Nanozimas que imitam catalase com detecção de inflamação aliviam lesões renais agudas por meio da reversão do estresse oxidativo local

Resumo

Antecedentes: Oespécies reativas de oxigênio (ROS)e sabe-se que a inflamação, um contribuinte crítico para danos nos tecidos, está associada a várias doenças. O rim é suscetível à hipóxia e vulnerável às ERO. Assim, o ciclo vicioso entreestresse oxidativoe renala hipóxia contribui criticamentepara a progressão dedoença renal crônicae finalmente,doença renal terminal. Assim, a entrega de agentes terapêuticos ao local de inflamação rico em ROS e a liberação dos agentes terapêuticos é uma solução viável.

Novas ervas para doenças renais

Resultados: Desenvolvemos uma nanoplataforma versátil, com detecção de inflamação e eliminação de ROS, de circulação mais longa, carregando de forma estável 1-Mn3O4 estabilizado com dodecanotiol (dMn) que imita catalase.3O4) nanopartículas dentro de nanopartículas sensíveis a ROScélulas (PTC), resultando em uma nanozima sensível a ROS (PTC-M). dMn hidrofóbico3O4nanopartículas foram carregadas dentroMicelas de PTC para prevenir a liberação prematura durante a circulação e atuar como um agente terapêutico por ROS-responsivosliberação de dMn carregado3O4assim que chegou ao local da infamação.

Palavras-chave:Nanopartículas Mn3O4, Nanozimas, Inflamação,Isquemia-reperfusão, Rim

Fundo

Acute kidney injury (AKI) is the term that covers a broad spectrum of renal function deterioration ranging from small changes in serum creatinine level to conditions requiring renal replacement therapy [1]. The KDIGO (Kidney disease: improving global outcomes) guidelines define AKI as an increase in serum creatinine of either>0.3  mg/dL within 48  h,>1,5 vezes em relação ao valor basal em sete dias ou uma redução no volume de urina de<0.5 ml/kg/hour for six hours [1]. AKI is one of the rising global health problems that cause high morbidity and mortality and economic burden [2]. The incidence of AKI defined by the KDIGO guidelines was 21.6% in adults in in-hospital settings [3]. AKI may lead to several complications, including metabolic acidosis, hyperkalemia, uremia, volume overload, and damage to other organ systems, including death. Despite advances in medicine, mortality from AKI is still high. According to a meta-analysis of studies in in-hospital settings, AKI-associated mortality was reported to be 23.9% in adults [3]. The mortality rate of dialysis-requiring AKI patients exceeds 50% [4]. AKI increases the long-term risk of subsequent AKI, progressive chronic kidney disease (CKD), and end-stage renal disease (ESRD) [5]. Eventually, AKI increases socioeconomic and healthcare burdens. Nevertheless, there is no clear treatment for AKI to date. When AKI occurs, conservative treatments such as removing the causative factors, controlling water and electrolyte imbalances, performing renal replacement therapy, if necessary, and waiting for renal function to recover are applied.

Lesão de isquemia-reperfusão (IRI)é uma lesão orgânica causada pela redução transitória ou cessação do fluxo sanguíneo, seguida de reperfusão, e pode ser encontrada em diversas situações clínicas, como choque, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral isquêmico, cirurgia de grande porte e transplante de órgãos. A IRI renal é uma das principais causas de LRA, o que resulta em um rápido declínio da função renal. O rim é um órgão que é particularmente suscetível a insultos isquêmicos e células epiteliais tubulares lesionadas causam, sequencialmente, excreção prejudicada de produtos residuais e controle do equilíbrio de água, eletrólitos e ácido-base [6]. Sabe-se que o mecanismo de lesão das células tubulares renais na IRI envolve inflamação causada por espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas durante a reperfusão [6–8]. Portanto, tem havido tentativas de aplicar a eliminação de ROS ao tratamento da IRI. No entanto, seu uso clínico real tem sido limitado devido a preocupações com efeitos colaterais sistêmicos, que incluem reações de hipersensibilidade [9]. A administração de antioxidantes como a edaravona já foi utilizada para eliminar ERO na IRI. No entanto, foi acompanhado por vários efeitos colaterais e, portanto, foram feitas demandas por antioxidantes novos e eficazes, como nanozimas (nanomateriais que exibem atividade natural semelhante a uma enzima) [9–13]. Yao et al. descobriram que as partículas nan de Mn3O4 possuíam múltiplas atividades que imitam enzimas, ou seja, atividades que imitam superóxido dismutase e catalase, bem como atividade de eliminação de radicais hidroxila [11]. Foi demonstrado que Mn3O4 possuía uma capacidade de eliminação de ROS mais forte do que outras enzimas, como V2O5, CeO2, Co3O4, MnFe2O4 e Fe3O4 e era melhor que outros tipos de óxido de manganês (MnOx (MnO2, MnO e Mn2O3).

Fig. 1 Ilustração esquemática mostrando a preparação e modo de ação do PTC-M A Síntese do PTC-M, B Mecanismo de ação do PTC-M (1) injeção intravenosa de PTC-M (2) o PTC-M injetado circula no sangue e acumula no local da inflamação (3) a desestabilização do PTC-M devido às ROS intrínsecas presentes no local da inflamação (4) liberação do dMn 3O4 carregado no local da inflamação (5) o dMn3O4 liberado catalisa a eliminação de ROS levando a (6) redução da inflamação, apoptose e fibrose (7) alívio de danos renais e (8) melhoria das funções renais

Resultados

Síntese e caracterização de nanopartículas de dMn3O4 e conjugados poliméricos

Os NPs dMn3O4 foram sintetizados usando o método de coprecipitação e estabilizados usando grupos tiol de 1-dodecanotiol (Fig. 2A). A análise de microscopia eletrônica de transmissão de emissão de campo (FE-TEM) demonstrou que os NPs dMn3O4 tinham um tamanho médio inferior a 2{{10}} nm (18,0±0,6 nm) (Fig. 2B ). Arquivo adicional 1: As figuras S1A e S1B mostram as imagens e a representação esquemática do dMn3O4 preparado. Os dados de espectroscopia de energia dispersiva de raios X (EDS) mostraram a presença de Mn de Mn3O4 e enxofre e carbono de SH-C12 (Fig. 2C e arquivo adicional 1: Figura S1C). Os resultados da análise de espectroscopia de fótons de raios X (XPS) retrataram o espectro XPS de Mn 2p, que consistia em dois picos localizados em 641,42 eV e 653,23 eV e esses picos foram atribuídos a Mn 2p3/2 e Mn 2p1/2, respectivamente (Fig. .2D e arquivo adicional 1: Figura S2). A diferença de energia entre esses dois picos foi de 11,81 eV, o que está de acordo com a literatura relatada para Mn3O4. No padrão de difração de raios X (XRD) dos NPs dMn3O4, como mostrado na Fig. 2E, todos os picos de difração medidos combinaram bem com o padrão padrão de hausmanita Mn3O4 [ICDD: #001–1127], confirmando sua alta cristalinidade natureza. O conjugado de PTC responsivo a ROS foi preparado através de reações químicas passo a passo, onde o ligante tiocetal (TK) com um grupo carboxilato terminal foi dimensionado primeiro. O grupo carboxílico do ligante TK foi então conjugado ao grupo amino da metoxi-PEG amina (PEG-AM) usando a reação EDC/NHS para formar PEG-TK. Finalmente, o outro grupo carboxílico do PEG-TK foi conjugado novamente ao grupo amino da estearamina através da reação EDC/NHS [15]. O conjugado de PC não responsivo a ROS foi preparado conjugando ácido esteárico com PEG-AM. A composição de PTC e PC foi analisada por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1 H (arquivo adicional 1: Figura S3). Os espectros de RMN mostraram picos característicos em δ 0,83 e 1,23 ppm correspondendo aos prótons metila e metileno de C18. O pico em δ 3,6 correspondeu a O – CH2 – CH 2- do PEG. O grau de substituição (DS%) de C18 em PTC e PC foi calculado como 78% e 46%, respectivamente

Preparação e caracterização da enzima PTC‑M

As nanomicelas sensíveis a ROS (PTC) foram carregadas com dMn3O4, resultando em PTC-M. A proporção de alimentação dMn3O4 (20%) de PTC foi utilizada para a preparação de PTC-M. O diâmetro hidrodinâmico, o potencial zeta e as imagens FE-TEM do PTC e PTC-M preparados são mostrados na Fig. 3A e no arquivo adicional 1: Figura S4A. As imagens FE-TEM do PTC demonstraram nano micelas esféricas com tamanhos de partículas uniformes. O diâmetro hidrodinâmico do PTC-M aumentou ligeiramente após o carregamento de dMn3O4 devido ao empacotamento de dMn3O4 no espaço hidrofóbico, enquanto o potencial zeta permaneceu negativo em ambas as nano micelas devido à blindagem de PEG. As imagens FE-TEM de PTC e PTC-M mostraram partículas uniformemente distribuídas. O conteúdo de carga e a eficiência de encapsulamento foram calculados utilizando análise espectrométrica de massa e foram calculados em 10±3% e 17±6%, respectivamente. A presença de dMn3O4 foi visível nas imagens FE-TEM do PTC-M (Fig. 3A), que foi posteriormente confirmada pela análise EDS do PTC-M, mostrando Mn de Mn3O4, enxofre e carbono de SH-C12, e carbono , nitrogênio e oxigênio do PEG (arquivo adicional 1: Figura S5). A análise termogravimétrica (TGA) foi realizada e a carga de dMn3O4 foi calculada em 12% (arquivo adicional 1: Figura S6B). Micelas não sensíveis a ROS carregadas com dMn3O4 (PC-M) também foram preparadas como controles pelo mesmo método.

Para confirmar o papel da ligação TK na desestabilização responsiva a ROS de PTC-M e na liberação de dMn3O4, o PTC-M foi exposto a condições de ROS adicionando H2O2. Como controles, utilizamos o PC-M não sensível a ROS. Tanto o PTC-M quanto o PC-M exibiram uma morfologia esférica com dMn3O4 firmemente compactado nas nano micelas, mas após o tratamento com H2O2, a supramontagem do PTC-M foi distorcida, seguida pela liberação de dMn3O4, que foi então agregados como mostrado nas imagens FE-TEM, enquanto o PC-M apresentou estruturas estáveis ​​mesmo após exposição ao H2O2 (Fig. 3B e arquivo adicional 1: Figura S4B). A suscetibilidade ROS do PTC-M foi ainda confirmada comparando as alterações no diâmetro hidrodinâmico e no potencial zeta com o PC-M, conforme mostrado no arquivo adicional 1: Figura S7. O diâmetro hidrodinâmico e o potencial zeta do PC-M não sensível a ROS não mostraram diferença discernível após a adição de H2O2. Porém, o PTC-M sensível a ROS apresentou tamanhos hidrodinâmicos reduzidos, provavelmente devido à remoção da blindagem de PEG via quebra de TK, resultando na desestabilização da estrutura. Após a adição de H2O2, o potencial zeta reverteu de uma carga negativa para uma carga positiva, o que pode ser devido à remoção do PEG e à exposição ao vapor. Estudamos ainda a variação de tamanho verificando a estabilidade ao longo do tempo, rastreando os diâmetros hidrodinâmicos na presença ou ausência de H2O2 (Fig. 3C). Após a adição de H2O2, os diâmetros hidrodinâmicos diminuíram significativamente em 10 s, sem alterações adicionais com o tempo de até seis dias, enquanto o PTC-M sozinho apresentou tamanhos estáveis ​​durante o experimento, sugerindo a boa estabilidade coloidal do PTC-M. Também verificamos a estabilidade em 10% de FBS e observamos que o PTC-M apresentou boa estabilidade por até 4 dias (arquivo adicional 1: Figura S9). Os diâmetros hidroxidinâmicos e a variação do potencial zeta também foram confirmados com nano micelas vazias sensíveis e não sensíveis a ROS (PTC e PC) (arquivo adicional 1: Figura S8). Todos estes estudos comparativos na presença ou ausência de ERO demonstraram a estabilidade e a sensibilidade a ERO dos nanomoles preparados ou da enzima dMn3O4 PTC-M final.

Fig. 2 Síntese e caracterização de dMn3O4 Uma ilustração esquemática da síntese de dMn 3O4, imagens B FE-TEM, análise C EDS, espectro D XPS e padrões E XRD de NPs dMn3O4

Verificamos ainda a propriedade de eliminação de H2O2 da enzima PTC-M final devido ao carregamento de dMn3O4 NP. Isso foi testado usando ácido tereftálico (TA) como sonda de centavos futuros. TA reagiu com H2O2 para formar ácido 2-hidroxitere ftálico com pico fluorescente em 425 nm. dMn3O4 irá converter H2O2 em água e oxigênio e, portanto, a intensidade fluorescente diminui, confirmando a atividade da catalase, como mostrado na Fig. O PTC-M apresentou uma forte redução na intensidade de fluorescência em comparação com a micela vazia PTC na presença de H2O2 ao longo do tempo. A atividade semelhante à catalase do PTC-M também foi dependente da concentração, como mostrado no arquivo adicional 1: Figura S10. A capacidade de produção de oxigênio do PTC-M foi posteriormente confirmada usando uma sonda fluorescente específica de O2- Ru (DDP) na presença de H2O2. A fluorescência em dez cidades de Ru(DDP)diminui na presença de O2, sugerindo a produção eficiente de O2. 3E, a intensidade de fluorescência de Ru (DDP) diminuiu na presença de H2O2 no grupo PTC-M, enquanto a presença de H2O2 no grupo PTC sozinho mostrou pouca diminuição na fluorescência (Fig. 3F), confirmando a atividade da catalase resultando na produção de oxigênio no PTC-M. Finalmente, confirmamos a propriedade de eliminação de H2O2 do PTC-M usando um medidor de detecção de oxigênio. Como mostrado na Figura 3G, a produção de oxigênio pelo PTC-M aumentou no tempo inicial, seguida por um aumento lento, enquanto as micelas vazias PTC não apresentaram produção de oxigênio. A desproporção de H2O2 foi observada pela formação de bolhas de oxigênio no grupo PTC-M conforme mostrado no arquivo adicional 1: Figura S11A. Observou-se também que o PTC-M apresentou maior produção de oxigênio em comparação ao dMn3O4 sozinho, provavelmente devido ao empacotamento próximo do dMn3O4 no PTC-M, tornando-o mais disponível para a reação em comparação ao dMn3O4 livre (Arquivo adicional 1: Figura S11B). Mesmo que as nano micelas tenham se soltado devido ao tratamento com H2O2, como mostrado no FE-TEM, o dMn3O4 ainda pode estar presente dentro do PTC-M, resultando em alta atividade de catalase em comparação com o dMn3O4 livre. Todos estes resultados juntos confirmaram a atividade superior de mimetização da catalase do PTC-M.

Viabilidade celular in vitro e absorção celular

Para confirmar a captação celular e a cidade suscetível a ROS de PTC sensível a ROS distribuído intracelularmente e o padrão de liberação da carga útil, comparamos PTC com condições in vitro de PC. Primeiro, verificamos a viabilidade celular do PTC, PC, PTC-M e PC-M preparados em células HK-2 pelo ensaio WST-1 (arquivo adicional 1: Figura S12). As micelas vazias sofreram pouca morte celular, mas após o carregamento de dMn3O4-, a viabilidade celular diminuiu, mas a mudança não foi estatisticamente significativa. Como as micelas vazias não eram citotóxicas, a ligeira variação na viabilidade celular poderia ser devida ao dMn3O4 adsorvido na superfície. O valor IC50 de PTC-M e PC-M foi determinado como sendo 130,41 e 247,17 ug/ml, respectivamente (Fig. 4A). Para examinar melhor a captação e distribuição intracelular das nano micelas, o IR780 foi usado como droga modelo e preparou nanomicélulas PTC carregadas com IR780, PTC-IR780 para visualizar a intensidade de fluorescência do IR780 usando microscopia de presença divertida (Evos FL Auto 2, Thermo Fisher Scientific , EUA) (Fig. 4B). Como grupo controle, também analisamos a captação de PC-IR780 não sensível a ROS. Comparado ao PC-IR780, o PTC-IR780 apresentou maior captação em células HK-2 (arquivo adicional 1: Figura S13). A razão exata por trás da maior absorção de PTC-IR780 em condições não-ROS não é clara, no entanto, pode ser porque o PTC pode mostrar uma ligeira sensibilidade ao nível normal de ROS em condições de cultura celular, levando à desproteção de PEG deixando a superfície carga ligeiramente positiva. O PC-IR780 mostrou um padrão de captação semelhante, independentemente das ERO induzidas pelo tratamento com H2O2 ou das condições de ERO induzidas por hipóxia devido à natureza não sensível, enquanto o PTC-IR780 mostrou um padrão de distribuição diferente dentro das células, o que pode ser devido à liberação aprimorada de IR780 dentro das células. Os dados anteriores de viabilidade celular (arquivo adicional 1: Figura S11) mostrando aumento da morte celular em PTC-M também seriam devido à maior captação celular de PTC em comparação com PC. O iodeto IR780 é um corante altamente hidrofóbico que pode apresentar alta afinidade para com a membrana celular e mostra um sinal muito brilhante, independentemente da exposição a ROS. A captação celular foi ainda analisada verificando a intensidade média de fluorescência (MFI) por análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) (Fig. 4C), que apoiou os dados obtidos por microscopia de fluorescência. Como mostrado, o MFI foi mais alto no grupo PTC IR780 sensível a ROS em comparação com os outros grupos, confirmando a liberação aumentada de IR780 nas células. Quan ainda amarrou o MFI de vários grupos (Fig. 4D) que apoiou os dados de microscopia sugerindo que o PC-IR780 não exibiu nenhuma diferença significativa na captação celular mesmo sob condições induzidas por ROS, enquanto o PTC IR780 mostrou um aumento significativo na captação celular absorção quando tratado sob condições induzidas por ROS. A captação celular de PTC também foi determinada verificando o Mn residual nas células após tratamento com PTC-M. Como mostrado na Figura 4E, o PTC-M mostrou uma captação dependente da concentração nas células HK-2. Estes resultados resumem, assim, a internalização aprimorada de nano micelas e a liberação acelerada dentro das células, provavelmente devido à desmontagem de nanomicelas mediada por ROS.

Conduzimos estudos in vitro em células HK-2 para explorar ainda mais os efeitos do PTC-M nas condições de estresse oxidativo em nível celular. Células HK-2 foram estimuladas com H2O2, um ROS representativo (Fig. 5A). Expressão de heme oxigenase (HO) -1 melhorada por H2O2, que foi melhorada pelo co-tratamento com PTC-M (Fig. 5A). O ensaio de diacetato de 2 ', 7'-diclorodihidrofuoresceína (DCF DA) foi realizado para verificar o padrão de alteração intracelular de ERO. As células HK -2 estimuladas por H2O2 apresentaram alta intensidade de fluorescência, mas após co-tratamento com PTC-M, a intensidade de fluorescência diminuiu (Fig. 5B). A relação BAX/BCL-2 foi aumentada pelo tratamento com H2O2, que também foi recuperada pelo co-tratamento com PTC-M, indicando proteção contra apoptose (Fig. 5C). As células HK -2 tratadas com H2O2 exibiram um aumento progressivo significativo na coloração com anexina V + / PI−, que foi evitada pelo PTC-M (Fig. 5D). A fosforilação de ERK, JNK e p38 induzida por H2O também foi suprimida pelo co-tratamento com PTC-M, embora não tenha sido observada uma redução significativa no P38 fosforilado (Fig. 5C). Estes dados sugerem que o PTC-M suprimiu os processos apoptóticos induzidos por ERO nas células epiteliais tubulares renais.