A isofloroglucina A isolada de Ishige Okamurae suprime a melanogênese induzida por -MSH: in vitro e in vivo parte 1

Abstrato:Diphlorethohydroxycarmalol (DPHC) isolado de Ishige Okamura (IO) mostrou potenciais efeitos de clareamento contra a radiação UV-B. No entanto, os componentes do IO e seu mecanismo molecular contra o hormônio estimulante dos melanócitos (-MSH) ainda não foram investigados. Assim, este estudo teve como objetivo investigar os efeitos inibitórios da Ishophloroglucin A (IPA), um florotanino isolado de algas marrons IO, e seu extrato bruto (IOE), na melanogênese in vivo em um modelo de peixe-zebra induzido por -MSH e em células de melanoma B16F10 em vitro. Estudos de docking molecular dos florotaninos foram realizados para determinar seus efeitos inibitórios e elucidar seu modo de interação com a tirosinase, uma glicoproteína relacionada à melanogênese. Além disso, as alterações morfológicas e o conteúdo de melanina diminuíram no modelo de peixe-zebra induzido por -MSH após o tratamento com IPA e IOE. Além disso, o Western blotting revelou que o IPA regulou positivamente a expressão de proteínas extracelulares em células B16F10 estimuladas por -MSH. Portanto, esses resultados sugerem que o IPA isolado do IOE tem potencial para uso nas indústrias farmacêutica e cosmética.

De acordo com estudos relevantes,cistancheé uma erva comum conhecida como "a erva milagrosa que prolonga a vida". Seu componente principal écistanósido, que tem vários efeitos, comoantioxidante, anti-inflamatório e promoção da função imunológica. O mecanismo entre cistanche e clareamento da pele reside no efeito antioxidante dos glicosídeos cistanche.Melaninana pele humana é produzida pela oxidação da tirosina catalisada pela tirosinase. A reação de oxidação requer a participação de oxigênio, de modo que os radicais livres de oxigênio no corpo se tornam um fator importante que afeta a produção de melanina. Cistanche contém cistanósido, que é um antioxidante e pode reduzir a geração de radicais livres no corpo, assiminibindo a produção de melanina.

1. Introdução

As algas marinhas ganharam imensa atenção das indústrias de alimentos funcionais, cosméticos e farmacêuticas, pois utilizam compostos bioativos como florotaninos, fucoidanos, polissacarídeos e proteínas [1-7]. De acordo com um estudo anterior, Ishige Okamurae (IO) foi rastreado por seus efeitos inibitórios na atividade da tirosinase [8]. Embora seu florotanino, diphlorethohydroxycarmalol (DPHC), tenha sido avaliado quanto à atividade antimelanogênese induzida por radiação UV-B em um modelo in vitro [8], nenhum estudo adicional foi realizado para explicar a interação entre DPHC e proteínas relacionadas à melanogênese. Neste estudo, um novo composto de polifenol, Ishophloroglucin A (IPA) [9], foi avaliado por sua interação com a tirosinase em um estudo de docking molecular, comparado com o de DPHC.

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O docking molecular é um método computacional eficiente para prever o modo de ligação potencial de pequenas moléculas ou ligantes dentro do sítio ativo de uma proteína ou receptor de uma estrutura tridimensional conhecida para estudar seus padrões de interação ou para o design de drogas [10-12]. Estudos anteriores relataram o local de interação e o valor energético da enzima tirosinase, conforme investigado por estudos de ancoragem molecular [13,14]. Funcionalmente, a tirosinase é uma enzima limitante da taxa que catalisa uma taxa de reação relativamente lenta na via de sinalização e desempenha um papel fundamental na biossíntese de melanina em organelas especializadas chamadas melanossomos, sintetizadas especificamente por células melanocíticas [15]. Assim, a atividade enzimática da tirosinase modelada por meio de simulações de docking molecular in silico tem sido alvo de investigação de inibidores para prevenir distúrbios cutâneos hiperpigmentados. Com base nisso, em campos experimentais e computacionais, muitos compostos fenólicos ou inibidores que possuem capacidade de quelação de metais têm sido amplamente estudados como inibidores de tirosinase [16].

A melanina modula principalmente a cor da pele e atua como um pigmento protetor quando a pele é exposta à radiação UV [17]. A exposição à radiação ultravioleta causa a liberação do hormônio estimulante de -melanócitos (-MSH) dos queratinócitos e melanócitos cutâneos para induzir a síntese de melanina e, posteriormente, proteger a pele dos efeitos nocivos da radiação solar [18]. No entanto, a exposição a longo prazo à radiação UV induz a síntese significativa de melanina por -MSH, resultando em danos à pele, como sardas, manchas solares e manchas pretas na epiderme, levando a fotodanos no DNA e câncer de pele [19]. Em seguida, a administração de -MSH em melanócitos tem sido amplamente estudada para induzir alterações consideráveis ​​na atividade da tirosinase para melanogênese em melanoma [20].

Zebrafish exibem variações na cor da pele como os humanos. Eles são um modelo animal usado para entender a origem genética da cor da pele humana, conectando a biologia básica do organismo modelo com a genética humana [21]. Além disso, os pigmentos nas regiões ventral e lateral da gástrula do peixe-zebra e sua transparência durante os estágios larvais permitem a observação simples do processo de pigmentação, proporcionando uma oportunidade para desenvolver modelos viáveis ​​para a compreensão de distúrbios celulares da pele resultantes de defeitos no desenvolvimento dos melanócitos [22– 24].

A síntese de melanina ocorre por meio da atividade de várias proteínas relacionadas à melanogênese, como tirosinase, fator de transcrição associado à microftalmia (MITF), proteína relacionada à tirosinase-1 (Trp-2) e proteína relacionada à tirosinase{ {6}} (Viagem-1) [15]. Neste estudo, objetivamos investigar o efeito inibitório do extrato bruto IPA e IO (IOE) na atividade da tirosinase e na melanogênese em células de peixe-zebra induzidas por -MSH in vivo e células de melanoma B16F10 in vitro para avaliar seu uso potencial no tratamento de pigmentação da pele e melanoma .

2. Resultados

2.1. Estudo de Docking Molecular

Um método de docking foi realizado para simular a ligação da enzima tirosinase comercial com IPA, DPHC e arbutina [25]. Os modos de ligação de IPA, DPHC ou arbutina com tirosinase de cogumelo são apresentados na Figura 1A–C. Conforme mostrado no diagrama 3D do complexo tirosinase-IPA (Figura 1A), tirosinase-DPHC (Figura 1B) e tirosinase-arbutina (Figura 1C), embora IPA, DPHC e arbutina se encaixem no local ativo, a tirosinase- O complexo IPA apresentou a maior área de superfície de ligação. Além disso, como mostrado em um diagrama 2D, o complexo tirosinase-IPA mostrou mais interações com os vários aminoácidos da tirosinase, em comparação com tirosinase-DPHC ou tirosinase-arbutina. Sete anéis de benzeno (1º, 2º, 3º, 8º, 9º, 12º e 16º) e seus átomos de oxigênio têm interações π–π com Histidina60, Metionina61, Lisina157, Glutamato158, Prolina160, Prolina201, Arginina206 e Valina218 . Em particular, o 16º anel benzênico foi combinado com Histidina60 e Histidina204, os principais aminoácidos do sítio ativo. Além disso, muitos átomos de oxigênio no IPA interagiram por meio de pontes de hidrogênio com Glutamate158, Proline160, Aspartate167, Metionina184, Fenilalanina197, Asparagina199, Glutamina202, Asparagina205 e Arginina209. Além disso, com base nos resultados da análise de encaixe, foi calculado que a energia de ligação total e a energia de interação CDOCKER usando o programa de energia de interação CDOCKER do DS 3.0 (Figura 1D) foram as seguintes: energia de interação com tirosinase: Ishophloroglucin A (IPA): - 152,154 kcal/mol, diphlorethohydroxycarmalol (DPHC): −65,5221 kcal/mol e arbutin: −33,6835 kcal/mol e a energia de ligação com a tirosinase: Ishophloroglucin A (IPA): −546,504 kcal/mol, diphlorethohydroxycarmalol (DPHC): −407,706 kcal /mol e arbutina: −79,0913 kcal/mol.

2.2. Efeitos de Inibidores Melanogênicos na Síntese de Melanina em Larvas de Zebrafish

O objetivo deste estudo foi determinar se IPA e IOE podem inibir a melanogênese em larvas de zebrafish in vivo. Em nosso estudo anterior, IPA e IOE não mostraram toxicidade em larvas de zebrafish [26]. Tratamos larvas de peixe-zebra com peixe-zebra (0.05, 0.15 e 0.5 nM) e IOE (3, 10 e 30 µg/mL ) para determinar seu conteúdo de melanina. Para estimar as atividades inibitórias, medimos o conteúdo total de melanina dos extratos de zebrafish. O efeito fenotípico na melanina do peixe-zebra foi observado analisando a pigmentação do corpo sob um microscópio à temperatura ambiente. A melanina da superfície foi significativamente reduzida por várias concentrações dos inibidores alvo (Figura 2). O tratamento com 3 nM -MSH aumentou significativamente o teor de melanina do peixe-zebra em comparação com o grupo não tratado. As maiores concentrações de IPA (0,5 nM) e IOE (30 µg/mL) diminuíram o conteúdo total de melanina em quase 28,56 por cento e 30,36 por cento, respectivamente, que apresentaram efeitos semelhantes aos do grupo tratado com arbutina (200 µM) (Figura 2A, B).

2.3. Efeitos de IPA e IOE na síntese de melanina em células B16F10

Os efeitos citotóxicos de IPA e IOE em células B16F10 foram medidos por meio do MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,{{ 7}}brometo de difeniltetrazólio). Inicialmente examinamos os efeitos citotóxicos de IPA e IOE em células B16F10 tratadas com diferentes concentrações sem estimulação -MSH. IPA (0,15, 0,5, 1,5 e 5 nM) não revelou nenhuma citotoxicidade significativa em células B16F10, enquanto IOE (1, 3, 10 e 30 µg/mL) não apresentou citotoxicidade (Figura 3A, B). As concentrações de IPA e IOE sem toxicidade foram usadas para estudo posterior.

Examinamos se o efeito da inibição da melanina do tratamento com IPA ou IOE in vivo era reversível sem estimulação de -MSH em células B16F10. O conteúdo de melanina diminuiu significativamente após o tratamento com IPA (5 nM) ou IOE (30 µg/mL) em comparação com o grupo controle (Figura 3C, D). Esses resultados sugeriram que IPA e IOE inibiram a síntese de melanina sem estimulação de -MSH em células B16F10, contribuindo assim para seu efeito anti-melanogênese.

2.4. Efeitos de IPA e IOE na atividade da tirosinase e síntese de melanina em células B16F10 estimuladas por -MSH

Portanto, doses de IPA (0.5, 1,5 e 5 nM) e IOE (3, 10 e 30 µg/mL) foram incubadas com células de melanoma B16F10 para determinar sua bioatividade na atividade da tirosinase celular e -MSH melanogênese mediada.

As concentrações de -MSH e arbutina foram determinadas com base nos resultados de sua citotoxicidade e produção de melanina em células B16F10 (Figura S2A-D). Ao analisar os dados sobre a taxa de sobrevivência, 1 nM de -MSH e 100 µM de arbutina foram usados ​​para experimentos adicionais.

Quanto à atividade da tirosinase celular, embora os efeitos inibitórios de 1,5 nM de IPA tenham sido relativamente menores do que os descritos no controle positivo, a concentração diferiu quase 10 vezes, com a maior concentração de arbutina em 100 µM (Figura 4A). IOE reduziu a atividade da tirosinase com uma ligeira flutuação entre os efeitos de diferentes concentrações em comparação com o grupo tratado com -MSH (Figura 4B). Quanto à melanogênese mediada por -MSH, reduções significativas no conteúdo de melanina foram observadas nos grupos tratados com 1,5 e 5 nM de IPA (Figura 4C). Além disso, 30 µg/mL de IOE inibiu a pigmentação a ponto de se assemelhar ao grupo em branco (Figura 4D). Esses resultados sugerem que IPA e IOE diminuíram a atividade da tirosinase e que esse efeito inibitório pode levar à diminuição da síntese de melanina celular em células B16F10.

2.5. Efeitos de IPA e IOE no Mecanismo Molecular em Células B16F10 Estimuladas por -MSH

Para elucidar o mecanismo responsável por seu efeito inibitório da melanogênese, determinamos a influência do IPA e do IOE nos níveis de expressão de moléculas sinalizadoras envolvidas na síntese de melanina (Figura 5). ERK (quinase regulada por sinal extracelular), JNK (quinase N-terminal Jun) e p38 pertencem à cascata de transdução de sinal intracelular da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) [27,28]. Conforme apresentado na Figura 5A, B, a fosforilação de ERK foi aumentada com tratamento com IPA, enquanto a fosforilação de JNK foi ligeiramente diminuída após tratamento com IPA (1,5 e 5 nM) ou IOE (30 µg/mL). Além disso, conforme apresentado na Figura 5C, os níveis de p-p38 foram altamente aumentados nos grupos estimulados por -MSH, em cerca de 80 por cento em comparação com o controle. Além disso, após tratamento com IPA, IOE ou arbutina, a fosforilação de p38 foi ligeiramente suprimida. Esses achados sugerem que os efeitos inibitórios melanogênicos de IPA e IOE podem estar relacionados às vias de sinalização JNK e p38 MAPK.

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