Transplante de Rim

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INTRODUÇÃO

Rimtransplantaçãoé a melhor escolha para o tratamento em estágio final da doença renal crônica. Atualmente, a rejeição mediada por anticorpos (RAM), caracterizada pela presença de um anticorpo específico do doador (DSA) direcionado ao antígeno leucocitário humano (HLA), emergiu como a principal causa de dano crônico ao enxerto renal, que limita em grande parte a sobrevivência a longo prazo do enxerto. (1, 2). No entanto, os esquemas existentes não conseguiram alcançar resultados promissores na clínicatratamento da RAM (1, 3, 4). Assim, há uma necessidade urgente de identificar potenciais biomarcadores e fatores de risco para RAM após o transplante renal, o que é fundamental para o tratamento e os resultados dos pacientes.

Evidências acumuladas sugerem que, em circunstâncias inflamatórias, as células B podem se diferenciar em plasmablastos secretores de anticorpos e células B reguladoras (Bregs), que são um subconjunto especial de células B que secretam citocinas imunossupressoras, particularmente interleucina (IL)-10. (1, 5-7). Assim, os plasmablastos produzem aloanticorpos, resultando em AMR, enquanto os Bregs exibem funções imunorreguladoras e ajudam a induzir a homeostase imune. Assim, os Bregs foram relatados como intimamente associados à resistência à RAM após transplantes de rim (1, 8, 9).

Embora os marcadores de superfície distintos dos subconjuntos de Bregs ainda não tenham sido identificados em humanos (1), estudos anteriores relataram quatro subpopulações comuns de Bregs: Bregs de memória (mBregs) definidos com o CD19 mais CD24 mais CD27 plus (10), Bregs de transição ( tBregs) definido com CD19 mais CD24 mais CD38 mais (10, 11), IL{10}}produção de memória Bregs (IL-10 mais mBregs) definido com CD19 mais CD24 mais CD27 mais IL-10 mais (12), e IL-10-produzindoBregs transicionais (IL-10 mais tBregs) definidos com CD19 mais CD24 mais CD38 mais IL-10 mais (13). Laguna-Goya et al. relataram que a redução de tBregs e IL-10 mais tBregs está positivamente associada à rejeição aguda após transplantes renais (14). No entanto, Zhou et al. relataram que mBregs, em vez de tBregs, diminuíram significativamente em cinco pacientes com rejeição aguda no pós-transplante de fígado (10). Além disso, Shabir et al. relataram que os tBregs não foram associados à rejeição de aloenxertos renais em três pacientes com RAM (15). À luz desses resultados inconsistentes, há a necessidade de esclarecer melhor qual subpopulação Breg desempenha um papel vital em pacientes com RAM após transplantes renais.

No presente estudo, as proporções de quatro subpopulações de Bregs circulantes foram comparadas entre os grupos saudável, estável (ST) e AMR. Em seguida, foi determinada a biodistribuição de células B, IL-10 e quimiocinas nos enxertos renais de pacientes saudáveis, ST e AMR. Além disso, foi investigada a dinâmica das quatro subpopulações de Bregs circulantes em pacientes com ST por 90 dias após a cirurgia. Os resultados atuais, juntamente com os relatados por estudos anteriores (1), sugerem que IL-10 mais mBregs e IL-10 mais tBregs circulantes são as principais subpopulações de Bregs que contribuem para a resistência da RAM.

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Palavras-chave:Fenotipagem Breg, transplante renal, rejeição mediada por anticorpos, homeostase, dinâmica

MATERIAIS E MÉTODOS

Pacientes e Grupos

Todos os pacientes forneceram um consentimento informado assinado antes do estudo. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do First Affiliated Hospital of Zhengzhou University (2018-KY-72). O número de registro do ensaio clínico é ChiCTR1900022501.

Esses pacientes foram divididos em três grupos: (1) grupo controle saudável (saudável, n=9): doadores de rim saudáveis ​​com idade entre 18 e 55 anos (livres de doença), composto pelos irmãos e cônjuges dos receptores; (2) grupo de receptores com função do enxerto estável (ST, n=25): pacientes com idade entre 18 e 55 anos, cuja função renal estava estável (livre de infecção ou rejeição antes e após o transplante renal) durante o seguimento período ( Maior ou igual a 6 meses); (3) receptores com grupo AMR (AMR, n=18): pacientes entre 18-55 anos, que foram diagnosticados com AMR. Os enxertos renais de receptores com ST e AMR foram obtidos dedoador de rim saudávels. O diagnóstico diferencial entre os grupos ST e AMR foi confirmado por dois patologistas renais, de acordo com o consenso de Banff 2017 (3, 16).

Sangue Periférico, Tecidos Renais e Amostras de Células

As amostras de sangue periférico do grupo saudável foram coletadas no pré-operatório, 1, 7 e 14 dias pós-operatório. As amostras obtidas do grupo ST foram coletadas no pré-operatório, 1, 7, 14, 30 e 90 dias pós-operatório. As amostras obtidas do grupo AMR foram coletadas quando ocorreu a rejeição (antes da terapia anti-rejeição para AMR). Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de

5 ml de sangue por centrifugação em gradiente Ficoll-Paque e preservado com 10 por cento de dimetilsulfóxido (Solarbio Inc., Pequim, China) em nitrogênio líquido.

As amostras de biópsia renal por agulha grossa obtidas do grupo saudável foram coletadas antes da cirurgia para biópsias renais de doadores de tempo zero. As amostras de biópsia renal por agulha grossa obtidas do grupo ST foram coletadas 90 dias após a operação após a estabilização da função renal devido à biópsia do protocolo. À luz do segundo comprometimento da função renal por punção, todos os pacientes com RMA recusaram a biópsia renal por agulha grossa após terapia anti-rejeição para RMA. Assim, amostras de biópsia renal por agulha grossa do grupo RMA foram coletadas apenas quando ocorreu rejeição (antes da terapia anti-rejeição para RMA). Um total de três doadores saudáveis, nove pacientes com ST e nove pacientes com RAM forneceram um consentimento informado assinado antes da biópsia renal por agulha grossa. Os seis doadores saudáveis ​​restantes, 16 pacientes com ST e nove pacientes com RAM recusaram a biópsia renal por agulha grossa devido ao medo de sangramento maior associado à biópsia. Células únicas foram isoladas de espécimes de biópsia renal por agulha grossa de três doadores saudáveis, três pacientes ST e três pacientes AMR, combinando dissociação mecânica com a degradação enzimática da matriz extracelular, que mantém a integridade estrutural dos tecidos (Multi Tissue Dissociation Kit 1; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha). As células renais foram preservadas com 10% de dimetilsulfóxido (Solarbio Inc., Pequim, China) em nitrogênio líquido, e as demais amostras de biópsia renal por agulha grossa foram embebidas em parafina a 4 graus.

Citometria de fluxo

As células armazenadas em nitrogênio líquido foram rapidamente descongeladas em banho-maria a 37 graus por 3 min. Um total de 2–3 × 106 PBMCs foram incubados com o coquetel de estimulação de células de diluição Roswell Park Memorial Institute 1640 (500×), que compreendeu o PMA (Phorbol 12-Myristate 13- Acetate), um ionóforo de cálcio (Ionomicina) e inibidores do transporte de proteínas Brefeldina A e Monensina, (eBioscience, San Diego, CA), a 37 graus com 5 por cento de CO2 por 5 h. As células mortas foram excluídas por coloração com 7-Aminoactinomicina D (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA), e os marcadores de superfície de Bregs foram corados com anticorpos marcados com fluorocromo (Brilliant Violet 421™ anti-human CD19, ficoeritrina (PE)/Cy7 anti-CD24 humano, Alexa FluorR647 anti-CD27 humano, Alexa FluorR488

anti-CD38 humano e Brilliant Violet 510™ anti-CD45 humano; os controles de isotipo apropriados: Brilliant Violet 421™ Mouse

Controle de isotipo IgG1 k, Controle de isotipo IgG2a k de camundongo PE/Cy7, Controle de isotipo Alexa FluorR647 IgG1 k de camundongo, Controle de isotipo Alexa FluorR488 IgG1 k de camundongo e Violeta brilhante

510™ Mouse IgG1k Controle de Isotipo; Biolegend, San Diego, CA,

EUA) por 30 min a 4 graus, com proteção da luz. Para a coloração intracelular, as células foram coradas com anticorpos direcionados às citocinas intracelulares de Bregs (PE anti-IL humana-10; os controles de isotipo apropriados: PE Rat IgG1 k Isotype Control; Biolegend, San Diego, CA, EUA) para 30 minutos à temperatura ambiente, com proteção da luz. As células marcadas foram analisadas usando o instrumento BD Biosciences Canto II (BD Biosciences, EUA). Um total de 100,000 eventos foram adquiridos no portão de linfócitos. A análise dos dados foi realizada por meio do software FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA, EUA).

Imuno-histoquímica

Immunohistochemistry staining of CD19, IL-10, and C-X-C motif chemokine 13 (CXCL13) in kidney tissues was performed, respectively. Brieflfly, 4 mm sections obtained from formalin-fifixed, paraffifin-embedded kidney tissue samples were incubated with 1:500-diluted anti-CD19, 1:1000-diluted antiCXCL13 (rabbit anti-human; Abcam, Cambridge, UK), and 1:500-diluted anti-IL-10 (rabbit anti-human; Absin, Shanghai, China) primary antibodies overnight at 4°C, followed by Horseradish Peroxidase-conjugated 1:20,000-diluted goat antirabbit secondary antibody (Abcam, Cambridge, UK) for 1 h at room temperature and then 3,3′-diaminobenzidine for another 10 min. DAPI appears in blue. Immunohistochemistry images were acquired with an Aperio ScanScope AT Turbo (Aperio, Vista, CA). Numbers of CD19, IL-10, and CXCL13 positivities were scored as follows: 0 positivity, score = zero; 1–5 positivities, score = one; 6–10 positivities, score = two; 11–20 positivities, score = three; >20 positividades, pontuação=quatro

Análise estatística

No estudo caso-controle aninhado, a análise da curva ROC (Receiver Operating Characteristic) foi realizada pelo MedCalc v18.11.3. As demais análises estatísticas foram realizadas usando IBM SPSS 21.0. Dados de medição normalmente distribuídos com homogeneidade de variância foram expressos como média ± desvio padrão (x ± s) e analisados ​​por teste t de amostra independente (comparações entre grupos) ou análise de variância unidirecional (comparações entre grupos). Os dados de medidas que não apresentaram distribuição normal ou homogeneidade de variância foram expressos em mediana com intervalo interquartil (IQR) e analisados ​​pelo teste U de Mann-Whitney (comparações entre grupos) ou teste de Kruskal-Wallis (comparações entre grupos). Os dados de contagem foram analisados ​​pelo teste c2, teste c2 corrigido ou teste exato de Fisher, conforme necessário. Análise de variância de medidas repetidas unidirecionais

foi usado em vários momentos. Valores P<0.05 were="" considered="" statistically="">

RESULTADOS

Características basais dos pacientes

Um total de nove doadores saudáveis, 25 pacientes com ST e 18 pacientes com RAM foram incluídos no presente estudo. Conforme mostrado na Tabela 1, o sexo dos receptores, idade, índice de massa corporal (IMC), nefropatia inicial, incompatibilidade HLA, CNIs, tempo de isquemia quente e tempo de isquemia fria não diferiram entre os grupos ou entre os grupos (P > 0.05, para todos). No entanto, a incidência de positividade para DSA anti-classe I e anti-classe II no grupo AMR foi significativamente maior, quando comparada ao grupo ST (P < 0.001="" para="" anti="" -classe="" i="" dsa,="" p=""><0,001; p="0,001" para="" anticlasse="" ii="" dsa).="" além="" disso,="" em="" comparação="" com="" os="" pacientes="" com="" st,="" os="" pacientes="" com="" amr="" tiveram="" pontuações="" significativamente="" mais="" altas="" em="" tubulite="" (t),="" inflamação="" intersticial="" (i)="" e="" capilarite="" peritubular="" (ptc)="" (p="0,012" para="" t;="" p=""><0,001 para="" i="" e="" ptc="" ),="" de="" acordo="" com="" a="" classificação="" de="" banff="" (normal,="" pontuação="0;" leve,="" pontuação="1;" moderado,="" pontuação="2;" grave,="" pontuação="3))" (3,="" 16)="" (="" tabelas="" suplementares="" 1="" e="">

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