossomal não é uma explicação suficiente porque a bafilomicina inibe a acidificação lisossomal, mas não produz LMP (dados não mostrados). As implicações dessas descobertas sugerem que os inibidores lisossômicos que aumentam a imunogenicidade intrínseca às células tumorais podem ser racionalmente combinados com terapias que melhoram a ativação das células T ou a infiltração no microambiente tumoral, potencialmente produzindo efeitos sinérgicos.

Figura 5. A N-acetilcisteína previne a morte celular induzida por DC661-. (A)

Métodos

Cultura de células. A375P humano (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), A549 (CRM-CCL-185) e linhas celulares B16F10 (CRL-6475) de camundongo foram adquiridas da ATCC. As linhas humanas A375 (CRL -1619, ATCC), WM35, WM793 e YUMM1.7 de camundongo (WT, Gsdme EV e Gsdme KO1 e KO2) foram obtidas internamente. Células MC38 e CT26 de camundongo foram fornecidas por Andy Minn, Universidade da Pensilvânia. Células primárias de medula óssea FL5.12 e dependentes de IL -3 Bax-/-Bak-/- (Bax / Bak DKO) foram obtidas de Kathryn E. Wellen, Universidade da Pensilvânia. A linha celular humana Panc-1 (CRL-1469, ATCC) foi fornecida por Ben Z. Stanger, Universidade da Pensilvânia. A linha celular YUMMER 1.7 de ratinho foi obtida de Xiaowei (George) Xu, Universidade da Pensilvânia. Todas as linhas celulares foram testadas para Mycoplasma semestralmente pelas instalações principais da Universidade da Pensilvânia e autenticadas usando impressões digitais repetidas em tandem pelo núcleo do Wistar Institute Genomics. As linhas celulares A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 e Bax/Bak DKO foram cultivadas em RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); As linhas celulares A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10 e MC38 foram cultivadas em DMEM (Invitrogen, 11995); e células YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV e Gsdme KO1 e KO2) (15) foram cultivadas em DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Os meios de cultura foram suplementados com 10% de soro bovino fetal (12306C, MilliporeSigma) e 1 × solução antibiótica antimicótica (Gibco, 15140-122). As linhas celulares FL5.12 e Bax/Bak DKO foram mantidas em meio RPMI completo suplementado com 50 μM de -mercaptoetanol (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma) e 0,35 ng/mL e 3,5 ng /mL IL-3, respectivamente. As linhas celulares YUMMER1.7 e YUMM1.7 (WT, Gsdme EV e Gsdme KO) foram mantidas em meio completo suplementado com 1 × MEM NEAA (Gibco, 11140-050). Células WM35 e WM793 foram cultivadas em meio MCDB 153 (MilliporeSigma, M7403), contendo 10% de FBS em 1 × meio Leibovitz L-15 (Corning, 10-045-CV), 7,5% p/v de bicarbonato de sódio ( Corning, 25-035-CI), 1 × solução antibiótica antimicótica (Gibco, 15140-122) e 5 ug/mL de insulina (MilliporeSigma, I0516). As células foram cultivadas a 37 graus na presença de 5% de CO2. Produtos químicos e reagentes. Os produtos químicos adquiridos incluíram HCQ Sulfate (Spectrum Chemicals, 747-36-4) e DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) foi usado para corar as células quanto ao cálcio de acordo com as instruções do fabricante. Uma lista de anticorpos e inibidores é fornecida na Tabela Suplementar 1 e na Tabela Suplementar 2.

Figura 6. NAC reverte LLP de maneira12-dependente de MFSD. (AC-C)

Extração e digestão de proteínas para análise por cromatografia líquida – espectrometria de massa em tandem para proteômica. {{0}}.7 × 106 células de melanoma A375P foram cultivadas em placas de cultura de 60 mm. As células foram tratadas com DMSO (controle), DC661 (3 μM), HCQ (10 μM) ou HCQ (3{{70}} μM) por 24 horas a aproximadamente 5{{ 112}}% de confluência. Pelotas de células congeladas foram lisadas com Tris 50 mM pH 7,4, SDS a 1%, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0 PMSF 0,15 mM, pepstatina 1 ug/mL, e 1 ug/mL de leupeptina. Os lisados ​​​​clarificados (1 0 ug cada) foram submetidos a eletroforese de 0,5 cm em um gel bis-tris seguido de fixação e coloração com Coomassie coloidal. Cada faixa de gel de 0,5 cm foi excisada, descorada, reduzida com tris (2-carboxietil) fosfina, alquilada com iodoacetamida e digerida com tripsina como descrito anteriormente (36). As digestões (1 ug) foram analisadas por cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) num espectrómetro de massa Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) em linha com um nanoAQUITY UPLC (Waters). A separação analítica foi realizada em uma coluna Peptide BEH C18 de 1,7 μm × 250 mm (Waters, 186003546) usando um gradiente de 245-minuto com 0,1% de ácido fórmico em água (fase móvel A) e acetonitrila (fase móvel B) como segue : 5%–30% B durante 225 minutos, 30%–80% B durante 5 minutos, 15-minutos mantidos em 80% B e retorno às condições iniciais. Os espectros MS completos foram adquiridos com resolução de 70,000, com um intervalo de varredura de 400–2,000 m/z, um alvo de controle de ganho automático de 3 × 106 íons e um tempo máximo de injeção de 50 milissegundos. Os espectros MS2 dependentes de dados foram adquiridos para os 20 íons mais abundantes com resolução de 17.500, com largura de isolamento de 1,5 m/z, alvo de controle automático de ganho de 5 × 104 íons e tempo máximo de injeção de 50 milissegundos. A correspondência de peptídeos foi definida como preferida e íons não atribuídos e com carga única foram rejeitados (37). Os dados brutos de MS foram analisados ​​usando MaxQuant 1.6.5.0 (//maxquant.net/perseus/) com um banco de dados de sequências humanas Uniprot (acessado em 10 de outubro de 2019) e um banco de dados de contaminantes comuns, incluindo tripsina, queratinas, proteínas bovinas, e micoplasma (38). Especificidade do peptídeo tríptico com um máximo de 2 clivagens perdidas, modificação fixa na cisteína (carbamidometilação) e oxidação variável da metionina ou acetilação N-terminal foram utilizadas na pesquisa (39). Um ponto de corte de 1% FDR foi utilizado para peptídeos e proteínas. A correspondência entre execuções foi habilitada; as proteínas foram quantificadas usando quantificação sem rótulo (40). A análise estatística foi realizada usando Perseus 1.6.2.3 (//maxquant.net/perseus/) (41, 42). Foi necessário que as proteínas fossem identificadas por pelo menos 3 peptídeos únicos e tivessem 3 valores válidos (quantificação diferente de zero) dentro de um grupo de amostras, e os contaminantes e proteínas reversas foram filtrados do conjunto de dados. Os valores faltantes foram imputados a partir de uma distribuição normal. Comparações pareadas entre condições foram realizadas no nível da proteína usando um teste t de Student 2- com cauda com FDR baseado em permutação com s0=0.1 e 250 randomizações. Alterações significativas foram definidas como FDR inferior a 5% e uma alteração absoluta maior que 1,5 ou 2,0, conforme especificado. Lyso-IP. Células A375P foram infectadas com lentivírus pLJC5-Tmem192-3xHA e selecionadas usando 1 mg/mL de puromicina (MilliporeSigma, P4512). Aproximadamente 3 x 106 células A375P marcadas com HA foram tratadas com NAC 10 mM ou controle de veículo aquático por 24 horas em condições de cultura descritas anteriormente. Após o tratamento, as células foram lavadas em PBS, colhidas em 0,5 mL de KPBS frio e homogeneizadas suavemente usando 20 golpes num homogeneizador Dounce de 2 mL. Cerca de 2,5% do homogeneizado foi reservado para análise de lisado de células inteiras, e o restante foi centrifugado a 3,000g por 2 minutos a 4 graus para remover detritos da membrana celular. O sobrenadante homogeneizado foi então transferido para um tubo limpo de 1,5 mL e incubado com 50 μL de esferas anti-HA (Pierce, 88836) ou esferas anti-DDK/Flag (OriGene, TA150042) por 15 minutos a 4 graus. As amostras foram então precipitadas colocando tubos em DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) e agitadas suavemente durante 2 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi reservado para análise de fração não ligada. IP foi lavado 3 vezes com KPBS contendo CaCl2 8 mM. O Lyso-IP foi extraído em MeOH 80% para análise metabolômica. Extração e análise lipídica usando LC-MS/MS para lipidoma global. Células de melanoma A375P foram semeadas em placas de 60 mm a 0,7 x 106 células por placa. Quando as células estavam em aproximadamente 50% de confluência, elas foram tratadas com DMSO (controle), DC661 (3 μM) ou HCQ (30 μM) por 24 horas. As células foram lavadas 2 vezes com HBSS, raspadas em metanol gelado e transferidas para tubos de vidro para extração lipídica com clorofórmio / metanol / NaCl a 0, 88% (2: 1: 1) contendo um padrão lipídico interno EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids). As amostras foram agitadas em vórtex e depois sonicadas em banho-maria por 5 minutos em gelo. Após centrifugação a 500g por 15 minutos a 40 graus, a fase inferior foi transferida para outro tubo de vidro. A fase superior foi reextraída usando uma fase inferior sintética. Após sonicação e centrifugação, a fase inferior foi combinada com a primeira coleta da fase inferior. As amostras foram secas sob nitrogênio, ressuspensas em clorofórmio 10%/metanol 90% e transferidas para frascos de vidro LTQ. As amostras lipídicas foram analisadas em um espectrômetro de massa Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X e no sistema Vanquish Horizon UHPLC. A separação analítica utilizou uma coluna Accucore C30 (2,1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) com 50:50 acetonitrila/água e 88:10:2 isopropanol/acetonitrila/água, cada uma contendo 5 mM de formato de amônio e 0,1% de ácido fórmico. Os dados LC-MS/MS foram adquiridos separadamente em polaridades positivas e negativas com os seguintes parâmetros do instrumento: MS1 scan 120,000 resolução; MS2 dependente de dados nos 20 íons mais abundantes com resolução de 15,000; Largura de isolamento de 0,4 m/z; e uma energia de colisão normalizada escalonada de 20:30:40 (43).

Figura 7. A N-acetilcisteína previne a expressão superficial da calreticulina induzida por DC661-. (DE ANÚNCIOS)

Os lipídios foram identificados e quantificados usando LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). As espécies lipídicas identificadas foram filtradas por adutos esperados e grau de identificação baseado na classe. As áreas de pico foram normalizadas para os padrões EquiSPLASH para classes suportadas e posteriormente normalizadas com base na área total de cada amostra para corrigir a variação no número de células. A análise estatística foi realizada em dados transformados em log usando Perseus 1.6.2.3 (//maxquant.net/perseus/) (41, 42). Extração e análise de metabólitos usando LC-MS/MS para metabalona. Metabólitos polares foram extraídos de células inteiras, frações não ligadas de Lyso-IP e amostras ligadas a Lyso-IP usando 80% de metanol e foram armazenados a –8{{30}} graus antes da cromatografia líquida –análise por espectrometria de massa (LC-MS). Os extratos foram analisados ​​​​por LC-MS usando um espectrômetro de massa Thermo Scientific Q-Exactive HF-X com uma sonda HESI II em linha com um sistema Thermo Vanquish Horizon UHPLC. A separação por LC foi realizada usando uma coluna ZIC-HILIC (2,1 mm x 150 mm, tamanho de partícula de 5 μm, EMD Millipore) com uma coluna de guarda ZIC-HILIC (2,1 mm x 20 mm, EMD Millipore) mantida a 45 graus com uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min. A cromatografia foi realizada sob condições ácidas para reduzir a reatividade dos grupos tiol. A fase móvel A era água e B era acetonitrila, ambas contendo 0,1% de ácido fórmico. O gradiente de LC foi de 85% de B durante 2 minutos, 85% de B a 20% de B durante 15 minutos, 20% de B a 85% de B durante 0,1 minutos e 85% de B durante 8,9 minutos. O amostrador automático foi mantido a 4 graus e 4 μL de cada amostra foram injetados por análise. Foram utilizados os seguintes parâmetros de MS: vazão do gás de bainha, 40 UA; vazão de gás auxiliar, 10 UA; taxa de fluxo de gás de varredura, 2 UA; temperatura do aquecedor a gás auxiliar, 350 graus; tensão de pulverização, 3,75 kV para modo positivo e 3,5 kV para modo negativo; temperatura capilar, 375 graus; e nível de RF do funil, 40%. Todas as amostras foram analisadas por MS completo com troca de polaridade. Varreduras completas de MS foram adquiridas de 65 a 975 m/z com resolução de 120,000 com um alvo de controle de ganho automático de 1 × 106 íons e um tempo máximo de injeção de 100 milissegundos. Os dados brutos foram analisados ​​usando TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Os metabólitos alvo foram identificados pela massa precisa e pelo tempo de retenção em sua polaridade preferida com base em padrões analíticos. A detecção de pico utilizou o algoritmo ICIS com suavização de 1. A quantificação relativa foi realizada utilizando uma área de pico integrada, e esses valores foram corrigidos para a quantidade total por amostra (definida como a área total de pico). Edição PPT1-CRISPR/Cas9. Células não-alvo e KO A375P PPT1- foram preparadas como descrito anteriormente (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) foi um presente de Feng Zhang (plasmídeo Addgene, 48139). Os oligos de RNA guia (IDT) foram recozidos, fosforilados e depois ligados ao plasmídeo pX459 digerido e desfosforilado com BbsI seguindo os protocolos do laboratório Zhang, disponíveis através da Addgene. Os plasmídeos ligados foram transformados em células Stbl3 (Invitrogen). O sequenciamento das preparações de plasmídeos confirmou a presença das sequências de RNA guia desejadas. Células A375P foram transfectadas usando Lipofectamine 3 000 (Invitrogen, L3000015), seguido de seleção com puromicina. Os ensaios do Surveyor confirmaram a edição do gene PPT1 por CRISPR/Cas9, e o knockdown de PPT1 foi confirmado por Western blotting com anticorpo PPT1 (Origene). As sequências para oligos de RNA guia são as seguintes: RNA guia não alvo direto (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), RNA guia não alvo reverso (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), RNA guia 1 humano PPT1 direto (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), RNA guia 1 reverso PPT1 humano (AAACGGGCATCGAGGGAGTCCAAA), RNA guia 3 humano PPT1 direto (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC) e RNA 3 guia PPT1 humano reverso (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Os clones cultivados a partir de células únicas utilizados neste artigo incluem os seguintes: o clone C8 é o guia humano 1 e o clone B5 é o guia humano 3. Immunoblotting. Um milhão de células foram plaqueadas numa placa de 10 cm e os tratamentos foram administrados no dia seguinte; as células foram coletadas por raspagem. Os lisados ​​​​de células inteiras foram preparados utilizando tampão de lise SDS. A concentração de proteína foi medida utilizando um kit Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, 23225). 30-50 ug de proteína foram utilizados para SDS-PAGE e foram transferidos para uma membrana de PVDF (Bio-Rad, 1620177). A membrana foi bloqueada usando BSA a 5% ou leite desnatado a 5%, conforme condições otimizadas, e incubada com anticorpo primário durante a noite a 4 graus. As membranas de PVDF foram lavadas com 1 × TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) e incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com anticorpo secundário conjugado com HRP específico da espécie. As membranas foram subsequentemente lavadas e reveladas utilizando substrato Pierce ECL Western Blotting (Thermo Fisher Scientific, 32106) e filmes de autorradiografia (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Para estudos de piroptose, os lisados ​​proteicos foram separados por SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF. Após bloqueio em BSA a 5%, as membranas de PVDF foram incubadas com os anticorpos primários indicados durante a noite a 4 graus, lavadas em PBS/Tween e incubadas com anticorpos secundários acoplados à peroxidase. A imunorreactividade foi detectada utilizando anticorpos secundários conjugados com HRP (CalBioTech), um substrato de quimioluminescência (Thermo Fisher Scientific) e um sistema de imagem ChemicDoc MP (Bio-Rad). Para experiências envolvendo sobrenadante, as células foram cultivadas num meio isento de FBS para evitar distorção de SDS-PAGE. Os sobrenadantes celulares foram colhidos e centrifugados durante 10 minutos a 500 g a 4 graus para remover detritos celulares. Os sobrenadantes resultantes foram concentrados 10x usando Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) por centrifugação durante 30 minutos a 4.500 g a 4 graus. Os concentrados foram misturados com tampão de amostra e analisados ​​através de Western blotting como descrito acima. A coloração do gel de proteína foi realizada utilizando coloração com vermelho Ponceau. Ensaio de atividade de LMP e catepsina L. O plasmídeo pEGFP-hGal3 humano foi um presente de Tamotsu Yoshimori (plasmídeo Addgene, 73080) e foi usado para criar a linha A375P-Galectina -3. A estrutura do vetor plasmídico de controle pEGFP-C1 foi adquirida (novo prolabs, V012024). Os plasmídeos foram transfectados (1 µg/mL) em células A375P utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) de acordo com o protocolo do fabricante; as células transfectadas foram selecionadas de forma estável usando G418 (Gibco, 10131035). Para LMP, um total de 25 células positivas para A375P-galectina -3 puncta em vários campos de imagem foram contadas. A porcentagem de células positivas para puncta foi calculada em cada campo separadamente, e uma porcentagem média foi calculada para cada grupo. O kit de ensaio Magic Red Catepsin L (Abcam, ab270774) foi utilizado de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram fotografadas sob um microscópio invertido Zeiss Axio Observer 7. A intensidade integrada bruta do Magic Red foi calculada usando o software Fiji - ImageJ (NIH). Ensaio de viabilidade celular de MTT (3-[4, 5-dimetiltiazol-2-il]-2, 5 difenil tetrazólio). 2.000 células foram plaqueadas em triplicado em cada poço de uma placa de 96-poços, e ensaios de MTT de 3-dia foram realizados usando o kit de viabilidade celular (Roche, 11465007001) de acordo com o protocolo do fabricante. O pré-tratamento com inibidor foi administrado durante 1 hora, seguido de co-tratamento das células com inibidores com ou sem DC661. O método de regressão não linear (ajuste de curva) foi utilizado para calcular IC50.

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Ensaio de formação de colônias 2,{1}} células por poço foram semeadas em uma placa de 6-poços e foram tratadas no dia seguinte; as células foram mantidas sob tratamento por um total de 8 dias. As colônias formadas em cada poço foram lavadas com PBS, fixadas com metanol frio a –20 graus por 20 minutos e coradas com solução aquosa Crystal Violet 0,5% (V5265; MilliporeSigma).

Ensaio de exclusão de corante azul tripano. A mistura de reação para o ensaio de azul de tripano foi preparada misturando 1 parte de 00,4% de azul de tripano (25- 900-CI, Corning) e 1 parte de amostras de células diluídas. A mistura foi incubada por 1 minuto e as células foram contadas no Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).

Figura 8. A expressão superficial da calreticulina induzida por DC prepara células T contra células tumorais. (A)

Figura 9. A inoculação de células tratadas com DC produz rejeição tumoral em contextos específicos. (A)

ESPUMA-LPO. O LLP foi estudado utilizando uma sonda fluorescente, FOAMLPO. FOAM-LPO foi sintetizado como descrito anteriormente (26). As células foram cultivadas em um μSlide de 8 poços (ibid, 80807) e tratadas com inibidores e com ou sem DC661. As células foram incubadas com meio contendo FOAM-LPO (1 M) numa atmosfera de 5% de CO2 e 95% de ar durante 5 minutos a 37 graus. As células foram lavadas duas vezes com meio e depois as células foram observadas ao microscópio (microscópio invertido Zeiss Axio Observer 7) para detectar a mudança de fluorescência de 586 para 512 nm em resposta ao LLP. qRT-PCR e iniciadores. Células A375P (3 x 105) foram cultivadas em placas de 60 mm e tratadas com DMSO ou DC661 (3 μM) por 24 horas. O RNA total foi isolado com um kit de isolamento de RNA (QIAGEN, 74134) de acordo com o protocolo do fabricante. O cDNA foi sintetizado usando um kit iScript Reverse Transcriptase com 500 ng de RNA purificado de acordo com o protocolo do fabricante (Thermo Scientific, K1642). A reação qPCR foi configurada usando SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) contendo 1 μL de cDNA. Todas as medidas foram realizadas em triplicata e o BACTIN foi utilizado como padrão interno para cálculos de ΔCT. A análise da expressão gênica foi feita usando os seguintes primers: PTGS2/COX-2 forward (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 reverso (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS forward (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS reverso (GACCAGTGATGTCAACAGGAGC), CHAC1 forward (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 reverso (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN direto (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) e BACTIN reverso (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).

transfecção de siRNA. Estudos de knockdown genético para ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 e MFSD12 humanos foram realizados em linhas celulares A375P. Estudos de inibição genética para Ppt1 e Calreticulina de camundongo foram realizados em células MC38. siRNA não alvo (sc{{10}}), ULK1 humano (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), mouse Ppt1/Cln1 (sc-142398) e Calreticulina Os siRNAs /calregulina (sc-29895) foram adquiridos da Santa Cruz Biotechnology. Esses siRNAs consistem em conjuntos de 3 a 5 siRNAs específicos do alvo. Citometria de fluxo. A indução de ferroptose foi medida usando C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). Células A375P foram semeadas em uma placa de 6-poços e tratadas com DMSO, ferrostatina{{40}} (10 μM), roxstatina labial-1 (2 μM), elastina (5 μM ), DC661 (3 μM) ou uma combinação por 24 horas. As células foram colhidas por centrifugação a 300 g durante 5 minutos. As células foram ressuspensas em 500 μL 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) contendo 1 μM C11-BODIPY e incubadas a 37 graus por 15 minutos. As células foram sedimentadas e ressuspensas em 500 μL de 1X HBSS, e a intensidade de fluorescência foi medida em um citômetro BD LSRII usando 530/30 Blue (University of Pennsylvania Flow Core Facility). A quantificação da expressão da calreticulina na superfície celular para morte celular imunogênica foi realizada conforme descrito anteriormente (45) por citometria de fluxo. Células B16F10 ou MC38 foram cultivadas e tratadas com NAC (10 mM) ou DC661 (3 μM) por 24 horas. Células MC38 foram tratadas com siPpt1 ou siNT durante 48 horas na presença ou ausência de NAC 10 mM durante 24 horas. As células foram coradas com anticorpo CALR (Cell Signaling Technology, 12238), segundo anticorpo de cabra anti-coelho Alexa Fluor 647 (Invitrogen) e iodeto de propídio (PI) (Biolegend, 421301). As amostras coradas foram adquiridas em um citômetro de fluxo BD LSRII usando 710/50 Blue e 670/30 Red para capturar a fluorescência PI e CALR, respectivamente (instalação Flow Core da Universidade da Pensilvânia), e a análise foi restrita a células CALR positivas e PI negativas para evitar eventos falso-positivos. Priming de células T e porcentagem de citotoxicidade. Células tumorais B16 ou MC38 (5 × 104) foram cultivadas e tratadas com NAC (10 mM) ou DC661 (1 μM ou 3 μM), respectivamente, durante 24 horas. Para inibição genética de Calr, as células MC38 foram tratadas com siRNA Calr ou siRNA não alvo (siNT) por 48 horas, seguido de tratamento com DMSO ou 3 μM DC661 por 24 horas. Os esplenócitos foram então cultivados com DC661 com ou sem células B16 ou MC38 na presença de IL-2 (5 UI/mL) e cocultivados por 72 horas. A preparação foi confirmada por IFN-ELISA (Biolegend, 430815) do sobrenadante. Os esplenócitos preparados foram então co-cultivados com células B16 ou MC38 recentemente cultivadas com proporções alvo-efector (B16 ou MC38 para esplenócitos) de 1:20 e 1:50 para células B16 e MC38, respectivamente. A liberação de LDH associada à morte celular B16 ou MC38 e depois a citotoxicidade percentual foram medidas de acordo com o protocolo do fabricante (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Ensaios de vacinação antitumoral e estudos de quimioterapia com modelos de câncer estabelecidos. Camundongos WT C57BL/6 fêmeas com seis a oito semanas de idade, camundongos NOD/SCID e BALB/c foram obtidos do Laboratório Jackson. Para experiências de vacinação antitumoral, as células WT B16F10, MC38 e CT26 foram tratadas com DC661 (3 μM) durante 36 horas em frascos de 175 cm2. Em seguida, os sobrenadantes e as células destacadas foram coletadas em um tubo Falcon de 50 mL. As células foram centrifugadas e lavadas com PBS gelado. Para vacinação, 150 μL de suspensão celular foram injetados sc no flanco esquerdo de camundongos C57BL/6 imunocompetentes, camundongos NOD/SCID imunodeficientes (1,8 x 104 células B16F10, 1,5 x 106 células MC38 por camundongo) ou camundongos singeneicos BALB/c (3,0 × 106 células CT26 por rato). Células congeladas e descongeladas ressuspensas em PBS foram injetadas como controle negativo. Uma semana depois, células cancerosas vivas dos mesmos tipos (3 x 104 células B16F10, 2 x 105 células MC38 ou 5 x 105 células CT26 por camundongo) com um volume igual de Matrigel (Corning, 354248) foram injetadas no flanco direito. de ratos vacinados. Os tumores foram medidos utilizando paquímetros eletrônicos e o volume foi calculado como L × W2 × 0,5. O crescimento do tumor foi monitorado regularmente durante os dias seguintes, e a ausência de tumores foi considerada uma indicação de vacinação antitumoral eficiente. Os estudos de vacinação DC661-MC38 foram repetidos em camundongos NOD/SCID. Estatisticas. A significância estatística foi determinada usando o teste t de Student não pareado 2-com cauda ao comparar dois grupos. O teste ANOVA 1-way foi usado quando mais de dois grupos foram comparados. Uma hipótese nula foi rejeitada significativamente se o valor P fosse inferior a 0,05. Os dados são mostrados como média ± SEM. Aprovação do estudo. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Pensilvânia.

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